Usando vírus adeno-associado como uma ferramenta para o estudo da retina Barreiras na Doença

O objetivo geral deste procedimento é investigar a permeabilidade da barreira hematorretiniana e a integridade da membrana limitante interna em modelos animais de doença retiniana. Isso é realizado primeiramente pela injeção de partículas de AAV contendo um transgene GFP no vítreo ou na corrente sanguínea. O segundo passo consiste em coletar amostras de sangue em diferentes momentos após as injeções.

A coleta de sangue é complementada por imagens semanais do fundo do olho in vivo. O passo final é realizar imunohistoquímica em preparações planas da retina e em cortes criostáticos da retina. Por fim, a microscopia confocal e a PCR são utilizadas para mostrar o padrão de transdução indicativo da integridade da membrana limitante interna e para detectar partículas de AAV na corrente sanguínea, demonstrando assim a permeabilidade da barreira hematorretiniana.

A principal vantagem desta técnica, em comparação com nossos métodos existentes, é que o método de aplicação de AAV fornece informações sobre a permeabilidade da barreira hematorretiniana que não são obtidas com outras células. As implicações desta técnica estendem-se à terapia gênica mediada por AAV, pois ajudam a garantir a permeabilidade da barreira hematorretiniana às partículas de AAV, evitando assim quaisquer efeitos colaterais indesejáveis. Este método pode fornecer informações sobre a integridade da membrana limitante interna em modelos animais de outras doenças retinianas, como ratos diabéticos.

Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando observamos que a retina do nosso modelo de camundongo nulo para DP71, que apresenta a ruptura da barreira hematorretiniana, era transduzida de forma mais eficiente do que a retina do tipo selvagem.

Comece anestesiando camundongos C-57 black-six J. Verifique a perda de três reflexos: o reflexo de endireitamento, o reflexo de retirada e a resposta ao aperto da cauda.

A perda desses reflexos confirma a anestesia. Em seguida, dilate as pupilas aplicando 5% de neosinfrina e 0,5% de midriático na córnea por meio de um conta-gotas. Depois, use uma pomada veterinária para lubrificar os olhos, evitando que sequem em excesso. Agora, carregue uma agulha descartável ultrafina de calibre 30 com a solução estoque contendo de um a quatro vezes 10 à 11ª partículas de AAV-GFP.

Em geral, as pessoas novas neste método terão dificuldades porque precisam realizar a injeção intravítrea mais segura sem tocar na lente ou na retina. Em seguida, passe uma agulha descartável ultrafina de calibre 30 através do equador e próximo ao limbo, entrando na cavidade vítrea. Após introduzir a agulha no olho, injete um microlitro da solução enquanto observa a agulha no centro da cavidade vítrea.

Use um olho como controle para experimentos com a membrana limitante interna e injete ambos os olhos para experimentos da barreira hematorretiniana. Após a injeção, aplique um tratamento tópico anti-inflamatório e antibacteriano em cada olho injetado. Uma semana depois, dilate as pupilas com neosinefrina e midriático e realize exames de fundo de olho com uma câmera de fundoscopia.

Acompanhe a expressão de GFP com observações após uma semana, duas semanas, um mês e dois meses da injeção. Após a coleta dos olhos de um animal injetado e eutanasiado, dissecar os olhos para remover a lente e a córnea. Em seguida, fixar por imersão o olho dissecado em paraformaldeído 4% por uma hora. Após uma hora, crioproteger os olhos em sacarose 10% por mais uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, mergulhar os olhos em sacarose 20% por um terço de hora à temperatura ambiente.

Por fim, deixe os olhos em solução de sacarose a 30% durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, inclua e congele as cúpulas oculares em uma resina de inclusão, como matriz criogênica. Em seguida, utilizando o criostato, corte seções de 10 mícrons e monte-as em lâminas preparadas para tecido congelado.

Agora, permeabilize as seções nos lâminas com detergente durante cinco minutos. Em seguida, realize duas lavagens rápidas em PBS. Então, bloqueie os olhos por uma hora à temperatura ambiente.

Para facilitar a dissecação de montagens planas da retina, fixe os olhos enucleados em paraformaldeído 4% por 15 a 30 minutos. Essa fixação e a fixação após a dissecação devem ser realizadas corretamente, pois são fundamentais para preservar a fluorescência da GFP. Dentro de 15 a 30 minutos do período de fixação, dissecar os olhos, removendo a córnea e o cristalino.

Seccione a retina do epitélio pigmentado da retina e da esclera cortando ao redor da ora serrata e do nervo óptico. Após a dissecação, imerja as retinas em paraformaldeído 4% por mais 30 minutos para fixar o tecido e a proteína fluorescente nas células retinianas transduzidas. Após a fixação, lave o espécime por cinco minutos em PBS estéril com pH 7,4.

Em seguida, substitua o PBS pelo tampão bloqueador e incube as retinas por quatro horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Inicie a etapa de marcação incubando as amostras com os anticorpos primários no tampão bloqueador por quatro horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Após a aplicação do anticorpo primário, lave os tecidos três vezes com PBS, depois incube os tecidos em uma diluição de um para 500 de anticorpos conjugados com Alexa Fluor no tampão bloqueador.

Incubar por uma hora para cortes criostáticos ou duas horas para preparações em montagem plana. Faça isso à temperatura ambiente e proteja da luz. Após a aplicação do anticorpo secundário, remova-o com três lavagens em PBS, como antes.

Agora, faça cortes alívio na retina para que ela possa ser montada planamente sobre uma lâmina de vidro com os fotorreceptores ou as células ganglionares da retina voltadas para cima. Aplique um meio de montagem aquoso e uma lamínula. As lâminas podem ser armazenadas a quatro graus Celsius antes da imagem por microscopia confocal.

Inicie gerando um controle positivo para partículas de AAV circulantes. Primeiro, colete uma amostra de sangue de 10 a 20 microlitros antes da injeção do AAV. Em seguida, após anestesiar, injete 100 microlitros da solução viral estoque na corrente sanguínea.

A maneira mais fácil de injetar substâncias na corrente sanguínea é pela veia peniana. Nesta captura de vídeo, injetamos um corante azul como controle visual da injeção. Durante os próximos três dias, continue coletando periodicamente uma pequena amostra de sangue e, em seguida, sacrifique o camundongo. A partir de uma amostra de tecido, extraia o DNA genômico das amostras utilizando um kit comercial; com o DNA obtido, realize uma amplificação por PCR com um par de primers para GFP. Execute 30 ciclos com extensões de 45 segundos e temperaturas de anelamento de 55 graus Celsius. Esperava-se que o padrão de transdução do vetor SHH 10 aumentasse nos camundongos nulos para DP 71. Se o modelo animal apresentou perturbações na estrutura da membrana limitante interna, os camundongos nulos para DP 71 possuem barreiras retinianas comprometidas e, portanto, são uma comparação útil: a injeção intravítrea de SHH 10 em camundongos nulos para DP 71 direciona as células gliais de Müller de forma mais eficiente.

Isso indica uma desestabilização da membrana limitante interna nesta linhagem de camundongos transgênicos em comparação com os controles do tipo selvagem. A injeção de AAV5-GFP também demonstrou permeabilidade da membrana limitante interna. O AAV5 foi ineficaz por injeção intravítrea em camundongos do tipo selvagem, mas tornou-se altamente eficaz na entrega gênica aos fotorreceptores em camundongos com barreiras retinianas comprometidas, como nos camundongos nulos para DP71.

Por meio da análise por PCR, a barreira hematorretiniana em camundongos nulos para DP71 permanece seletiva a partículas AAV, já que nenhum traço de AAV foi encontrado em suas amostras de sangue após injeção intravítrea. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar o vírus adeno-associado para testar a integridade da membrana limitante interna ou a permeabilidade da barreira hematorretiniana, analisando o padrão de transdução da retina ou a presença de partículas AAV na corrente sanguínea.