Name: Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo Caenorhabditis elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Aprenda a avaliar toxicidade química na linhagem germinativa usando Caenorhabditis elegans. Este ensaio de alta vazão utiliza repórteres fluorescentes para detectar aneuploidia embrionária após exposição a compostos.

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Os autores gostariam de agradecer às seguintes fontes de financiamento NIH ES020353 e ao prêmio Colgate-Palmolive Alternative Research Grant por tornar este trabalho possível.

1. Preparação da alimentação Bactérias NOTA: Esta seção descreve a preparação de bactérias alimentam (E. coli OP50). <ol><li> Isolar uma única colônia de E. coli estirpe OP50 a partir de um caldo de lisogenia (LB) e agar de placa inocular assepticamente em 300 ml de caldo LB autoclavado. </li><li> Permitir que a cultura inoculada a crescer durante a noite num agitador a 200 rpm e 37 ° C, até que é atingida a saturação. </li><li> Transfira a OP50 em 6 estéreis, pré-pesado de 50 ml tubos cônicos. Sedimentar as bactérias por centrifugação durante 5 min a 6000 rpm (5000 xg). </li><li> Descartar o sobrenadante e lava-se as bactérias com 50 ml de M9 estéril. Repita duas vezes. </li><li> Após a segunda lavagem remover o restante M9, assegurando que nenhum M9 é deixado no tubo. </li><li> Determinar o peso do sedimento por pesagem do tubo contendo o sedimento de bactérias e subtrair o peso do tubo de 50 ml. </li><li> Ressuspender o pellet in M9 a uma concentração de 100 mg / ml. </li><li> Guardar a solução OP50 a 4 ° C até ser utilizado para a cultura sem-fim. </li></ol> 2. Preparação de crescimento de nemátodos Médias Plates (NGM) Petri NOTA: Esta seção descreve a preparação de placas NGM Petri, que são as placas onde o C. elegans vermes são rotineiramente mantidas em laboratório. <ol><li> Autoclave o meio agar NGM. </li><li> Utilizando procedimentos de esterilização, dispensar 17 ml de solução de agar NGM em seis centímetros placas de Petri utilizando uma bomba peristáltica. NOTA: uma quantidade constante de agar nas placas reduz a necessidade de reorientar o microscópio quando se muda de uma placa para outra. </li><li> Deixar as placas à temperatura ambiente durante 2-3 dias antes da utilização para deixar o agar solidificar e permitir que o excesso de humidade se evapore. </li><li> Semente as placas NGM usando uma técnica estéril. Aplicar 1-2 gotas de OP50 cultura líquida e espalhado utilizando uma vareta de vidro. Certifique-se que nãopara espalhar o relvado bactérias todo o caminho para as extremidades das placas. </li><li> Permitir que o relvado OP50 a crescer durante 1-2 dias à temperatura ambiente antes de utilizar as placas de crescer vermes. </li></ol> 3. Elaboração de um População Worm Synchronous NOTA: O ciclo de vida de C. elegans é constituída pela fase embrionária, quatro estádios larvares (L1-L4) e na idade adulta. Esta seção descreve a preparação de uma população síncrono-idade de worms. Todos os materiais que entram em contacto com C.elegans após o tratamento de branqueamento deve ser estéril. <ol><li> Dia 1 - Preparação de Gravid Worm População <ol><li> Utilizar placas NGM em que a maioria da população sem-fim consiste de larvas L1 faminto. </li><li> Colete as larvas L1 com um verme esterilizado escolher e transferi-los para novas placas de 6 cm NGM semeado com OP50. Incubar durante cerca de 65 horas a 20 ° C até que a maioria dos vermes são adultos grávidos. Paraevitar placa superlotação e permitir que os vermes de crescer sem esgotar as bactérias, não transferir mais do que um ou dois grupos de larvas L1 para cada placa NGM fresco. </li></ol></li><li> Dia 4 - Criação de um Synchronized L1 Larvas População <ol><li> Recolha os vermes grávidas a partir das placas NGM, lavando-as com 1-2 ml de M9 e transferi-los para um tubo cônico de 15 ml. </li><li> Deixe os vermes fêmeas grávidas sedimentar para o fundo do tubo de 15 ml durante aproximadamente 5-10 min. Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento verme. </li><li> Transfira o pellet worm para 2-4 microtubos e adicionar 1 ml de água sanitária / solução de NaOH. Incubar durante 2-3 minutos à temperatura ambiente. Monitorar o progresso da reação, ao microscópio estereoscópico para confirmar todos os vermes estão mortos. Não lixívia mais de 5 min como os embriões poderiam morrer. </li><li> Recolha os vermes por centrifugação por 1 min a 3.000 rpm (900 xg). Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de solução estéril para M9neutralizar a reacção. </li><li> Lave os vermes duas vezes por centrifugação durante 1 min a 3000 rpm (900 xg). </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar a M9 até 100-200 ul. </li><li> Usando uma pipeta de pasteur de vidro adicionar uma gota do verme / M9 misturar para limpar placas NGM e incubar durante pelo menos 24 horas a 20 ° C para permitir que os embriões para eclodir. NOTA: Sem comida crescimento das larvas será interrompido na fase L1. </li></ol></li><li> Dia 5 - Criação de um Synchronized L4 Larvas População <ol><li> Recolhe-se o larvas L1 a partir das placas NGM claras por lavagem das placas com 1-2 ml de M9 e transferi-los para um tubo cónico de 15 ml. </li><li> Deixe a vermes adultos mortos sedimentos para o fundo do tubo cónico de 15 mL durante aproximadamente 5 min. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante, em que os vermes são L1, em um novo tubo cónico de 15 ml, e precipitar os vermes por centrifugação durante 2 min a 2600 rpm (1000 xg). </li><li> Remover o sobrenadante leendo cerca de 500 ul. </li><li> Determinar a concentração de vermes na solução M9 pela contagem do número de vermes em 10 ul de gotas usando um estereomicroscópio. Contagem de, pelo menos, 5 gotas. </li><li> Ajustar a concentração dos vermes para vermes 20-25 / ul e adicionar 50 ul de o sem-fim / M9 mistura para placas NGM semeados com OP50. </li><li> Incubar durante 65 horas a 15 ° C (por meio de incubação a fim-de-semana) para permitir que a população sincronizada L1 a crescer até atingirem a fase de L4. </li></ol></li></ol> 4. Exposição de Worms para Chemicals em placas de 96 poços NOTA: Esta seção descreve o uso de Pxol1 :: repórter transcricional GFP contendo C. elegans estirpe para pesquisar a indução de aneuploidia. <ol><li> Recolhe-se o larvas L4 das placas NGM claras por lavagem das placas com 1-2 ml de M9 e transferi-los para um tubo cónico de 15 ml. </li><li> Deixe a L4 vermes sedimentos para o fundo doTubo de 15 ml por cerca de 5-10 min. Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento verme. </li><li> Adicionar 3-5 ml de M9 e determinar a concentração de vermes na solução M9 pela contagem do número de vermes em 10 ul de gotas usando um estereomicroscópio. Contagem de, pelo menos, 5 gotas de cada amostra. </li><li> Ressuspender os vermes, a uma concentração de 1.000 / ml em vermes M9. </li><li> Diluir as bactérias OP50 da seção 1 10 vezes com M9. Certifique-se que as bactérias em ressuspensão atingir a temperatura ambiente, porque temperatura mais baixa afeta o desenvolvimento worm. </li><li> Usando uma pipeta de canais múltiplos, primeiro adicionar 100 ul do verme / mistura M9 (a partir do passo 4.4) e, em seguida, adicionar 400 ul das OP50 bactérias diluídas (a partir do passo 4.5) em cada poço de uma 2 ml de fundo redondo profunda placa de 96 poços. No final, cada poço terá 100 vermes em 500 ul. </li><li> Adicionar 0,5 uL de quer o produto químico de teste ou de controlo apropriado para os poços desejados, para alcançar uma concentr definitiva sugeriução de 100 pM, uma concentração utilizada em telas químicos em C. elegans 12. Expor etanol ou controlos de solvente de DMSO a uma concentração final de 0,1%. NOTA: Recomendamos a utilização de nocodazole (100 M) como controle positivo. </li><li> Selar a placa usando película adesiva. Certifique-se de selar a placa bem para evitar a contaminação cruzada entre os poços. </li><li> Enrole a placa com papel alumínio. </li><li> Transferir a placa para um agitador (170-180 rpm) de uma temperatura adequada para o período de tempo adequado (24 ou 65 horas). A temperatura da sala afecta o crescimento dos vermes; manter a temperatura a cerca de 20 ° C. </li></ol> Aquisição 5. Imagem de grávidas Worms em 384 poços Placa NOTA: Esta secção descreve o uso de um elevado teor de microscópio de imagem exposto a Pxol1 :: vermes gfp, para visualizar a expressão da GFP nos embriões no útero de hermafroditas adultos. Paracada placa de 384 poços a serem rastreados, vermes de utilizar placas de 4 x 96 poços. <ol><li> Após a exposição a substâncias químicas com o agitador, deixar a placa de 96 poços repouso durante 10-15 minutos para permitir que os vermes adultos para sedimentar para o fundo da placa. </li><li> Usando uma pipeta de canais múltiplos, remover 350 ul da M9, ​​sendo muito cuidado para não perturbar os vermes na parte inferior da placa. </li><li> Lave os vermes com 1 ml de M9 e repita o passo 5.1. </li><li> Usando uma pipeta de canais múltiplos, 1 ml de remover o M9, sendo vey cuidado para não perturbar os vermes na parte inferior da placa. </li><li> Usando uma pipeta de canais múltiplos, ressuspender os vermes no restante M9 e recolher 100 uL do verme / M9 mistura a partir das placas de 96 poços e carregá-lo nas cavidades de paredes pretas de / fundo transparente placa de 384 poços. Repetir o processo de utilização de vermes das placas 4 x 96 cavidades, até que todos os poços da placa de 384 poços foram carregadas. NOTA: É importante que todos os poços, para ter o mesmo volume, a fim de aumentar aeficiência e velocidade do autofoco durante o processo de aquisição de imagem. Cada poço deverá conter entre 80 a 100 vermes. </li><li> Adicionar 1 ml de levamisol (100 uM) a cada poço e deixar os vermes incubar durante aproximadamente 30 min. NOTA: Levamisol actua como um agonista do receptor de acetilcolina e imobiliza os vermes. </li><li> Transferir a placa com um alto teor de microscópio de campo amplo capaz de fornecer imagem automatizado. </li><li> Para aquisição de imagem, use uma aquisição e análise de imagem de software alto teor de acordo com as orientações do fabricante. Selecione o objetivo 4X para adquirir uma imagem por poço. </li><li> Antes de iniciar a aquisição de imagem, ajustar os parâmetros de imagem GFP para 45 ms de exposição e resolução de imagem de 2160 x 2160. </li><li> Recolher os dados como o número de vermes positivas para GFP divididos pelo número total de vermes no poço, sendo a última medida relativamente consistente entre poços. </li></ol>

<ol><li>Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , Available from:
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<li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium-+and+high-throughput+screening+of+neurotoxicants+using+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans.</a> Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O método aqui descrito constitui a primeira estratégia de grande escala para a identificação de substâncias tóxicas da linha germinal. Ele requer o uso de um transgênico GFP Pxol-1 :: GFP contendo tensão que relata fielmente a indução de aneuploidia em embriões, que é usado como um proxy para a disfunção da linha germinativa. O método envolve a sincronização cuidadosa de um C. população sem-fim elegans e exposição dos vermes aos agentes químicos em formato de 96 poços seguido pela imagem dos v...

Há cerca de 87.000 produtos químicos registrados para o comércio nos Estados Unidos, mas apenas um pequeno número destes foram testados quanto aos efeitos potenciais sobre a saúde 1. Daqueles que foram testados, apenas uma parte foi avaliada para efeitos de saúde reprodutiva, em parte devido à dificuldade em determinar a alteração dos eventos precoces reprodutivas em mamíferos, especialmente durante o desenvolvimento de células germinativas femininas e diferenciação. Na verdade, os primeiros eventos da meiose ocorrem durante os primeiros estágios do desenvolvimento embrionário em mamíferos do sexo feminino e são, portanto, de difícil acesso e coletar em números adequados para fins de rastreio. A linha germinativa proporciona a ligação crucial entre gerações, e a sua função apropriada depende da execução precisa do programa intrincado da divisão celular e alterações cromossómicas denominado meiose. A desregulação do processo meiótico pode resultar na redução da fertilidade e da produção degametas e embriões com um número anormal de cromossomos, uma condição denominada aneuploidia. Erros de segregação cromossômica na meiose são altamente relevantes para a saúde humana. Anormalidades cromossômicas são comuns, com uma frequência de 1 em cada 150 nascidos vivos, Trissomia 21, 18 e 13, bem como X e Y erros de cromossomos, sendo os tipos mais prevalentes 2,3. Além disso, malformações congênitas, incluindo os de origem cromossômicas, são a principal causa de morte infantil em os EUA 4 A idéia de que as influências ambientais podem afetar a segregação e do comportamento cromossômico não é nova 5, mas ainda é pouco compreendida. Assim, é fundamental investigar qual dos produtos químicos introduzidos no nosso ambiente estão a interferir com a fertilidade humana, o desenvolvimento precoce e saúde reprodutiva em geral. À luz dessas limitações dos modelos de mamíferos, temos desenvolvido um ensaio de tela de alto rendimento para testar a toxicidade reprodutiva na lombriga &lt;em&gt; C. elegans. Temos mobilizou várias características importantes oferecidos por este sistema modelo genético comumente utilizadas, tais como seu pequeno tamanho, baixo custo, ciclo de reprodução curta, alta proporção de células germinativas e facilidade de manipulação 6. Os vermes podem ser cultivadas em placas de 96 poços ou em culturas líquidas de alto volume e por causa de sua transparência pode ser visualizado directamente em placas para a detecção de repórteres fluorescentes. O ensaio descrito a seguir aproveita estas características e tira vantagem de uma estirpe repórter que contém o sem-fim fluorescente Pxol-1 :: GFP para detectar perturbações da linha germinal e indução de aneuploidia embrionária. A utilização desta estirpe repórter é baseada na ocorrência rara geralmente de machos na população verme principalmente hermafroditas. Estes homens (&lt;0,2%) originam naturalmente de erro na segregação do cromossomo X 7. No entanto, como a interrupção da linha germinativa frequentemente leva a erros na segregação dos autossomose de heterochromosomes, correlaciona-se ambos com uma incidência elevada de machos do fenótipo (X missegregation), bem como a letalidade embrionária (autosome missegregation). Para detectar facilmente a indução de machos, contornando o problema da letalidade embrionária, um promotor específico do macho (Xol-1) é utilizado para conduzir a expressão da GFP em embriões precoces ainda contidos no interior do útero do sem-fim. Como tal, o aparecimento de embriões que expressam GFP é utilizado como um substituto para a presença de embriões aneuplóidicos. Este método tem sido utilizado anteriormente para identificar genes implicados na manutenção da linha germinal e meiose 8,9. Adaptado para filtragem de produtos químicos, esta estirpe é empregue numa forma de tela de alto rendimento. É importante ressaltar que a cepa relata fielmente a aneugenicity de produtos químicos e é, portanto, relevante para endpoints reprodução de mamíferos 10. O ensaio descrito aqui será particularmente útil para toxicologistas em configurações da indústria química farmacêutica e à procurapara avaliar rapidamente a toxicidade dos produtos químicos para com terminais reprodutivos. Além disso, este ensaio se alinha totalmente com as prioridades governamentais destacadas na toxicidade no st relatório 21 do século 11.

<table><tbody><tr><td>Placas de Petri ventiladas de 60 mm, de borda afiada</td><td>Tritech</td><td>T3315</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Apex</td><td>20-274</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 96 poços transparentes com fundo redondo 2 ml de polipropileno placa de poço profundo</td><td>Corning</td><td>P-DW-20-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptona</td><td>Apex</td><td>20-261</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-triptona</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-2</td><td></td></tr><tr><td>Alvejante</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio (CaCl2)</td><td>VWR</td><td>AA12316-A1</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10138225</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>IC19018680</td><td></td></tr><tr><td>E. coli (OP50)</td><td>Centro</td><td></td> <td>de Genética de Caenorhabditis<a href="http://www.cbs.umn.edu/cgc" target="_blank">http://www.cbs.umn.edu/cgc</a></td></tr><tr><td>Etanol 200 prova</td><td>VWR</td><td>EM-4455S</td> Greiner CELLSTAR 384 placas de poços <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1937-32EA</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS System</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de levamisol</td><td>Fluka</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio anidro (MgSO4)</td><td>VWR</td><td>97061-438</td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress Aquisição de imagem de alto conteúdo e Software de análise</td><td>Molecular Phosphate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>monobasic (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Películas de rayon para culturas biológicas</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>BDH0316</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td>Este microscópio tem uma forma de ampliação total de 3,35X a 300X. Qualquer microscópio com características semelhantes funcionará.</td></tr><tr><td>TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP cepa repórter</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td><a href="http://www.cbs.umn.edu/cgc" target="_blank">http://www.cbs.umn.edu/cgc</a></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Becton Dickinson</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação compreensiva de germline chemical toxicity usando o nemátodo<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

A identificação da toxicidade reprodutiva das milhares de substâncias químicas presentes em nosso ambiente tem sido um dos desafios mais tentadoras no campo da saúde ambiental. Isto é devido em parte à falta de sistemas modelo que podem (1) recapitulam precisão chaves características dos processos reprodutivos e (2) fazê-lo em um meio a high-throughput forma, sem a necessidade de um elevado número de animais vertebrados. Descrevemos aqui um ensaio no nemátodo C. elegans que permite a rápida identificação de substâncias tóxicas da linha germinal por monitorização da indução de embriões aneuplóidicos. Ao fazer uso de uma linha repórter GFP, erros na segregação cromossoma resultante da interrupção da linha germinativa são facilmente visualizados e quantificados por microscopia de fluorescência automatizada. Assim, o rastreio de um determinado conjunto de compostos para a sua toxicidade pode ser realizada num formato de placa de 96 a 384 poços numa questão de dias. Análise secundária de h positivoseu pode ser realizado para determinar se as anomalias cromossómicas originado meiótica perturbação ou de erros iniciais de segregação cromossoma embrionárias. Ao todo, este ensaio representa uma estratégia de primeira passagem rápida para a rápida avaliação da disfunção germline seguinte exposição a substâncias químicas.

Exposição do Pxol-1 :: GFP estirpe repórter de agentes químicos, tais como o veneno de microtúbulos Nocodazole (Figura 1) leva à indução de uma alta proporção de embriões que expressam GFP no útero de hermafroditas adultos expostos em comparação com controlo de DMSO. Os embriões GFP positivas são significativamente mais brilhantes do que a fraca fluorescência de fundo observada em outros embriões, assim como a auto-fluorescência observada no intestino dos animais. Vermes são expostos directamen...

Descrevemos as etapas detalhadas de um ensaio químico de alto rendimento no nematóide Caenorhabditis elegans usado para avaliar a toxicidade da linha germinativa. Neste ensaio, a interrupção da função germinativa após a exposição química é monitorada usando um repórter fluorescente específico para embriões aneuploides.

Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar de forma abrangente a toxicidade química na linha germinativa utilizando o nematódeo C No Haitis elgan. Isso é realizado primeiramente sincronizando os vermes por meio da adição de uma solução diluída de hipoclorito a uma população mista de estágios do verme da linhagem C Elgan PXOL one GFP. Este passo gera um grande número de embriões protegidos do hipoclorito por suas cascas de ovo.O segundo passo é gerar uma população sincronizada de larvas L1 fazendo os embriões eclodirem em líquido sem alimento. Em seguida, os vermes crescem até o quarto estágio larval, ou L4, momento em que são expostos aos compostos de interesse em meio líquido por 65 horas. O passo final é a visualização, por microscopia de fluorescência, da expressão dos marcadores GFP em embriões no interior do útero dos vermes.Por fim, a proporção de embriões positivos para GFP em comparação com o controle DMSO reflete a antigenicidade dos compostos testados. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como modelos Rodin ou ensaios em cultura celular, é que podemos avaliar a genotoxicidade e a toxicidade germinativa de produtos químicos em um modelo de animal inteiro, ao mesmo tempo em que realizamos um ensaio de alto rendimento durante a execução do procedimento. Hoje será a pesquisadora pós-doutoranda Dra. Daniella Perotti.Os vermes gráficos para este procedimento foram previamente preparados conforme descrito no texto do protocolo associado; colete os vermes GR do meio de crescimento de nematoides ou placas NGM lavando-os com um a dois mililitros de M nove e transferindo-os para um tubo cônico de 15 mililitros. Deixe os vermes GR sedimentarem no fundo do tubo cônico de 15 mililitros por aproximadamente cinco a 10 minutos. Em seguida, remova o sobrenadante sem perturbar o pellet de vermes.Transfira o pellet de vermes para dois a quatro tubos de microcentrífuga e adicione um mililitro de solução de hipoclorito diluída a cada tubo. Incube por dois a três minutos à temperatura ambiente. Monitore o progresso da reação ao microscópio estereoscópico para confirmar que todos os vermes estão mortos.Não deixe em alvejante por mais de cinco minutos, pois os embriões podem morrer. Colete os vermes por centrifugação durante um minuto. A 3000 RPM.Remova o sobrenadante e adicione um mililitro de M nove estéril para neutralizar a reação. Certifique-se de que todos os materiais que entram em contato com os vermes após o tratamento com hipoclorito sejam estéreis. Lave os vermes duas vezes com meio M nove.Remova o sobrenadante e adicione M nove a 100 a 200 microlitros. Usando uma pipeta de vidro Pasteur, adicione uma gota da mistura de M nove com vermes a placas NGM claras e incube-as por pelo menos 24 horas a 20 graus Celsius para permitir que os embriões eclodam sem alimento. O crescimento das larvas será interrompido na fase L um. Dois passos de sincronização.A branqueamento e a privação de alimento L são utilizados porque é fundamental obter uma população altamente sincronizada em fase de crescimento para maximizar o número de larvas L4 que serão utilizadas na exposição. Um dia após o estabelecimento de uma população sincronizada de larvas L1, colete as larvas L1 das placas NGM claras. Lave as placas com um a dois mililitros de M9 e transfira as larvas L1 para um tubo cônico de 15 mililitros.Deixe os vermes adultos mortos sedimentarem no fundo do tubo cônico de 15 mililitros por aproximadamente cinco minutos. Colete o sobrenadante, onde estão os vermes L1, em um novo tubo cônico de 15 mililitros. Precipite os vermes por centrifugação durante dois minutos a 2.600 RPM.Remova o sobrenadante, deixando aproximadamente 500 microlitros. Determine a concentração de vermes na solução M nove contando o número de vermes em gotas de 10 microlitros. Usando um microscópio estereoscópico, conte pelo menos cinco gotas.Ajuste a concentração dos vermes para 20 a 25 vermes por microlitro em M nove e, em seguida, adicione 50 microlitros da mistura de vermes em M nove a placas NGM. Semeadas com OP50, bactérias alimentares, incube por 65 horas a 15 graus Celsius para permitir que a população sincronizada em L1 cresça até atingir o estágio L4. Esta análise utiliza uma linhagem CL com um repórter fluorescente transcricional para detectar a desorganização da linhagem germinativa e a indução de aneuploidia embrionária.Colete as larvas L4 das placas NGM claras lavando as placas com um a dois mililitros de M9 e transferindo-as para um tubo cônico de 15 mililitros. Deixe as larvas L4 sedimentarem no fundo do tubo cônico de 15 mililitros por aproximadamente cinco a 10 minutos. Em seguida, remova o sobrenadante sem perturbar o pellet de vermes.Adicione três a cinco mililitros de M nove e determine a concentração de vermes na solução de M nove contando o número de vermes em gotas de 10 microlitros. Usando um microscópio estereoscópico, conte pelo menos cinco gotas para cada amostra. Resuspenda os vermes em uma concentração de um verme por mililitro em M nove.Dilua as bactérias OP 50 previamente preparadas dez vezes com M nine. Certifique-se de que as bactérias re-suspensas atinjam a temperatura ambiente, pois temperaturas mais baixas afetam o desenvolvimento dos vermes. Usando uma pipeta multicanal, adicione primeiro 100 microlitros da mistura de vermes em M nine a cada poço de uma placa de 96 poços com fundo redondo profundo de dois mililitros. Em seguida, adicione 400 microlitros das bactérias OP 50 diluídas a cada poço ao final.Cada poço conterá 100 vermes em 500 microlitros. Adicione 0,5 microlitro do composto-teste aos poços desejados para obter uma concentração final de 100 micromolar. Uma concentração comumente utilizada em triagens químicas em CL elgan expõe controles do solvente etanol ou DMSO em uma concentração final de 0,1% como controle positivo.Utilize 100 micromolar sem cosolvente. Selle a placa usando filme adesivo. Certifique-se de selar bem a placa para evitar contaminação cruzada entre os poços.Envolva a placa com papel alumínio. Transfira a placa para um agitador na temperatura apropriada por um tempo adequado. Mantenha a temperatura do ambiente em torno de 20 graus Celsius, pois a temperatura afeta o crescimento dos vermes ao final da exposição química no agitador.Deixe as placas de 96 poços em repouso por 10 a 15 minutos para permitir que os vermes adultos sedimentem no fundo da placa usando uma pipeta multicanal. Remova 350 microlitros do M nove de cada poço, tomando cuidado para não perturbar os vermes no fundo da placa. Lave os vermes com um mililitro de M nove e deixe a placa em repouso novamente por 10 a 15 minutos para permitir que os vermes adultos sedimentem no fundo.Remova um mililitro do M nove de cada poço, tomando muito cuidado para não perturbar os vermes no fundo da placa. Resuspenda os vermes no M nove restante. Colete 100 microlitros da mistura de vermes em M nove da placa de 96 poços e transfira para os poços de uma placa de 384 poços com paredes pretas e fundo transparente.Repita o processo usando vermes de 4 placas de 96 poços até que todos os poços da placa de 384 poços tenham sido carregados. É importante que todos os poços tenham o mesmo volume para aumentar a eficiência e a velocidade do foco automático durante o processo de aquisição de imagens. Em seguida, adicione um microlitro de lale a cada poço e deixe os vermes incubarem por aproximadamente 30 minutos.Lale atua como um agonista do receptor de acetilcolina e imobiliza os vermes; transfira a placa para um microscópio de campo amplo de alto conteúdo capaz de fornecer imagens automatizadas. Utilize um software de aquisição e análise de imagens de alto conteúdo de acordo com as orientações do fabricante. Selecione a objetiva de quatro vezes para adquirir uma imagem por.Ajuste os parâmetros de imagem GFP para uma exposição de 45 milissegundos e resolução de imagem de 2160 por 2160. Inicie a aquisição de imagens: os vermes expostos são diretamente imageados em placas de 384 poços. O número de vermes contendo pelo menos um embrião positivo para GFP é contado para cada poço e normalizado pelo número total de vermes naquele poço, conforme mostrado aqui.A exposição a agentes químicos, como o veneno de microtúbulos no-code AOL, leva à indução de uma alta proporção de embriões que expressam GFP em comparação com o controle de DMSO. Os embriões positivos para GFP são significativamente mais brilhantes do que a fluorescência de fundo fraca observada em outros embriões, bem como a autofluorescência observada no intestino dos animais. A seta vermelha indica embriões positivos para GFP claramente visíveis dentro do útero de um verme tratado com no-code AOL.Após este procedimento, outros métodos podem ser realizados, como a coloração de DNA dos vermes, a fim de obter uma análise mais detalhada do efeito dos produtos químicos na linhagem germinativa. Esta técnica permite aos pesquisadores da área de toxicologia avaliar rapidamente a toxicidade reprodutiva e a toxicidade da linhagem germinativa de substâncias químicas.

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