Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo

O objetivo geral deste procedimento é avaliar de forma abrangente a toxicidade química na linha germinativa utilizando o nematódeo C No Haitis elgan. Isso é realizado primeiramente sincronizando os vermes por meio da adição de uma solução diluída de hipoclorito a uma população mista de estágios do verme da linhagem C Elgan PXOL one GFP. Este passo gera um grande número de embriões protegidos do hipoclorito por suas cascas de ovo.

O segundo passo é gerar uma população sincronizada de larvas L1 fazendo os embriões eclodirem em líquido sem alimento. Em seguida, os vermes crescem até o quarto estágio larval, ou L4, momento em que são expostos aos compostos de interesse em meio líquido por 65 horas. O passo final é a visualização, por microscopia de fluorescência, da expressão dos marcadores GFP em embriões no interior do útero dos vermes.

Por fim, a proporção de embriões positivos para GFP em comparação com o controle DMSO reflete a antigenicidade dos compostos testados. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como modelos Rodin ou ensaios em cultura celular, é que podemos avaliar a genotoxicidade e a toxicidade germinativa de produtos químicos em um modelo de animal inteiro, ao mesmo tempo em que realizamos um ensaio de alto rendimento durante a execução do procedimento. Hoje será a pesquisadora pós-doutoranda Dra. Daniella Perotti.

Os vermes gráficos para este procedimento foram previamente preparados conforme descrito no texto do protocolo associado; colete os vermes GR do meio de crescimento de nematoides ou placas NGM lavando-os com um a dois mililitros de M nove e transferindo-os para um tubo cônico de 15 mililitros. Deixe os vermes GR sedimentarem no fundo do tubo cônico de 15 mililitros por aproximadamente cinco a 10 minutos. Em seguida, remova o sobrenadante sem perturbar o pellet de vermes.

Transfira o pellet de vermes para dois a quatro tubos de microcentrífuga e adicione um mililitro de solução de hipoclorito diluída a cada tubo. Incube por dois a três minutos à temperatura ambiente. Monitore o progresso da reação ao microscópio estereoscópico para confirmar que todos os vermes estão mortos.

Não deixe em alvejante por mais de cinco minutos, pois os embriões podem morrer. Colete os vermes por centrifugação durante um minuto. A 3000 RPM.

Remova o sobrenadante e adicione um mililitro de M nove estéril para neutralizar a reação. Certifique-se de que todos os materiais que entram em contato com os vermes após o tratamento com hipoclorito sejam estéreis. Lave os vermes duas vezes com meio M nove.

Remova o sobrenadante e adicione M nove a 100 a 200 microlitros. Usando uma pipeta de vidro Pasteur, adicione uma gota da mistura de M nove com vermes a placas NGM claras e incube-as por pelo menos 24 horas a 20 graus Celsius para permitir que os embriões eclodam sem alimento. O crescimento das larvas será interrompido na fase L um. Dois passos de sincronização.

A branqueamento e a privação de alimento L são utilizados porque é fundamental obter uma população altamente sincronizada em fase de crescimento para maximizar o número de larvas L4 que serão utilizadas na exposição. Um dia após o estabelecimento de uma população sincronizada de larvas L1, colete as larvas L1 das placas NGM claras. Lave as placas com um a dois mililitros de M9 e transfira as larvas L1 para um tubo cônico de 15 mililitros.

Deixe os vermes adultos mortos sedimentarem no fundo do tubo cônico de 15 mililitros por aproximadamente cinco minutos. Colete o sobrenadante, onde estão os vermes L1, em um novo tubo cônico de 15 mililitros. Precipite os vermes por centrifugação durante dois minutos a 2.600 RPM.

Remova o sobrenadante, deixando aproximadamente 500 microlitros. Determine a concentração de vermes na solução M nove contando o número de vermes em gotas de 10 microlitros. Usando um microscópio estereoscópico, conte pelo menos cinco gotas.

Ajuste a concentração dos vermes para 20 a 25 vermes por microlitro em M nove e, em seguida, adicione 50 microlitros da mistura de vermes em M nove a placas NGM. Semeadas com OP50, bactérias alimentares, incube por 65 horas a 15 graus Celsius para permitir que a população sincronizada em L1 cresça até atingir o estágio L4. Esta análise utiliza uma linhagem CL com um repórter fluorescente transcricional para detectar a desorganização da linhagem germinativa e a indução de aneuploidia embrionária.

Colete as larvas L4 das placas NGM claras lavando as placas com um a dois mililitros de M9 e transferindo-as para um tubo cônico de 15 mililitros. Deixe as larvas L4 sedimentarem no fundo do tubo cônico de 15 mililitros por aproximadamente cinco a 10 minutos. Em seguida, remova o sobrenadante sem perturbar o pellet de vermes.

Adicione três a cinco mililitros de M nove e determine a concentração de vermes na solução de M nove contando o número de vermes em gotas de 10 microlitros. Usando um microscópio estereoscópico, conte pelo menos cinco gotas para cada amostra. Resuspenda os vermes em uma concentração de um verme por mililitro em M nove.

Dilua as bactérias OP 50 previamente preparadas dez vezes com M nine. Certifique-se de que as bactérias re-suspensas atinjam a temperatura ambiente, pois temperaturas mais baixas afetam o desenvolvimento dos vermes. Usando uma pipeta multicanal, adicione primeiro 100 microlitros da mistura de vermes em M nine a cada poço de uma placa de 96 poços com fundo redondo profundo de dois mililitros. Em seguida, adicione 400 microlitros das bactérias OP 50 diluídas a cada poço ao final.

Cada poço conterá 100 vermes em 500 microlitros. Adicione 0,5 microlitro do composto-teste aos poços desejados para obter uma concentração final de 100 micromolar. Uma concentração comumente utilizada em triagens químicas em CL elgan expõe controles do solvente etanol ou DMSO em uma concentração final de 0,1% como controle positivo.

Utilize 100 micromolar sem cosolvente. Selle a placa usando filme adesivo. Certifique-se de selar bem a placa para evitar contaminação cruzada entre os poços.

Envolva a placa com papel alumínio. Transfira a placa para um agitador na temperatura apropriada por um tempo adequado. Mantenha a temperatura do ambiente em torno de 20 graus Celsius, pois a temperatura afeta o crescimento dos vermes ao final da exposição química no agitador.

Deixe as placas de 96 poços em repouso por 10 a 15 minutos para permitir que os vermes adultos sedimentem no fundo da placa usando uma pipeta multicanal. Remova 350 microlitros do M nove de cada poço, tomando cuidado para não perturbar os vermes no fundo da placa. Lave os vermes com um mililitro de M nove e deixe a placa em repouso novamente por 10 a 15 minutos para permitir que os vermes adultos sedimentem no fundo.

Remova um mililitro do M nove de cada poço, tomando muito cuidado para não perturbar os vermes no fundo da placa. Resuspenda os vermes no M nove restante. Colete 100 microlitros da mistura de vermes em M nove da placa de 96 poços e transfira para os poços de uma placa de 384 poços com paredes pretas e fundo transparente.

Repita o processo usando vermes de 4 placas de 96 poços até que todos os poços da placa de 384 poços tenham sido carregados. É importante que todos os poços tenham o mesmo volume para aumentar a eficiência e a velocidade do foco automático durante o processo de aquisição de imagens. Em seguida, adicione um microlitro de lale a cada poço e deixe os vermes incubarem por aproximadamente 30 minutos.

Lale atua como um agonista do receptor de acetilcolina e imobiliza os vermes; transfira a placa para um microscópio de campo amplo de alto conteúdo capaz de fornecer imagens automatizadas. Utilize um software de aquisição e análise de imagens de alto conteúdo de acordo com as orientações do fabricante. Selecione a objetiva de quatro vezes para adquirir uma imagem por.

Ajuste os parâmetros de imagem GFP para uma exposição de 45 milissegundos e resolução de imagem de 2160 por 2160. Inicie a aquisição de imagens: os vermes expostos são diretamente imageados em placas de 384 poços. O número de vermes contendo pelo menos um embrião positivo para GFP é contado para cada poço e normalizado pelo número total de vermes naquele poço, conforme mostrado aqui.

A exposição a agentes químicos, como o veneno de microtúbulos no-code AOL, leva à indução de uma alta proporção de embriões que expressam GFP em comparação com o controle de DMSO. Os embriões positivos para GFP são significativamente mais brilhantes do que a fluorescência de fundo fraca observada em outros embriões, bem como a autofluorescência observada no intestino dos animais. A seta vermelha indica embriões positivos para GFP claramente visíveis dentro do útero de um verme tratado com no-code AOL.

Após este procedimento, outros métodos podem ser realizados, como a coloração de DNA dos vermes, a fim de obter uma análise mais detalhada do efeito dos produtos químicos na linhagem germinativa. Esta técnica permite aos pesquisadores da área de toxicologia avaliar rapidamente a toxicidade reprodutiva e a toxicidade da linhagem germinativa de substâncias químicas.