Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo Caenorhabditis elegans

O objetivo geral deste procedimento é avaliar de forma abrangente a toxicidade química da linha germinativa usando o nematóide C No Haitis elgan. Isso é feito primeiro sincronizando os vermes, adicionando uma solução diluída de alvejante a uma população de vermes de estágio misto da cepa C Elgan PXOL one GFP. Esta etapa gera um grande número de embriões protegidos do alvejante pela casca do ovo.

O segundo passo é gerar uma população sincronizada de larvas L one, deixando os embriões eclodirem em líquido sem comida. Em seguida, os vermes crescem até o quarto estágio larval ou L quatro, ponto em que são expostos aos produtos químicos de interesse no líquido por 65 horas. A etapa final é a visualização através de microscopia de fluorescência da expressão dos repórteres GFP em embriões dentro do útero dos vermes.

Em última análise, a proporção de embriões positivos para GFP em comparação com o controle de DMSO reflete a antigenicidade dos compostos testados. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como modelos de Rodin ou ensaios de cultura de células, é que podemos avaliar a genicidade e a toxicidade da linha germinativa de produtos químicos em um modelo animal inteiro e, ao mesmo tempo, realizar um ensaio de alto rendimento realizando o procedimento. Hoje será a pós-doutoranda Dra. Daniella Perotti.

Os vermes gráficos para este procedimento foram previamente preparados conforme descrito no texto do protocolo que acompanha, coletar os vermes GR do meio de crescimento do nematóide ou placas NGM lavando-os com um a dois mililitros de M nove e transferindo-os para um tubo cônico de 15 mililitros. Deixe o verme GR sedimentar no fundo do tubo cônico de 15 mililitros por aproximadamente cinco a 10 minutos. Em seguida, remova o sobrenadante sem perturbar o pellet de minhoca.

Transfira o pellet de minhoca para dois a quatro tubos de microcentrífuga e adicione um mililitro de solução de alvejante diluída a cada tubo. Incube por dois a três minutos em temperatura ambiente. Monitore o progresso da reação sob o microscópio estéreo para confirmar se todos os vermes estão mortos.

Não branqueie por mais de cinco minutos, pois os embriões podem morrer. Colete os vermes por centrifusão por um minuto. A 3000 RPM.

Remova o supernat e adicione um mililitro de M nine estéril para neutralizar a reação. Certifique-se de que todos os materiais que entram em contato com os vermes após o tratamento com alvejante sejam estéreis. Lave as minhocas duas vezes com M nove meios.

Retirar o sobrenadante e adicionar M nove a 100 a 200 microlitros. Usando uma pipeta de pastagem de vidro, adicione uma gota da mistura de minhoca M nine para limpar as placas NGM e incube-as por pelo menos 24 horas a 20 graus Celsius para permitir que os embriões eclodam sem comida. O crescimento das larvas será interrompido nas etapas de sincronização L um estágio dois.

O branqueamento e a fome da palavra L estão sendo usados porque é crucial alcançar uma população quente altamente síncrona para maximizar o número de larvas de L quatro que serão usadas para a exposição. Um dia após o estabelecimento de uma população sincronizada de larvas de L one, colete as larvas de L one das placas transparentes de NGM. Lave as placas com um a dois mililitros de M nove e transfira as larvas L um para um tubo cônico de 15 mililitros.

Deixe os vermes adultos mortos sedimentarem no fundo do tubo cônico de 15 mililitros por aproximadamente cinco minutos. Colete o sobrenadante onde os vermes L um estão em um novo tubo cônico de 15 mililitros. Precipite os vermes por centrificação por dois minutos a 2.600 RPM.

Remover o sobrenadante deixando cerca de 500 microlitros. Determine a concentração de vermes na solução de M nove contando o número de vermes em gotas de 10 microlitros. Usando um microscópio estéreo, conte pelo menos cinco gotas.

Ajuste a concentração dos vermes para 20 a 25 vermes por microlitro em M nove e, em seguida, adicione 50 microlitros da mistura de minhoca M nove às placas NGM. Sentadas com OP 50, as bactérias alimentadoras incubam por 65 horas a 15 graus Celsius para permitir que a população sincronizada L um cresça até atingir o estágio L quatro. Esta tela utiliza um CL contra a cepa que contém um repórter transcricional fluorescente para detectar a ruptura da linha germinativa e a indução de aneuploidia embrionária.

Colete as larvas L quatro das placas transparentes de NGM lavando as placas com um a dois mililitros de M nove e transferindo-as para um tubo cônico de 15 mililitros. Deixe o sedimento do verme L quatro para o fundo do tubo cônico de 15 mililitros por aproximadamente cinco a 10 minutos. Em seguida, remova o sobrenadante sem perturbar o pellet do verme.

Adicione três a cinco mililitros de M nove e determine a concentração de vermes na solução de M nove contando o número de vermes em gotas de 10 microlitros. Usando um microscópio estéreo, conte pelo menos cinco gotas para cada amostra. Ressuspenda os vermes na concentração de um verme por mililitro em M nove.

Diluir dez vezes as bactérias OP 50 previamente preparadas com M nove. Certifique-se de que as bactérias ressuspensas atinjam a temperatura ambiente porque temperaturas mais baixas afetam o desenvolvimento do verme usando uma pipeta multicanal primeiro, adicione 100 microlitros da mistura de vermes M nove a cada poço de uma placa de fundo redondo de dois mililitros de profundidade de 96 poços. Em seguida, adicione 400 microlitros da bactéria OP 50 diluída a cada poço no final.

Cada poço terá 100 minhocas em 500 microlitros. Adicione 0,5 microlitros do produto químico em estudo aos poços desejados para atingir uma concentração final de 100 micromolares. Uma concentração comumente usada em telas químicas em CL elgan expõe controles de solvente de etanol ou DMSO a uma concentração final de 0,1% como controle positivo.

Use 100 micromolares sem cosol. Sele a placa com filme adesivo. Certifique-se de selar bem a placa para evitar contaminação cruzada entre os poços.

Enrole o prato com papel alumínio. Transfira a placa para um agitador de temperatura adequada por um período de tempo adequado. Mantenha a temperatura da sala em torno de 20 graus Celsius, pois a temperatura afeta o crescimento dos vermes na conclusão da exposição química no agitador.

Deixe as placas de 96 poços descansarem por 10 a 15 minutos para permitir que os vermes adultos sedimentem no fundo da placa usando uma pipeta multicanal. Remova 350 microlitros do M nove de cada poço, tomando cuidado para não perturbar os vermes no fundo da placa. Lave as minhocas com um mililitro de M nove e deixe a placa descansar novamente por 10 a 15 minutos para permitir que as minhocas adultas sedimentem até o fundo.

Retire um mililitro do M nove de cada poço, tomando muito cuidado para não perturbar os vermes no fundo da placa. Resus, suspenda os vermes nos M nove restantes. Colete 100 microlitros da mistura de minhoca M nove da placa de 96 poços e carregue-a nos poços de uma placa de fundo transparente de 384 poços de parede preta.

Repita o processo usando vermes de placas de 4 96 poços até que todos os poços da placa de 384 poços tenham sido carregados. É importante que todos os poços tenham o mesmo volume para aumentar a eficiência e a velocidade do foco automático durante o processo de aquisição da imagem. Em seguida, adicione um microlitro de lale a cada poço e deixe os vermes incubarem por aproximadamente 30 minutos.

Lale atua como um agonista do receptor de acetilcolina e imobiliza os vermes, transfere a placa para um microscópio de alto conteúdo de campo amplo capaz de fornecer imagens automatizadas. Use um software de aquisição e análise de imagem de alto conteúdo de acordo com as diretrizes do fabricante. Selecione o objetivo de quatro x para adquirir uma imagem por.

Bem, ajuste os parâmetros de imagem GFP para 45 milissegundos de exposição e resolução de imagem para 2160 por 2160. Iniciar aquisição de imagem Os vermes expostos são fotografados diretamente em placas de 384 poços. O número de vermes contendo pelo menos um embrião GFP positivo é contado para cada poço e normalizado pelo número total de vermes naquele poço, conforme mostrado aqui.

A exposição a agentes químicos, como o veneno de microtúbulos sem código AOL, leva à indução de uma alta proporção de embriões que expressam GFP em comparação com o controle DMSO. Os embriões positivos para GFP são significativamente mais brilhantes do que a fraca fluorescência de fundo observada em outros embriões, bem como a autofluorescência observada no intestino dos animais. A seta vermelha indica embriões positivos para GFP claramente visíveis no útero de um verme tratado com AOL sem código.

Após este procedimento, outros métodos podem ser realizados, como a coloração de DNA dos vermes, a fim de obter uma visão mais detalhada do efeito dos produtos químicos na linha germinativa. Essa técnica permite que pesquisadores no campo da toxicologia avaliem rapidamente a toxicidade reprodutiva e a toxicidade germinativa de produtos químicos.