Barcoding Genetic com proteínas fluorescentes para Aplicações Multiplexados

O objetivo geral do experimento a seguir é fazer o código de barras fluorescente de células de mamíferos para aprimorar ensaios biológicos multiplexados de alto rendimento que dependem de leituras fluorescentes distintas. Para fazer isso, partículas retrovirais são usadas para expressar de forma estável proteínas fluorescentes em células de mamíferos, codificando-as com barras. Em seguida, a classificação de células ativadas por fluorescência é realizada para obter populações clonais com código de barras.

As populações clonais são então amplificadas, combinadas e analisadas por citometria de fluxo para confirmar que podem ser distinguidas umas das outras e, portanto, usadas simultaneamente. Finalmente, as linhas celulares com código de barras são transduzidas com ensaio marcado. As proteínas e a atividade biológica são monitoradas usando canais fluorescentes distintos dos canais com código de barras.

Os resultados demonstram a utilidade do revestimento de barras fluorescentes de células de mamíferos para aplicações multiplexadas em um ambiente de alto rendimento. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes que exigem calibração cuidadosa de anticorpos ou corantes é que, uma vez que as linhas celulares geneticamente codificadas são estabelecidas, elas não requerem manipulação adicional e, como a proteína de interesse é expressa por longos períodos de tempo, elas são usadas posteriormente para adaptações biológicas. O acoplamento de linhagens celulares fluorescentes com código de barras com ensaios de superfície nos permite investigar funções ou efeitos biológicos de forma independente em um formato de hidroprodução.

Em nosso exemplo, usamos revestimento de barra genética fluorescente para monitorar a clivagem de diferentes substratos virais multiplexando. O ensaio pode ser explorado ainda mais para investigar as máquinas envolvidas na clivagem e para a descoberta de medicamentos de alto rendimento. No dia anterior à transfecção, semeie uma placa de 10 centímetros com 2,5 vezes 10 para as sextas células Phoenix GP em DMEM com 10% de FBS.

Esta linha celular de empacotamento expressa de forma estável as proteínas gag e pole para a formação de partículas retrovirais em transe. No dia da transfecção, use um microscópio de campo claro para examinar as células. As células devem estar saudáveis e aderir à placa em uma monocamada para serem usadas para transfecção.

Em seguida, prepare a mistura de transfecção de DNA para 125 microlitros de soro livre. DMEM. Adicione três microgramas de vetor de glicoproteína do envelope do vírus da estomatite vesicular, P-C-I-V-S-V-G, e três microgramas de vetor de transferência carregando o gene da proteína fluorescente de interesse, adicione 15 microlitros de reagente de transfecção de polieteramina e misture para obter partículas virais carregando diferentes marcadores de proteína fluorescente. Realize cada transfecção de forma independente com o marcador de sua escolha.

Incubar cada mistura à temperatura ambiente durante 15 minutos após o transfecto de incubação, adicionando a mistura às células. Em seguida, incube as placas a 37 graus Celsius. Opcionalmente, após 24 horas, substitua o meio por sete mililitros de meio fresco.

Embora isso possa melhorar a saúde celular, pode diminuir a carga viral no sobrenadante. 48 horas após a transfecção, use um pipetador para transferir o sobrenadante, que contém as partículas do vírus para uma seringa de 10 mililitros. Equipado com um filtro de politetrafluoretileno de 0,20 micromolar para pressionar o êmbolo para dispensar o filtrado em dois tubos de microcentrífuga de mililitros.

Reserve uma alíquota de dois mililitros para uso imediato. Coloque o snat viral e as alíquotas restantes no gelo e transfira-os para 80 graus Celsius negativos até que sejam usados 24 horas antes da transdução em cada poço de uma semente de placa de seis poços 2,0 a 3,0 vezes 10 para as quintas células aderentes aqui 2 9 3 células T são usadas no dia seguinte. Para transduzir as células aderentes, remova o meio existente da placa.

Adicione cinco microgramas por mililitro de poli cérebro aos dois mililitros da seno viral coletada anteriormente e adicione a mistura cuidadosamente às células. Sele as placas com parfum. Em seguida, coloque as placas em um balde suspenso.

Centrífuga centrífuga a 1500 vezes G por 120 minutos a 32 graus Celsius. Após a centrifugação, incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas, substitua o meio celular por pelo menos 72 horas.

Pós-transdução. Prepare-se para analisar as células transduzidas por citometria de fluxo para quantificar a taxa percentual de transdução. Primeiro, usando uma linha celular não transduzida comparável como controle negativo, certifique-se de que as portas estejam configuradas corretamente nos canais corretos.

Defina a tensão do canal de parâmetro de modo que a população negativa fique abaixo do valor de 10 elevado ao terço em cada eixo fluorescente de interesse. Em seguida, defina as portas para fluorescência positiva como eventos que aparecem além do controle negativo. Em seguida, usando as células transduzidas, determine a porcentagem positiva para o canal fluorescente específico.

Classifique as células em tubos cônicos de 15 mililitros contendo um mililitro de 100% FBS. Em seguida, gire as populações classificadas em um balde suspenso. Centrífuga de rotor a 524 vezes G a 32 graus Celsius por cinco minutos.

Após a centrifugação, ressuspenda as células em um mililitro de meio fresco e, em seguida, semeie duas vezes 10 para as seis células em dois mililitros de DMEM em uma placa de seis centímetros. Nessa concentração, a confluência está abaixo de 60% e permitirá crescimento e divisão por pelo menos dois dias. Coloque as células em uma incubadora a 37 graus Celsius por vários dias para dar tempo para a amplificação.

As populações clonais podem ser geradas a partir das células originalmente transduzidas ou classificadas. A classificação de populações apertadas com base na fluorescência escolhida, em vez de clones individuais neste estágio, garante uma população de backup para seleção futura. Se, quando necessário, defina os portões para classificação de acordo com as populações de interesse, certifique-se de que os portões estejam separados por pelo menos uma escala logarítmica Para obter populações distinguíveis usando uma unidade de deposição celular automatizada, classifique células individuais em placas de 96 poços, observe que haverá uma média de uma célula por poço.

Alguns poços podem não ter células e outros podem ter mais de um Following. Classificação, incube as células a 37 graus Celsius por pelo menos duas semanas Para amplificar os clones individuais. Examine regularmente as células ao microscópio para garantir que as populações crescentes surjam de células individuais e não de mais de uma.

Certifique-se também de que as células não cresçam demais após duas semanas. Rastreie as populações clonais putativas por citometria de fluxo e compare-as com uma população de controle negativo. As verdadeiras populações clonais devem ter padrões de fluorescência muito rígidos.

Escolha as populações mais distintamente separadas com base na intensidade média e rigidez da população. Amplifique-os conforme necessário ou armazene os estoques em meio de congelamento com 10% de DMSO a 80 graus Celsius negativos por curtos períodos de tempo ou nitrogênio líquido por mais tempo. Em seguida, testar se as populações clonais podem ser usadas com sucesso em um sistema de triagem multiplex de alto rendimento.

Escolha um conjunto de clones com absorção, espectros de emissão e/ou intensidades diferentes distinguíveis e combine-os em uma única semente de tubo. 50.000 das células combinadas em 200 microlitros de DMEM suplementado em cada poço de uma placa de 96 poços em tubos separados. Prepare controles de cor negativa e única para uso na configuração de parâmetros e valores de compensação no citômetro de fluxo.

Defina os valores de compensação. Em seguida, analise a amostra para garantir que cada uma das linhas de células fluorescentes estabelecidas independentes possa ser distinguida. Para adaptar as linhagens celulares com código de barras a uma aplicação biológica, primeiro selecione elementos de ensaio que foram projetados de forma que sejam acoplados a uma etiqueta ou proteína fluorescente como uma fusão ou através de um local de entrada interno do ribossomo.

Ires, que permite a detecção direta por meio de citometria de fluxo de western blotting ou microscopia. O sistema utilizado aqui consiste em um ensaio biológico no qual uma proteína do envelope do HIV é expressa na superfície da célula, expondo seu HA e tags bandeira. A proteína do ensaio é expressa em uma célula com código de barras que expressa o tomate TD.

A clivagem da proteína pode ser monitorada pela coloração com um anticorpo Anti-Flag marcado com FSE. Quando a proteína não é clivada, a coloração é vista, mas quando a proteína é clivada, a marcação de fluorescência verde não é mais evidente. Para estabelecer o ensaio biológico nas células com código de barras, transduza-as com partículas virais que contenham os elementos de ensaio de escolha.

Adicione o SUP natin viral às células de sua escolha e gire por centrifugação. Em seguida, incube as células com anticorpos anti-HA marcados com fluorescência. Em seguida, classifique as células com código de barras para isolar aquelas que contêm elementos de ensaio que são positivos para ha.

Finalmente, linhas celulares com código de barras distintas combinadas. Cada um contendo um ensaio com um substrato diferente. Incube a mistura de células com anticorpo conjugado Anti-Flag e ZI e analise-as por citometria de fluxo para determinar se ocorreu clivagem da proteína para rastrear o ensaio, analisar ou decodificar as populações no canal apropriado onde as distintas linhas celulares geneticamente codificadas podem ser distinguidas aqui.

O canal PE para tomate TD decodifica a natureza do substrato analisando no canal fite para revelar a população positiva para testar a clivagem de proteínas expressas na superfície expressa na via secretora. Células Sub T um para código de barras fluorescente para expressar tomate TD e classificadas em três populações em diferentes intensidades. Cada uma das populações foi então transduzida com um retrovírus diferente para induzir a expressão da proteína do envelope do HIV do tipo selvagem, da proteína do envelope do HIV mutante ou do vírus da dengue.

Proteína de limite PRM, cada uma flanqueada por tags de bandeira e HA. As células transduzidas foram incubadas com anticorpos anti HA e Anti-Flag. A coloração anti-HA foi realizada para confirmar a presença da proteína de ensaio modificada, enquanto a coloração anti-Flag foi realizada para determinar se ela estava clivada.

Quando as populações combinadas não coradas foram analisadas por citometria de fluxo, as populações clonais foram distinguíveis com base no código de barras do tomate TD, mas indistinguíveis no canal fite. Em contraste, quando as mesmas populações foram coradas com anticorpo flag fite, uma população foi positiva para flagg. Com base no código de barras, essa população pode ser facilmente identificada como a população portadora do substrato do envelope mutante do HIV.

Agora, você deve ter um bom entendimento sobre como utilizar a tecnologia de válvula retro junto com a citometria de fluxo. A fim de estabelecer linhas celulares fluorescentes geneticamente com código de barras, quatro aplicações biológicas em um formato multiplex, a capacidade de acoplar células fluorescentes geneticamente com código de barras com ensaios baseados em células em um formato multiplex aumenta drasticamente as capacidades de alto rendimento. Depois que as linhagens celulares são geradas, é importante congelá-las.

Em seguida, descongele-os periodicamente, reanalise-os e libere-os de volta. Embora a geração de linhagens celulares fluorescentes com código de barras possa ser demorada no início, uma vez estabelecidas, elas aumentam drasticamente a repetibilidade e a robustez de aplicações futuras.