Name: Usando vírus adeno-associado como uma ferramenta para o estudo da retina Barreiras na Doença (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprenda a avaliar a permeabilidade da barreira hematorretiniana e a integridade da membrana limitante interna em modelos animais de doenças retinianas utilizando vetores de vírus adeno-associado (AAV) e técnicas de microscopia confocal.

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Agradecemos a plataforma de imagens do Institut de la Vision. Agradecemos à Associação Francesa de Distrofia Muscular (AFM) por uma bolsa de doutorado para O.V. e Allergan INC. Este trabalho realizado no âmbito do LABEX LIFESENSES [referência ANR-10-LABX-65] foi apoiado por fundos estatais franceses geridos pela ANR. Agradecemos a Peggy Barbe e Mélissa Desrosiers pela assistência técnica nos preparativos do AAV. Somos gratos a Stéphane Fouquet pela excelente assistência técnica em microscopia confocal e sua contribuição especializada na interpretação dos resultados.

Todos os animais utilizados neste estudo foram atendidas e tratadas de acordo com a Declaração de ARVO para o Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research. 1. Produção de AAV recombinante (rAAV) por transiente transfecção de células HEK-293 17,18 NOTA: Ver McClure C, Jove (2011) 19. <ol><li> Purifica-se uma preparação de plasmídeo em larga escala (pelo menos 1 mg / ml) dos plasmídeos de vector de AAV. Use 3 plasmídeos. O plasmídeo ajudante de AAV carregando os genes de replicação e da cápside sem o terminal invertida de AAV ITRs repete, a cassete de expressão do transgene transportando o ITR de AAV referida como o plasmídeo de transferência, o plasmídeo e fornecendo os genes de adenovírus ajudante E2, E4, e os genes de ARN AV referido como pHELPER. </li><li> Transfectar células 293 com estas três plasmídeos utilizando polietilenoimina (ou outro reagente de transfecção). Acima de 80% de eficiência de transfecção é necessário para uma boa viyields ral. </li><li> Purifica-se o AAV recombinante a partir de 293 de lisados ​​de células em um gradiente de iodixanol. 15%, 25%, 40%, 60% e o iodixanol é usado para obter o gradiente. Recolha 40% fracção contendo iodixanol partículas de AAV, concentrar a fracção após ultracentrifugação a 500.000 xg durante 1 h e troca de tampão contra PBS (solução salina tamponada com fosfato) com 0,001% de Pluronic. </li><li> Para determinar título genômico viral 20, realizar uma DNAse ProteinaseK digest seguido por qPCR. Os iniciadores directo e inverso, amplificar a região de 62 pb situada na ITR de AAV2. Para o plasmídeo padrão, a sonda é marcada com FAM e tem um extintor buraco negro (BHQ). </li><li> Efectuar qPCR (reacção em cadeia da polimerase quantitativa) em um volume final de 25 ul usando 340 nM de iniciador reverso ITR, 100 nM iniciador ITR para a frente, de 100 nM de sonda de AAV2 ITR, dNTPs 0,4 mM, MgCl2 2 mM, 1x tampão de Taq Platinum, 1U platina Taq e 5 template ul (padrão, amostra e sem controle template). </li><li> Parao padrão, usar o plasmídeo para a transfecção de 7 x 10 diluições em série (cada 5 ul de 2 x 09-2 outubro 3 x 10 genomas / ml resultando numa concentração final de 10 outubro - 10 abril genomas / ml). </li><li> Inicie o programa por um passo de desnaturação inicial a 95 ° C durante 15 min, seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C em 1 min de recozimento e / extensão a 60 ° C durante 1 min. Armazenar a 4 ° C durante um armazenamento de curto prazo ou a -20 ° C durante longos períodos de armazenamento. </li></ol> 2. Injeção intravítrea de AAV <ol><li> Anestesiar ratos C57BL6J com cetamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e verificar a perda do reflexo de endireitamento, o reflexo de retirada da cauda e pitada de resposta, indicando uma anestesia adequada. Dilatar alunos pela aplicação da córnea de neosynephrine 5% e 0,5% mydriaticum colírio. Use vet pomada nos olhos para evitar a secura e sob anestesia. </li><li> Passe um G disposab ultrafine 30le agulha através do equador e próxima ao limbo, na cavidade vítrea (ver Chiu K, Jove (2007) 21). Injectar 1 ul estoque contendo 1 a 4 x 10 11 pv de ShH10-GFP ou AAV5-GFP com a observação directa da agulha no centro da cavidade vítrea (Figura 1). Use um olho como um controle para experimentos de ILM. Injectar ambos os olhos para experimentos BRB. Aplicar um tratamento tópico anti-inflamatório e anti-bacteriano em olhos injetados. </li><li> Dilatar alunos com neosynephrine e mydriaticum colírio para geração de imagens. Realizar exames de fundo de olho com uma câmera de fundo de olho para seguir GFP (proteína verde fluorescente) expressão, 1 semana, 2 semanas, 1 mês e 2 meses após a injeção intravítrea (Figura 1). Sacrifício ratos por inalação de CO2 1 a 2 meses pós-injecção. </li></ol> 3. A imuno-histoquímica <ol><li> Para criosecções retina (Figura 1), dissecar olhos enucleados para remover lens e córnea, e imersão em solução de 4% de paraformaldeído durante uma hora. <ol><li> Cryoprotect os olhos previamente fixados em 10% de sacarose durante 1 hora à temperatura ambiente, 20% de sacarose para outra hora à temperatura ambiente. Cryoprotect em solução de sacarose a 30%, durante a noite a 4 ° C. Congelar e eyecups incorporar na incorporação de resina, como Cryo-matriz. Faça 10 mm criosecções e montagem em lâminas com tratamento especial para cortes de tecidos congelados e que melhorar a aderência do tecido durante a coloração. </li><li> Permeabilizar secções com Triton X100 a 0,1% em PBS pH 7,4 durante 5 min. Lavar 2x com PBS e bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente, em PBS com 1% de BSA, 0,1% de Tween 20. </li></ol></li><li> Para flatmounts da retina (Figura 1), fixar os olhos enucleados em paraformaldeído a 4% durante 15 minutos para facilitar a dissecação. <ol><li> Em 15-30 minutos, dissecar os olhos para remover a córnea e do cristalino. Separa-se a retina a partir do epitélio pigmentado da retina (RPE) e esclera por corte em torno da ora serrata eo nervo óptico. Mergulhar em paraformaldeído a 4% durante mais 30 min para fixar a retina e a proteína fluorescente em células da retina transduzidas (fixação não deve ser superior a 24 horas). Lavar 5 min em PBS estéril, pH 7,4. </li><li> Mudar o tampão PBS para bloqueio (PBS com 1% de BSA, 2% de cabra normal ou de soro de burro, 0,5% Triton X-100), e incubar em tampão de bloqueio quer por 4 horas à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite. </li></ol></li><li> Incubar tecidos com anticorpos primários em tampão de bloqueio quer por 4 horas à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite. Lavar 3x com PBS. NOTA: Os anticorpos utilizados são os seguintes: anti-laminina (1 / 1.000) marcação dos ILM, clone anti-rodopsina 4D2 (1/500) hastes de rotulagem, anti-glutamina sintetase clone GS-6 (1 / 1.500) rotulagem células de Müller , PNA Lectin (1/40) cones de rotulagem. </li><li> Incubar tecidos com diluição 1: 500 de anticorpos secundários conjugados fluor alexa em tampão de bloqueio durante 1 h (criocortes) ou 2 hr (flatmounts) a tempe quartoratura e protegida da luz. Lavar 3x com PBS. </li><li> Fazer cortes de alívio para a retina e que flatmount numa lâmina de vidro quer com o foto-receptor ou de células ganglionares da retina (RGC) voltado para cima. Adicionar mountingmedium aquosa, aplique lamela e armazenar a 4 ° C. </li><li> Execute microscopia confocal de varredura a laser em microscópio confocal. Adquirir imagens em sequência, linha por linha, para reduzir a excitação e crosstalk emissão. Definir tamanho do passo de acordo com o teorema de amostragem de Nyquist-Shannon. Use as configurações de exposição que minimizem pixels supersaturados nas imagens finais. Processar imagens de 12 bits com FIJI, Z-seções do projeto em plano único com intensidade máxima sob função Z-projeto e finalmente converter-se ao modo de cores RGB de 8 bits. </li></ol> 4. Análise de PCR de rato As amostras de sangue <ol><li> Injectar 100 ul estoque contendo 1 a 4 10 x 11 partículas de um AAV-GFP na veia peniana de ratinhos C57BL6J anestesiados (5% de isofluranopara a indução de uma câmara de perto e 2,5% de isoflurano através de um cone de nariz durante a cirurgia), utilizando uma seringa de insulina com um ultra-fino 6 milímetros agulha. Este animal irá servir como um controlo positivo de partículas de AAV de circulação. </li><li> Amostra de sangue da cauda do rato antes da injeção e 3 horas, 24 horas, 2 dias, e 3 dias após ShH10 injeção intravítrea ou após a injeção intrapenile (Figura 1). Cerca de 10-20 ul é recolhido em tubos de heparina. Sacrifício ratos por inalação de CO2, após a conclusão do procedimento. </li><li> Extrair DNA genômico a partir de amostras de sangue, utilizando o kit de extração de sua escolha. </li><li> Efectue a amplificação por PCR de ADN genómico. Para este protocolo utilizar o seguinte par de iniciadores: GFP, sentido 5&#39;-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 &#39;, anti-sentido 5&#39;-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3&#39;. O seguinte programa de PCR foi realizada: 95 ° C 2 min (1 ciclo); 95 ° C 45 seg, 55 ° C 1 min, 72 ° C 45 seg (30 ciclos); 72 ° C, 5 min (1 ciclo);4 ° C espera. </li></ol> 5. Método de Azul de Evans Opcional NOTA: Quantificar permeabilidade vascular medindo perda de albumina a partir de vasos sanguíneos na retina usando o método do azul de Evans 10. <ol><li> Prepare corante azul de Evans por dissolução em solução salina normal (6 mg / ml), ultra-sons durante 5 minutos num aparelho de limpeza de ultra-sons, e filtração através de um filtro de 5 | im. </li><li> Anestesiar ratos C57BL6J (isoflurano inalação, veja o passo 4.1), verifique a perda do reflexo de endireitamento, o reflexo de retirada e resposta cauda pitada indicando uma anestesia adequada, e injetar azul de Evans (45 mg / kg) através da veia peniana (Figura 1). Verifique se patas, focinho e orelhas de ratos tornam-se claramente azul seguinte Evans injeção de azul, confirmando a captação e distribuição do corante. </li><li> Anestesiar ratos C57BL6J 3 horas após a injecção do corante com cetamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e verificar a perda de righting reflex indicando uma anestesia adequada. Amostra intracardial cerca de 500 ul de sangue em tubos de heparina e perfundir ratinhos durante 2 min através do ventrículo esquerdo com um tampão de citrato (0,05 M, pH 3,5; dissolve-se 7,8 g de ácido cítrico e 3,8 g de citrato de sódio em 1 L de água destilada) pré-aquecido a 37 ° C para impedir a vasoconstrição. Os ratinhos são sacrificados por perfusão. </li><li> Após a perfusão, enuclear e dissecar cuidadosamente ambos os olhos sob um microscópio cirúrgico para recolher as retinas (ver Secção 3.2). Retinas seco em um evaporador centrífugo durante a noite, pesar, e extrair o corante azul de Evans por incubação retinas com 100 ul de formamida durante 18 hr a 65 ° C com agitação (100 xg). Centrifugar as amostras da retina de 30K omega filtro em tubos 20,798.5 xg durante 2 horas a 4 ° C e as amostras de sangue centrifugar a 20,798.5 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Use os dois sobrenadantes para medir absorção. Determinar a absorvância de cada amostra subtraindo a absorvância máxima for azul de Evans a 620 nm para o mínimo de absorvência a 740 nm. Calcular a concentração azul de Evans no plasma e da retina a partir de uma curva padrão de azul de Evans em formamida. Expresse permeabilidade BRB em microlitros de azul de Evans por grama de retina seco por hora (l plasma / g de peso seco da retina / h). </li></ol> 6. Opcional Angiofluoresceinografia NOTA: O vazamento de vasos sanguíneos da retina em ratos podem ser visualizados por injeção intraperitoneal de fluoresceína. <ol><li> Anestesiar ratos C57BL6J (isoflurano inalação, veja o passo 4.1) e dilatar os alunos com colírio (neosynephrine e mydriaticum). Use vet pomada nos olhos para evitar a secura e sob anestesia. </li><li> Injectar por via intraperitoneal 0,01-0,02 ml de fluoresceína de sódio a 10% em 0,1 ml de solução salina estéril para angiofluoresceinografia. </li><li> Coletar imagens de ambos os olhos após a injeção, utilizando uma câmera de fundo de olho. Sacrifique ratos por inalação de CO2 após a proprocedimento. NOTA: 20 segundos são necessários para os vasos da retina para se tornar visível na angiografia. As imagens têm de ser capturado entre 3-10 min após a injecção máxima de fluoresceína. Os pontos de fuga (se houver) são observáveis ​​após 2,5 min. Em pontos de tempo posteriores a qualidade da imagem é perdida devido à fluoresceína de sódio difundir-se, assim, apenas as imagens vítreo, logo após obtidos são utilizados para a análise. </li></ol>

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<li>Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O BRB regula a troca de moléculas entre o sangue e da retina. A sua composição está associada com várias doenças, tais como a retinopatia diabética ou degeneração macular relacionada com a idade (AMD). Mostrámos recentemente que em um ratinho knock-out de distrofina, que exibe permeável BRB, a retina se torna mais permissiva para a entrega de genes mediada por vectores virais adeno-associados (AAV). No entanto, apesar BRB partículas de AAV permeabilidade injectado via intra-ocular permanecer confinadas ao compartimento ...

Células de Müller são o principal componente da glia da retina. Morfologicamente, a envolver o retina radialmente e sua endfeet, em contacto com o vítreo, enfrentar o ILM e componentes secretos do último. A ILM é uma membrana basal composta por cerca de dez diferentes proteínas da matriz extracelular (laminina, agrina, perlecano, nidogï¿½io, colagénio e proteoglicanos de sulfato de heparina vários). Durante o desenvolvimento, a sua presença é indispensável para a histogénese de retina, a navegação de axónios óptica, e a sobrevivência de células ganglionares 1-3. No entanto, não é essencial na ILM adulto retina e pode ser removido cirurgicamente em determinadas patologias, sem causar danos na retina 4. Em terapia génica, esta membrana torna-se uma barreira física para a transdução eficiente da retina utilizando AAV por injecção intravítrea 5. Através da vasta arborização de seus processos, as células de Müller fornecer suppo nutricional e regulamentarrt para ambos os neurónios da retina e células vasculares. Müller células estão também envolvidas na regulação da homeostase da retina, na formação e manutenção da BRB 6. Junções apertadas entre as células endoteliais dos capilares da retina, células de Müller, astrócitos e pericitos formar o BRB. BRB impede certas substâncias de entrar nas retina.In muitas doenças como a retinopatia diabética, oclusão da veia da retina e doenças respiratórias, hipóxia da retina provoca fuga através do BRB 7-9. Esta ruptura é associada com um aumento da permeabilidade vascular que conduz ao edema vasogénico, descolamento da retina e danos na retina. Células de Müller estão fortemente associados com os vasos sanguíneos e a membrana basal, desempenhando um papel importante tanto na integridade BRB e ILM. Consequentemente, marcação das células gliais de Müller é particularmente relevante para o estudo do estado físico dessas barreiras da retina. Clássicoaliado, BRB permeabilidade é medida utilizando o ensaio de azul de Evans que consiste em injecção sistémica de corante azul de Evans, que se liga de forma não covalente à albumina do plasma. Este ensaio mede a perda de albumina (proteína de tamanho intermediário, ~ 66 kDa) de vasos sanguíneos na retina (ver protocolos Seção 5) 10. Como alternativa, o vazamento vascular podem ser visualizados por angiografia fluorescência retinal atestando por vazamento de fluoresceína (molécula pequena, ~ 359 Da; consulte Protocolos Seção 6) 11. No entanto, ambos os métodos permitem a avaliação da permeabilidade BRB para pequenas moléculas e proteínas, mas eles não fornecem informações sobre a integridade ILM. Assim, para estudar BRB permeabilidade, foi utilizado um método com base de AAV que dá informação sobre a permeabilidade BRB para moléculas maiores (por exemplo, partículas de AAV, 25 nm de diâmetro). Partículas de efeito, o nosso método pode detectar a presença de AAV de transgene no sangue, o que sugere que ~ 25 nm de diâmetro fariaser capaz de se infiltrar na corrente sanguínea. Este método também proporciona informação sobre a estrutura da ILM e proteínas da matriz extracelular em condições patológicas. Duas variantes de AAV são úteis para tal estudo: AAV5 e ShH10. Subretinally injetado, AAV5 tem um tropismo natural para fotorreceptores e epitélio pigmentar da retina 12, mas não pode passar para a retina externa quando administrada no vítreo no tipo selvagem retinas com ILM intacta 5,13. ShH10 é uma variante de AAV que foi concebida especificamente para alvejar células gliais mais neurónios 14,15. ShH10 etiquetas selectivamente células de Müller em ambas as retinas saudáveis ​​e doentes com maior eficiência em retinas com barreiras comprometidos 16. Essas ferramentas virais juntamente com immuhistochemistry e análise em DNA de sangue fornecer informações sobre o estado das barreiras da retina e do seu envolvimento na doença (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>C57BL6J camundongos cepa</td><td>JANVIER LABS camundongos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cetamina 500</td><td>Virbac França</td><td></td><td>anestésico</td></tr><tr><td>Xylazine Rompun 2%</td><td>Bayer Healthcare</td><td></td><td>anestésico</td></tr><tr><td>Neosynephrine 5% Faure</td><td>Europhta</td><td></td><td>dilatador</td></tr><tr><td>Mydriaticum 0,5%</td><td>Thea</td><td></td><td>dilatador</td></tr><tr><td>Sterdex</td><td>Novartis</td><td></td><td>resina de incorporação criomatriz anti-inflamatória</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Adhesion Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143352</td><td>slides</td></tr><tr><td>anti-laminina</td><td>Sigma</td><td>L9393</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>anti-rodopsina clone 4D2</td><td>Millipore</td><td>MABN15</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>anti-glutamina sintetase clone GS-6</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>anti-glial fibrilar ácido Dako</td><td></td><td>334</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>PNA Lectina</td><td>Invitrogen</td><td>L32459</td><td>sonda</td></tr><tr><td>Alexa anticorpos secundários conjugados com flúor</td><td>Anticorpo</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>Reagente</td><td>Fluorsave Calbiochem</td><td>345789</td><td>meio de montagem</td></tr><tr><td>QIAmp DNA Micro Kit</td><td>QIAGEN</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq DNA polimerase</td><td>Promega</td><td>M3001</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue dye</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td>dye</td></tr><tr><td>5 &micro; Filtro</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma</td><td>C1909-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Formamida espectrofotométrica</td><td>Sigma</td><td>295876-2L</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceína</td><td>Sigma</td><td>F2456</td><td>corante</td></tr><tr><td>Micron III</td><td>Phoenix Research Labs</td><td></td><td>O sistema de microscopia baseado em câmera colorida 3-CCD, captura de quadros e software pronto para uso permite que os pesquisadores obtenham imagens de retinas de camundongos.</td></tr><tr><td>Seringas de Insulina</td><td>Terumo</td><td>SS30M3109</td><td></td></tr><tr><td>Seringa 10 &micro; l Hamilton</td><td>Dutscher</td><td>74487</td><td>Seringue 1701</td></tr><tr><td>Agulha RN G33, 25 mm, PST 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>11530332</td><td>Injeção Intravítrea</td></tr><tr><td>UltraMicroPump UMP3</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td>O injetor versátil usa microseringas para fornecer volumes de picolitros</td></tr><tr><td>UltraMicroPump (UMP3) (um) com Controlador SYS-Micro4 Controlador</td><td></td> <td>digital</td> <td>UMP3-1</td></tr><tr><td>Lupa binocular SZ76</td><td>ADVILAB</td><td>ADV-76B2</td><td>Zoom 0,66 x 5 x LEDs com suporte epi e diâmetro / Dissecção de retinas</td></tr><tr><td>Tesoura de mola reta - 8,5 cm</td><td>Bionic France S.a.r.l</td><td>15003-08</td><td>Dissecção de retinas</td></tr><tr><td>curvada Tesoura Vanna</td><td>15004-08</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont 5</td><td>11254-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-Well Thermal Cycler</td><td>Life technologies</td><td>4375786</td><td>Termociclador</td></tr><tr><td>Limpador ultrassônico</td><td>Suprimentos de laboratório</td><td>G1125P1T</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 30k tubos ômega</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speedvac</td><td>Fisher Scientific</td><td>SC 110 A</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofluorômetro</td><td>TECAN</td><td>infinito M1000</td><td></td></tr></tbody></table>

usando vírus adeno-associado como uma ferramenta para o estudo da retina barreiras na doença

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Células de Müller são as principais células gliais da retina. Os finais pés formam os limites da retina nas membranas limitantes exteriores e interiores (ILM), e em conjunto com os astrócitos, células endoteliais e pericitos eles estabelecer a barreira hemato-retiniana (BRB). BRB limita o transporte de material entre a corrente sanguínea e da retina, enquanto o ILM actua como uma membrana basal que define histologicamente a fronteira entre a retina e a cavidade do vítreo. Rotular células de Müller é particularmente relevante para estudar o estado físico das barreiras da retina, uma vez que estas células são uma parte integrante da BRB e a ILM. Ambos BRB e ILM são freqüentemente alterados em doenças da retina e são responsáveis ​​por sintomas da doença. Existem vários métodos bem estabelecidos para estudar a integridade do BRB, tais como o ensaio de azul de Evans ou angiografia com fluoresceína. No entanto, estes métodos não fornecem informações sobre o grau de permeabilidade BRB to moléculas maiores, em escala nanométrica. Além disso, eles não fornecem informações sobre o estado de outras barreiras da retina, tais como a ILM. Para estudar a permeabilidade ao lado BRB ILM da retina, utilizou-se um método baseado AAV que fornece informações sobre a permeabilidade do BRB para moléculas maiores, enquanto que indica o estado das proteínas e de ILM da matriz extracelular em estados de doença. Duas variantes de AAV são úteis para tal estudo: AAV5 e ShH10. AAV5 tem um tropismo natural para os fotorreceptores, mas ela não pode passar para a retina externa, quando administrada no vítreo quando a ILM está intacto (ou seja, em retinas de tipo selvagem). ShH10 tem uma forte tropismo para células gliais e rotular selectivamente glia Müller em ambas as retinas saudáveis ​​e doentes. ShH10 prevê a entrega gene mais eficiente em retinas onde ILM está comprometida. Essas ferramentas virais juntamente com imunohistoquímica e-DNA do sangue análise lançar luz sobre o estado das barreiras da retina na doença.

Esperamos o aumento da transdução de células gliais da retina Müller ShH10 se utilizando o modelo animal mostra perturbações na estrutura da ILM (Figura 2A - B). Por exemplo, demonstramos que na ausência de DP71, alvos ShH10 especificamente, mas de forma mais eficiente Müller células gliais por injecção intravítrea, indicando um aumento da permeabilidade da ILM nesta linha de ratinhos em comparação com ratinhos de tipo selvagem 16 (Figura 2C - F).</st...

Para investigar a permeabilidade da barreira hemato-retiniana e a integridade da membrana limitante interna em modelos animais de doença da retina, usamos várias variantes de vírus adeno-associados (AAV) como ferramentas para rotular neurônios da retina e glia. A expressão gênica repórter mediada por vírus é então usada como um indicador da permeabilidade da barreira retiniana.

Usando vírus adeno-associado como uma ferramenta para o estudo da retina Barreiras na Doença

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

O objetivo geral deste procedimento é investigar a permeabilidade da barreira hematorretiniana e a integridade da membrana limitante interna em modelos animais de doen&ccedil;a retiniana. Isso &eacute; realizado primeiramente pela inje&ccedil;&atilde;o de part&iacute;culas de AAV contendo um transgene GFP no v&iacute;treo ou na corrente sangu&iacute;nea. O segundo passo consiste em coletar amostras de sangue em diferentes momentos ap&oacute;s as inje&ccedil;&otilde;es.A coleta de sangue é complementada por imagens semanais do fundo do olho in vivo. O passo final é realizar imunohistoquímica em preparações planas da retina e em cortes criostáticos da retina. Por fim, a microscopia confocal e a PCR são utilizadas para mostrar o padrão de transdução indicativo da integridade da membrana limitante interna e para detectar partículas de AAV na corrente sanguínea, demonstrando assim a permeabilidade da barreira hematorretiniana.A principal vantagem desta técnica, em comparação com nossos métodos existentes, é que o método de aplicação de AAV fornece informações sobre a permeabilidade da barreira hematorretiniana que não são obtidas com outras células. As implicações desta técnica estendem-se à terapia gênica mediada por AAV, pois ajudam a garantir a permeabilidade da barreira hematorretiniana às partículas de AAV, evitando assim quaisquer efeitos colaterais indesejáveis. Este método pode fornecer informações sobre a integridade da membrana limitante interna em modelos animais de outras doenças retinianas, como ratos diabéticos.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando observamos que a retina do nosso modelo de camundongo nulo para DP71, que apresenta a ruptura da barreira hematorretiniana, era transduzida de forma mais eficiente do que a retina do tipo selvagem.Comece anestesiando camundongos C-57 black-six J. Verifique a perda de três reflexos: o reflexo de endireitamento, o reflexo de retirada e a resposta ao aperto da cauda.A perda desses reflexos confirma a anestesia. Em seguida, dilate as pupilas aplicando 5% de neosinfrina e 0,5% de midriático na córnea por meio de um conta-gotas. Depois, use uma pomada veterinária para lubrificar os olhos, evitando que sequem em excesso. Agora, carregue uma agulha descartável ultrafina de calibre 30 com a solução estoque contendo de um a quatro vezes 10 à 11ª partículas de AAV-GFP.Em geral, as pessoas novas neste método terão dificuldades porque precisam realizar a injeção intravítrea mais segura sem tocar na lente ou na retina. Em seguida, passe uma agulha descartável ultrafina de calibre 30 através do equador e próximo ao limbo, entrando na cavidade vítrea. Após introduzir a agulha no olho, injete um microlitro da solução enquanto observa a agulha no centro da cavidade vítrea.Use um olho como controle para experimentos com a membrana limitante interna e injete ambos os olhos para experimentos da barreira hematorretiniana. Após a injeção, aplique um tratamento tópico anti-inflamatório e antibacteriano em cada olho injetado. Uma semana depois, dilate as pupilas com neosinefrina e midriático e realize exames de fundo de olho com uma câmera de fundoscopia.Acompanhe a expressão de GFP com observações após uma semana, duas semanas, um mês e dois meses da injeção. Após a coleta dos olhos de um animal injetado e eutanasiado, dissecar os olhos para remover a lente e a córnea. Em seguida, fixar por imersão o olho dissecado em paraformaldeído 4% por uma hora. Após uma hora, crioproteger os olhos em sacarose 10% por mais uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, mergulhar os olhos em sacarose 20% por um terço de hora à temperatura ambiente.Por fim, deixe os olhos em solução de sacarose a 30% durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, inclua e congele as cúpulas oculares em uma resina de inclusão, como matriz criogênica. Em seguida, utilizando o criostato, corte seções de 10 mícrons e monte-as em lâminas preparadas para tecido congelado.Agora, permeabilize as seções nos lâminas com detergente durante cinco minutos. Em seguida, realize duas lavagens rápidas em PBS. Então, bloqueie os olhos por uma hora à temperatura ambiente.Para facilitar a dissecação de montagens planas da retina, fixe os olhos enucleados em paraformaldeído 4% por 15 a 30 minutos. Essa fixação e a fixação após a dissecação devem ser realizadas corretamente, pois são fundamentais para preservar a fluorescência da GFP. Dentro de 15 a 30 minutos do período de fixação, dissecar os olhos, removendo a córnea e o cristalino.Seccione a retina do epitélio pigmentado da retina e da esclera cortando ao redor da ora serrata e do nervo óptico. Após a dissecação, imerja as retinas em paraformaldeído 4% por mais 30 minutos para fixar o tecido e a proteína fluorescente nas células retinianas transduzidas. Após a fixação, lave o espécime por cinco minutos em PBS estéril com pH 7,4.Em seguida, substitua o PBS pelo tampão bloqueador e incube as retinas por quatro horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Inicie a etapa de marcação incubando as amostras com os anticorpos primários no tampão bloqueador por quatro horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Após a aplicação do anticorpo primário, lave os tecidos três vezes com PBS, depois incube os tecidos em uma diluição de um para 500 de anticorpos conjugados com Alexa Fluor no tampão bloqueador.Incubar por uma hora para cortes criostáticos ou duas horas para preparações em montagem plana. Faça isso à temperatura ambiente e proteja da luz. Após a aplicação do anticorpo secundário, remova-o com três lavagens em PBS, como antes.Agora, faça cortes alívio na retina para que ela possa ser montada planamente sobre uma lâmina de vidro com os fotorreceptores ou as células ganglionares da retina voltadas para cima. Aplique um meio de montagem aquoso e uma lamínula. As lâminas podem ser armazenadas a quatro graus Celsius antes da imagem por microscopia confocal.Inicie gerando um controle positivo para partículas de AAV circulantes. Primeiro, colete uma amostra de sangue de 10 a 20 microlitros antes da injeção do AAV. Em seguida, após anestesiar, injete 100 microlitros da solução viral estoque na corrente sanguínea.A maneira mais fácil de injetar substâncias na corrente sanguínea é pela veia peniana. Nesta captura de vídeo, injetamos um corante azul como controle visual da injeção. Durante os próximos três dias, continue coletando periodicamente uma pequena amostra de sangue e, em seguida, sacrifique o camundongo. A partir de uma amostra de tecido, extraia o DNA genômico das amostras utilizando um kit comercial; com o DNA obtido, realize uma amplificação por PCR com um par de primers para GFP. Execute 30 ciclos com extensões de 45 segundos e temperaturas de anelamento de 55 graus Celsius. Esperava-se que o padrão de transdução do vetor SHH 10 aumentasse nos camundongos nulos para DP 71. Se o modelo animal apresentou perturbações na estrutura da membrana limitante interna, os camundongos nulos para DP 71 possuem barreiras retinianas comprometidas e, portanto, são uma comparação útil: a injeção intravítrea de SHH 10 em camundongos nulos para DP 71 direciona as células gliais de Müller de forma mais eficiente.Isso indica uma desestabilização da membrana limitante interna nesta linhagem de camundongos transgênicos em comparação com os controles do tipo selvagem. A injeção de AAV5-GFP também demonstrou permeabilidade da membrana limitante interna. O AAV5 foi ineficaz por injeção intravítrea em camundongos do tipo selvagem, mas tornou-se altamente eficaz na entrega gênica aos fotorreceptores em camundongos com barreiras retinianas comprometidas, como nos camundongos nulos para DP71.Por meio da análise por PCR, a barreira hematorretiniana em camundongos nulos para DP71 permanece seletiva a partículas AAV, já que nenhum traço de AAV foi encontrado em suas amostras de sangue após injeção intravítrea. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar o vírus adeno-associado para testar a integridade da membrana limitante interna ou a permeabilidade da barreira hematorretiniana, analisando o padrão de transdução da retina ou a presença de partículas AAV na corrente sanguínea.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Neste vídeo, usamos um adenovírus carregando o gene Cre recombinase para infectar fibroblastos de rato principal embrionárias carregando um alelo Rac1 floxed.

Adenovírus mediada por remoção genética das moléculas de sinalização em fibroblastos de rato cultivadas Primária embrionárias

Este vídeo mostra a infecção de neurônios primários do mesencéfalo de camundongos com vírus adeno-associados carregando um indicador fluorescente de cálcio. A fluorescência do indicador confirma a infecção bem-sucedida e permite o monitoramento em tempo real da infecção neuronal.

Infectando neurônios primários do mesencéfalo de camundongos com vírus adeno-associados projetados

Fonte: Grames, M. S., et al. Métodos e dicas para administração intravenosa de vírus adeno-associado a ratos e avaliação da transdução do sistema nervoso central. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a injeção na veia da cauda do vírus adeno-associado recombinante (AAV) em ratos. Após a injeção na veia lateral da cauda, o vírus entra na corrente sanguínea, circula pelo coração e chega ao cérebro, onde entra nos neurônios e facilita a produção de proteínas-alvo para aplicações...

 Administração intravenosa de vetores virais adeno-associados recombinantes em modelo de rato 

A injeção sub-retiniana é uma técnica cirúrgica para entrega gênica eficaz ao epitélio pigmentar da retina no olho do camundongo.  Aqui descrevemos um método fácil e replicável para injeção sub-retiniana de vetores virais no epitélio pigmentar da retina em camundongos experimentais.

Limbo Abordagem-Subretinal injeção de vetores virais para terapia genética em ratos Retinal Pigment Epithelium

Métodos para uma entrega de gene em larga escala do SNC em ratos são cobertos. Neste exemplo, o propósito é imitar uma doença que afeta a todo da medula espinhal. A transdução generalizada pode ser usada para fornecer uma proteína terapêutica ao SNC, desde uma única administração periférica.

Métodos e dicas para administração intravenosa de vírus Adeno-associado aos ratos e avaliação do sistema nervoso Central transdução

Aqui, apresentamos um método para investigar morfogênese neurita em explantes de retina de camundongos pós-natal por microscopia confocal de lapso de tempo. Descrevemos uma abordagem para rotulagem e aquisição esparsa de tipos de células da retina e seus processos finos usando vetores de vírus associados a adeno recombinantes que expressam proteínas fluorescentes direcionadas à membrana de forma dependente de Cre.

Imagem de lapso de tempo da arborização neuronal usando rotulagem de vírus associado adeno esparsa de populações de células de retina geneticamente direcionadas

Este protocolo apresenta como quantificar a eficiência de transdução AAV na retina do mouse usando PCR de gotícula digital (dd-PCR) juntamente com produção de AAV de pequena escala, injeção intravitreal, imagem da retina e isolamento do DNA genômico da retina.

Método DE GOTÍcula Digital PCR para quantificação da eficiência de transdução AAV em Murine Retina

Neste manuscrito, a injeção subconjuntival é demonstrada como um método de entrega vetorial válido para tecidos oculares em camundongos usando um sistema de injeção que consiste em uma bomba de seringa de infusão/retirada e uma seringa removível à prova de gás acoplada a agulhas de microinjeção. Este sistema de injeção também é adaptável para outras vias de administração intraocular.

Administração Subconjuntival de Vetores de Vírus Adenoassociados em Modelos de Pequenos Animais

O vírus adenoassociado é produzido em cultura de células de suspensão e purificado por centrifugação com duplo gradiente de densidade de iodixanol. Etapas são incluídas para aumentar o rendimento total do vírus, diminuir o risco de precipitação do vírus e concentrar ainda mais o produto final do vírus. Os títulos finais esperados atingem 10a 12 partículas virais/mL e são adequados para uso pré-clínico in vivo .

Produção e purificação de vírus adenoassociados em cultura de suspensão por centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol para aplicações in vivo

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para a geração e purificação de vetores virais adeno-associados usando um método otimizado de cromatografia de afinidade à base de heparina. Apresenta uma abordagem simples, escalável e econômica, eliminando a necessidade de ultracentrifugação. Os vetores resultantes exibem alta pureza e atividade biológica, comprovando seu valor em estudos pré-clínicos.

Isolamento de vetores virais adeno-associados por meio de um protocolo de cromatografia de afinidade de heparina de etapa única e semiautomatizada

Aprenda a avaliar a permeabilidade da barreira hematorretiniana e a integridade da membrana limitante interna em modelos animais de doenças retinianas utilizando vetores de vírus adeno-associado (AAV) e técnicas de microscopia confocal.

Usando vírus adeno-associado como uma ferramenta para o estudo da retina Barreiras na Doença

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