Name: Caracterização funcional de Na + / H + Trocadores de intracelular compartimentos usando a Seleção Proton-matança de expressá-las na membrana plasmática (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprenda a caracterizar trocadores de sódio-próton intracelulares usando seleção por matança de prótons em linhagens celulares mutantes. Este método permite medir a recuperação do pH intracelular e determinar parâmetros cinéticos de transporte iônico.

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Os autores estão profundamente gratos a todos os membros da comunidade científica que trabalham com pH e transporte de íons, que originaram e aprimoraram as medições descritas aqui. Eles agradecem particularmente ao Dr. Jacques Pouysségur, que originou a técnica de seleção de eliminação de H+ usada aqui. Eles agradecem à Universidade de Nice-Sophia Antipolis, ao CNRS, ao ANR (JCJC SVSE1 NHEint) e ao ICST Labex pelo apoio.

1. H + Matar Seleção <ol><li> As linhas celulares <ol><li> Estavelmente NHE-transfectar células deficientes (por exemplo, a linha celular derivada de CCL39 PS120 16) usando qualquer combinação de vector de expressão de mamífero e transfecção método que produza rendimentos eficientes de transfecção e selecção numa linha de células de fibroblastos. NOTA: Para muitos anos de Fosfato de Cálcio precipitação 19 foi utilizado com bons rendimentos de transfecção. Este foi substituída mais recentemente por reagentes comerciais, tais como Lipofectamine2000, as transfecções ser realizadas seguindo as instruções do fabricante. </li></ol></li><li> Soluções <ol><li> Preparar três soluções estéreis descritos como abaixo. Esteriliza-se estas soluções por meio de filtração (0,22 um). <ol><li> Prepara-se uma NH4 + Carregando solução (pH 7,4) composto por 50 mM de NH4Cl, 70 mM de cloreto de colina, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glucose e 15 mM de MOPS a pH 7,4. </li><li> Prepara-se uma solução de lavagem (pH 7,0) composta por 120 mM de cloreto de colina, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,0. </li><li> Prepara-se uma solução de recuperação (pH 7,4) composto por NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4. </li></ol></li></ol></li><li> Antes de iniciar a selecção, obter uma incubadora de cultura de células que pode ser utilizado a 37 ° C sem adicional de CO 2 a partir do tanque externo (denominado CO 2 - incubadora &quot;livre&quot;), como 5% de CO 2 resultará na memória intermédia que pode prejudicar o acidificação. Amplificar a linha celular que expressa o NHE de interesse até cerca de 2 x 10 8 células (tipicamente cerca de 20 100 placas confluentes mm). </li><li> H + matando procedimento: <ol><li> Incubar as células que expressam o NHE intracelular de interesse durante 1 hora em solução a carregar, em 37 ° C na incubadora de CO 2 -livre. </li><li> Aspirar a solução de carga e, em seguida, lave-os duas vezes na solução descrita-rinse acima. Executar esta etapa eficiente para eliminar o residual extracelular NH4Cl que prejudicaria a criação de um gradiente de NH 4 + íngreme que irá gerar a acidificação. </li><li> Elimine o meio por aspiração e lavagem incubar as células durante uma hora em solução de recuperação de novo a 37 ° C na incubadora de CO 2 livre. </li><li> Substituir o meio de recuperação com meio de cultura normal (tipicamente DMEM com 7,5% de FCS) e as células crescer em condições de cultura padrão (37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2 e 95% de ar). </li></ol></li><li> Repetir este ciclo de selecção, duas vezes por semana, até surgir clones estáveis. NOTA: Tome especial cuidado relativo à cultura de células e condições de seleção. Meses de trabalho pode ser arruinada por qualquer contaminação que é mais propenso a oCCur após um longo período de cultura de células e manipulações repetidas. <ol><li> Aqui, escolha se deseja ampliar os clones e caracterizá-los individualmente conforme descrito nas seções 2-3, ou reuni-los em conjunto para gerar uma população celular antes de caracterização. </li></ol></li><li> Aplicar a selecção ocasional (cerca de uma vez a cada duas semanas) para reter as células resistentes à acidificação por contra-selecionar aqueles que podem ter revertido para o sensível ao ácido fenótipo parental (Figura 1B). </li></ol> 2. As medições de pH intracelular 2.1) Imagem de Fluorescência pH <ol><li> Use a ratiometric sensíveis ao pH de corante fluorescente BCECF / AM, que é sensível ao pH quando excitado a 490 nm e possui uma nm ponto isosbestic 445, seguindo os protocolos do fabricante. <ol><li> Em alternativa, utilizar outras sondas sensíveis ao pH, seguindo os protocolos do fabricante. </li></ol></li><li> Use um con imagem definidasisting de um microscópio invertido acoplado a uma câmera de vídeo de alta sensibilidade. Equipar este conjunto com 450 nm e 490 nm filtros de interferência de banda estreita emparelhados com quartzo adequado filtros de densidade neutra para a excitação. <ol><li> Se possível, use o conjunto adequado de filtros e condições de iluminação para configuração valores de fluorescência comparáveis ​​para λ1 e λ2 para que a relação se aproxima de 1. Além disso, evite valores de fluorescência basais que são definidas quer saturar ou muito baixa, tanto para λ1 e / ou λ2. Isso pode produzir artefatos importantes como então a relação pode não foi detectável embora pH intracelular está mudando. NOTA: Este sistema deve habilitar perfusão rápida, a excitação de lapso de tempo para os dois comprimentos de onda acima mencionados e aquisição no comprimento de onda de emissão própria (535 nm para BCECF). Equipar o sistema com software que permite a aquisição de dados automática e armazenamento. </li></ol></li></ol> 2.2) A medição do NHE Atacante Atividade (Extrusão dePrótons do citosol) <ol><li> Acidifica-se as células por uma incubação de 1 h na solução de NH 4 + Carregando (ver passo 1.4), na ausência de CO 2. </li><li> Adicionar BCECF-AM (5 mM concentração final) para a solução para os últimos cinco minutos e, em seguida, lave-o com NH 4 + solução de carga para eliminar a sonda extracelular. </li><li> Montar as células no microscópio e tomar várias imagens para gravar uma linha de base estável. Perfundir a solução de lavagem (ver acima). Isto resulta numa queda da fluorescência correspondente à acidificação. </li><li> Após a estabilização do pH, perfuse qualquer uma das soluções a seguir para medir as taxas de recuperação de pH mediadas por Li + / H +, Na + / H + ou K + / H + câmbio. Cada solução contém um potencial catião de acoplamento para ser testado para a troca de H +. Se um desses é transportado, isto irá resultar em um aumento de fluorescência a 495 nm que correspgundo a um aumento no pH intracelular: LiCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4 120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4 KCl 125 mM, MgCl2 1 mM, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4 </li></ol> 2.3) A medição do NHE Atividade Reversa NOTA: O princípio aqui é inverter os gradientes iônicos transmembrana. <ol><li> Antes da medição, carregar as células com o catião intracelular de interesse (ver abaixo). </li><li> Incubar-los por 5 min com BCECF / AM (veja o passo 2.2.2); lavá-los, montá-los no microscópio vídeo. </li><li> Perfundir a solução de carga e tomar várias imagens para gravar uma linha de base estável. </li><li> Depois da estabilização da linha de base, a imagem das variações de pH quando as células são perfundidos com um meio ácido extracelular contendo 120 mCloreto de colina M, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl 2, CaCl 2 2 mM, 5 mM de glicose e 15 mM de MES a pH 6,5. </li><li> Para LiCl carregamento, as células incubar durante 2 horas em uma solução composta de LiCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4. Lítio intracelular medido por espectroscopia de absorção atómica gera um valor de cerca de 60 mM. </li><li> Para carregamento de Na +, incubar as células durante duas horas numa solução composta por 120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4 na presença de 1 mM de ouabaina para bloquear a bomba de Na / K ATPase. Nestas condições, a concentração intracelular de Na + está na gama de 40 mM. NOTA: K + de carga não é necessário, como K + citosólico concentração está na gama de 140 mM e um gradiente dirigido exteriormente-K +, por conseguinte, é fácil de conseguir. </li></ol> 2.4) Tratamento e calibração de dados: NOTA: Este passo é válido tanto para as medições frente e verso. <ol><li> No final de cada experiência, perfundir as células com uma solução de KCl 140 mM, HEPES 20 mM e 5 uM nigericina ajustado a valores de pH entre 6,5 e 7,4. </li><li> Coletar dados como medições de fluorescência a partir das imagens (níveis de cinza que representam os níveis de intensidade) e exportação nos termos do formato de texto e tratar como explicado abaixo usando um programa de planilha. </li><li> Calcular os valores de pH intracelular para cada célula ou região de interesse utilizando a seguinte equação individual: pH = pKa + (Log (R-R min) / (R max -R)) x F min (λ2) / F max (λ2) </li><li> Utilizar a min F (λ2) / F x ma (λ2) proporção, se houver fuga de branqueamento ou sonda, resultando numa diminuição na fluorescência a 450 nm ao longo das experiências. Esta é no entanto muito raramente observada nas condições utilizadas no desexperimentos crita. </li><li> À medida que os dados de calibração estão presentes no final de cada medição de pH, verificar se os valores calculados que correspondem diferentes dos valores de pH utilizados para a calibração. Se for o caso, em seguida, ajustar todos os valores de pH experimentalmente-determinados para a calibração utilizando o seguinte procedimento: <ol><li> Calcula-se o seguinte quociente (Q, a diferença entre os valores medidos / diferença entre os valores de calibração). Multiplique todo o conjunto de dados por Q. fazer o ajuste final por adição ou subtração de modo que os valores calculados serão iguais aos valores de calibração correspondentes. </li></ol></li></ol> 3. Medidas de taxas iniciais do NHE7 pelo FAST Li + Captação <ol><li> Semear as células em placas de múltiplos poços (6 a 24 poços) e acidificam-los usando a técnica de NH 4 + carregamento descrito acima ou, alternativamente, o / albumina de soro bovino (BSA) a acidificação nigericina descrito em 20. </li><li&gt; placas de enxaguamento duas vezes rapidamente com a solução de lavagem acima descrito e, em seguida, incubar as células em soluções de absorção que contêm 1-10 mM de lítio (ligeiramente abaixo) os valores Km e as concentrações desejadas dos catiões e / ou inibidores de interesse para a quantidade desejada de tempo. </li><li> Manter durações de captação de curto e consistentes (tipicamente um minuto ou abaixo) para garantir que o transporte opera em condições de taxas iniciais. Também certifique-se de que todas as soluções utilizadas para a captação são isotônicas. </li><li> No final do tempo de absorção, eliminar cuidadosamente a forma absorção e lavar as células quatro vezes com solução salina de fosfato gelada tamponada (PBS). Realizar estas lavagens tão rápido quanto possível (menos de 10 seg para os quatro deles é ideal) para evitar o efluxo de lítio. </li><li> Lisar as células em 25% de ácido nítrico. Aplicar 250 ul por poço de 25% de ácido nítrico e deixá-lo assentar durante pelo menos 1 h, em seguida, cada poço de sucata com a extremidade da ponta da pipeta e transferir toda a suspensão bem em um novo mitubo crocentrifuge. </li><li> Transferir o lisado em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, centrifugar-los durante 5 minutos a 15.000 x g (temperatura ambiente), para remover os detritos celulares. </li><li> Medir a quantidade de lítio do sobrenadante por espectroscopia de absorção atômica 21. NOTA: Diferentes empresas fornecem espectrometria de absorção atômica, que têm de ser equipado com uma lâmpada de cátodo oco de lítio. Siga as instruções do fabricante como essas máquinas são muito precisos, mas também bastante delicado. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo descreve como para seleccionar células que expressam intracelular de Na + / H + permutadores na membrana plasmática, sem alterar a sua sequência primária por mutagénese dirigida ao local. Estes trocadores de agora pode ser caracterizado. Este método baseia-se na toxicidade celular de protões intracelulares para seleccionar linhas celulares que expressam vesicular de Na + / H + permutadores na membrana plasmática. Pode ser possível, e...

A maioria dos compartimentos intracelulares exibir um pH luminal ácida, o que é um parâmetro essencial para a maturação, o tráfico, a reciclagem de proteínas ou hormônios e neurotransmissores que carregam. Tem sido demonstrado que o gradiente de pH entre o teor de citosol e vesicular é gerado por vacuolar H + ATPase 1, acoplado aos transportadores vesiculares cloreto clc 2. Tanto em camundongos knock-out (KO) e pacientes humanos, a importância desses transportadores tem sido destacada pelos fenótipos pesados ​​causadas por mutações em seus genes 3-6. Os membros da família SLC9A permutadores de sódio a hidrogénio, também denominado por NHE de Na + / H + permutadores, demonstraram ser importantes efectores no pH intracelular e regulação do volume celular, bem como no transporte vectorial de equivalentes de ácido-base entre epitélios . Além dos NHE da membrana plasmática, três altamente conservada de Na + / H + permutadores de NHE 6, 7e 9 são fixados em rede trans-Golgi e no início endosomes 7. As mutações em seus genes têm sido associados com Angelman-like ou Christianson Síndromes 8-9, autismo base familiar 10 e Attention Deficit Disorder Hiperatividade 11-12. Estes trocadores também foram envolvidos em problemas neurodegenerativas, como Alzheimer susceptibilidade à doença 13 e retardo mental genes contíguos X-ligados síndromes 14. Tomados em conjunto, estes estudos destacam a importância desses NHEs intracelulares no desenvolvimento e / ou a função cerebral. A localização intracelular destes trocadores impede medições precisas de sua seletividade ion, direcção de transporte, parâmetros cinéticos, e regulamentação. Como é o caso para todos os transportadores expressos em compartimentos intracelulares, que é extremamente difícil de avaliar as suas actividades bioquímicas e, consequentemente, para compreender totalmente os seus papéis fisiológicos e o mechanismos subjacente suas implicações patológicas. Para a concentração de K + cytosolic alta, a hipótese mais comumente aceita era de que eles estavam trabalhando como K + acoplados transportadores de efluxo de prótons. A existência de uma tal fuga de protões tinham sido implicado, como pode contrabalançar bombeamento de protões pelos V-ATPase, a fim de manter um pH vesicular estado estacionário. O objectivo deste artigo visual é (i) para demonstrar um método que permite a selecção genética de linhas celulares que expressam estes transportadores vesiculares na sua membrana plasmática, e (ii) mostram duas abordagens independentes para medir as funções destes transportadores. Três décadas atrás, Pouysségur e Franchi foram pioneiras na abordagem genética que permitiu a clonagem molecular e caracterização dos membros da família NHE 15. Este baseou-se na toxicidade de protões intracelulares, como um método de rastreio. O primeiro passo foi a obtenção de linhas celulares deficientesem qualquer troca + / H + Na expresso na membrana plasmática, usando a reversibilidade deste transportador. Os fibroblastos (linha celular CCL39) foram pré-carregado com Na + ou Li + e, em seguida, colocado num meio extracelular ácida (pH 6,5) durante 2 h. Isto levou à morte de células que expressam um funcional de Na + / H + e para a troca de selecção de células antiportador-deficiente (linha celular PS120 16). Quando cultivado em meio isento de bicarbonato, estas células são muito sensíveis à acidificação intracelular aguda. Por conseguinte, a expressão de qualquer mecanismo de efluxo de protões funcional na membrana de plasma vai ser seleccionadas positivamente (ver 17), se tais células são submetidas a acidifications intracelulares agudas. Tais técnicas de acidificação pode ser utilizado para isolar as linhas celulares com defeitos tráfico que permitam a expressão forçada de NHE intracelulares WT na membrana plasmática. Como eucariota Na + / H+ Trocadores são electroneutral, eles não são mensuráveis ​​pelas abordagens eletrofisiológicos que têm sido utilizados com grande sucesso para medir canais. Assim, o presente artigo propõe demonstrar como medir a atividade desta trocador por medições de pH intracelulares e rápida cinética de absorção de lítio. Como os conceitos subjacentes são o mesmo, é interessante notar que muitos dos processos desenvolvidos para a secção de selecção, também são utilizados directamente para medições funcionais. Curiosamente, observou-se que o defeito tráfico presentes nas linhas de células seleccionadas utilizando a abordagem descrita neste manuscrito conduz a uma maior expressão de outras proteínas vesiculares na membrana do plasma, tais como o canal de potássio vesicular TWIK1 18. Isso aponta para a seleção de um mecanismo geral defeito de retenção de proteínas transmembrana vesiculares. Assim, este processo de selecção e as células que gera Maioconstituem uma ferramenta promissora para a comunidade científica que trabalha em proteínas da membrana de compartimentos intracelulares. Como bem as técnicas de medição apresentados aqui podem ser aplicáveis ​​para o estudo de outros transportadores não-electrogénico.

<table><tbody><tr>Equipamento <td></td><td></td><td>padrão de cultura de células</td><td>Usado para seleção de eliminação de H+ composta por muitos dispositivos com diferentes números de catálogo</td></tr><tr><td>Incubadora com CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO15A</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora sem CO2</td><td>Heraeus instrumento</td><td>BB6220</td><td></td></tr><tr><td>Capa de fluxo laminar PSM1200NF</td><td>Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>52010120</tr><tr><td>DMEM sigma médio</td><td></td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS ouro</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 10x</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de absorção atômica com sistema de forno Zeeman</td><td>Thermo Scientific</td><td>ICE 3500 GFZ</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Nítrico</td><td>sigma</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de videomicroscopia de fluorescência</td><td>Leica</td><td></td><td>Composto por muitos dispositivos com diferentes números de catálogo</td></tr><tr><td>Microscópio automatizado invertido</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>suporte para microscópio</td><td>leica</td><td>11888906</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888911</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> 11505180 <td>11888377</td><td></td></tr><tr><td>fluorescência incidente</td><td>leica</td><td>11888901</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11504166</td><td></td></tr><tr><td>suporte do motor</td><td>leica</td><td>11888379</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505234</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521505</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11522106</td><td></td></tr><tr><td>Luz de transmissão LED&nbsp;</td><td>Leica</td><td>8097321</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8102034</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>placa</td> motorizada 11521580 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 11522068 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11531172</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521734 11521719</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888423</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>11888424</tr><tr><td>Saída da câmera</td><td>Leica</td><td>11888373</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11507807</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888393</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888259</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888258</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11541510</td><td></td></tr><tr><td>software de aquisição/análise de imagens</td><td>Leica</td><td>11888375</td><td></td></tr><tr><td>óptica</td><td>leica</td><td>11506507</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506243 11506203</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fluorescência Lâmpada de xenônio</td><td>câmera DMI6000 leica</td> software <td>8100601</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>metafluor/Mmfluor</td><td></td><td>11640905</td><td></td></tr><tr><td>sonda sensível ao PH, BCECF-AM</td><td>tecnologias de vida</td><td>B1170</td><td></td></tr><tr><td>Nigericina</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterização funcional de na<sup&gt; +</sup&gt; / h<sup&gt; +</sup&gt; trocadores de intracelular compartimentos usando a seleção proton-matança de expressá-las na membrana plasmática

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Acidificação endossomal é crítica para uma vasta gama de processos, tais como a reciclagem e degradação de proteínas, dessensibilização do receptor e neurotransmissor em vesículas sinápticas carregamento. Esta acidificação é descrito para ser mediada por ATPases de protões, acoplados a transportadores de cloreto clc. Altamente conservada prótons electroneutral transportadores, do Na + / H + trocadores (NHE) 6, 7 e 9 também são expressos nestes compartimentos. As mutações nos seus genes foram ligados com doenças cognitivas e doenças neurodegenerativas humanas. Paradoxalmente, seus papéis são ainda imperceptíveis, como a sua localização intracelular impediu a caracterização funcional detalhado. Este manuscrito apresenta um método para resolver este problema. Esta consiste na selecção de linhas de células mutantes, capazes de sobreviver a acidificação citosólica aguda retendo NHE intracelular na membrana plasmática. Em seguida, ele mostra dois protocolos complementares para medir a seletividade e atividade iondestes permutadores de: (i) uma base em medições de pH intracelular por meio de microscopia de fluorescência de vídeo, e (ii) uma base na cinética de absorção rápida de lítio. Esses protocolos podem ser extrapolados para medir outros transportadores não-electrogénico. Além disso, o processo de selecção aqui apresentada gera células com um fenótipo de retenção intracelular defeituosa. Por conseguinte, estas células expressam também outras proteínas da membrana vesicular na membrana plasmática. A estratégia experimental descrito aqui pode, portanto, constituir um instrumento potencialmente poderoso para estudar outras proteínas intracelulares que será, então, expressa na membrana plasmática vesicular, juntamente com o Na + / H + permutadores utilizados para a selecção.

Seleção: A selecção H + matando baseia-se na difusão da amónio base fraca, tal como representado na Figura 1A. O efeito de bases fracas e ácidos difusão no pH intracelular foi iniciada por Walter Boron e colaboradores 22. A idéia elegante para usar este fenômeno para produzir uma acidificação letal para a seleção genética positiva foi então desenvolvido por Jacques Pouysségur 17. De acordo com um protocolo deste tipo, o pH intracelular cai pa...

A primeira parte deste artigo mostra como selecionar linhagens celulares mutantes que expressam trocadores vesiculares de Na+/H+ em sua membrana plasmática. A segunda parte fornece protocolos baseados em medições de pH intracelular e rápida absorção de íons, que são usados para determinar a seletividade de íons e os parâmetros cinéticos desses trocadores.

Caracterização funcional de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Trocadores de intracelular compartimentos usando a Seleção Proton-matança de expressá-las na membrana plasmática

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

O objetivo geral do experimento a seguir é medir a atividade de trocadores sódio-próton expressos intracelularmente. Isso é alcançado primeiramente pela seleção de células que expressam os trocadores sódio-próton intracelulares na membrana plasmática por meio da seleção por morte por próton. Como segundo passo, as células selecionadas são acidificadas e, em seguida, a recuperação do pH intracelular é medida para confirmar a atividade de troca sódio-próton nessas células.As cinéticas rápidas do transporte iônico são então medidas para determinar as constantes de afinidade para o cátion transportado e para inibidores. Por fim, o monitoramento das alterações no pH intracelular e das cinéticas rápidas das células somáticas selecionadas permite a caracterização funcional da troca proteica intracelular. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a expressão de transportadores mutantes ou o uso de células permeabilizadas, é que ela possibilita a expressão de transportadores intracelulares do tipo selvagem na membrana plasmática, tornando possível medir diretamente sua função.Quem demonstrará o procedimento será a Dra. Mallory Poet, cientista pesquisadora do meu laboratório. Para iniciar o procedimento de detecção de prótons, primeiramente incubar as células que expressam o trocador sódio-próton intracelular de interesse na solução de carregamento a 37 graus Celsius e em incubadora livre de dióxido de carbono por uma hora. Em seguida, aspirar a solução de carregamento e lavar as células duas vezes com meio fresco.Após a segunda lavagem, aspire o meio e incube as células em solução de recuperação em uma incubadora livre de dióxido de carbono. Após mais uma hora, substitua o meio de recuperação por meio de cultura regular e cultive as células em condições padrão de cultura. Repita este ciclo de seleção duas vezes por semana até surgirem clones estáveis para a imagem da fluorescência intracelular de pH das células.Primeiro, prepare um conjunto de imagem composto por um microscópio invertido acoplado a uma câmera de vídeo de alta sensibilidade com filtros de interferência de banda estreita de 450 nanômetros e 490 nanômetros, combinados com os filtros de densidade neutra de quartzo apropriados para excitação. Se possível, utilize o conjunto apropriado de filtros e condições de iluminação para ajustar valores comparáveis de fluorescência para os canais um e dois, de modo que a razão se aproxime de um, a fim de medir a atividade direta do trocador sódio-próton. Em seguida, acidifique as células com uma incubação de uma hora em solução de carregamento com amônio.Na ausência de dióxido de carbono durante os últimos cinco minutos da incubação, corar as células com um corante fluorescente sensível ao pH com razão métrica. Ao final do período de incubação, lavar as células com solução de carregamento de amônio para eliminar a sonda extracelular e montar as células coradas no microscópio. Selecionar as regiões de interesse onde os valores fluorescentes serão medidos conforme apropriado.Em seguida, registre várias imagens para estabelecer uma linha de base e perfunda as células com a solução RIN para iniciar uma queda na fluorescência. Após a estabilização do pH, perfunda as células com a solução de interesse para medir as taxas de recuperação de pH mediadas pelo câmbio lítio-hidrogênio, sódio-hidrogênio ou potássio-hidrogênio. Agora, perfunda as células com a solução de hippies suplementada com cloreto de potássio e gerin.Em seguida, colete as medidas de fluorescência das imagens e exporte os dados para um programa de planilha eletrônica no formato de texto para medir a taxa inicial do trocador sódio-próton. Sete, pela captação rápida de lítio, acidifique as células e as placas de múltiplos poços pela técnica de carregamento com Imodium, conforme acabou de ser demonstrado. A seguir, lave as placas duas vezes rapidamente, conforme acabou de ser demonstrado.Em seguida, incubar as células em soluções de captação contendo de um a 10 micromolar de lítio e as concentrações desejadas do cátion ou inibidores de interesse por cerca de um minuto ou menos. Ao final do período de captação, remover cuidadosamente o meio de captação e lavar rapidamente as células quatro vezes com PBS gelado em menos de 10 segundos no total, para evitar a saída de lítio. Em seguida, lise as células em 250 microlitros de ácido nítrico a 25% por poço, durante pelo menos uma hora. Raspar cada poço com a extremidade da ponteira do pipetador ao final da incubação e transferir as suspensões de cada poço para novos tubos de microcentrífuga. Por fim, centrifugar as amostras por cinco minutos a 15.000 G em temperatura ambiente para remover os detritos celulares e, então, medir o teor de lítio do sobrenadante por espectroscopia de absorção atômica.De acordo com as instruções do fabricante, a seleção por morte por prótons baseia-se na difusão da base fraca amônio. Por exemplo, células que não expressam um trocador sódio-próton funcional na membrana plasmática não conseguem recuperar um valor de pH neutro e, portanto, exibem um aspecto típico acidificado, com formato achatado e citoplasma granular, como visto nesta imagem representativa após ciclos repetidos de seleção, células que sobrevivem plena e estavelmente. A acidificação, no entanto, forma clones celulares individuais, como visto aqui; demonstrou-se que a atividade e a seletividade iônica dos trocadores intracelulares de sódio e próton expressos na membrana plasmática podem ser caracterizadas pela medição das alterações no pH intracelular induzidas sob diversas condições experimentais, conforme observado nestes gráficos após a acidificação provocada pelo carregamento com Imodium.No que diz respeito à cinética enzimática, a resposta à dose das taxas iniciais de captação pode ser utilizada para derivar os valores da constante de afinidade para os substratos e os valores da constante de inibição para os inibidores. De fato, uma característica interessante dos transportadores é que diferentes cátions acopladores competirão pelo transporte, possibilitando a medição da constante de afinidade para o sódio por meio da competição com a captação de lítio, conforme demonstrado nesta figura seguindo este procedimento. Outros experimentos, como a BioInovação na superfície celular combinada ao silenciamento de RNA, podem ser realizados para verificar se o transportador de interesse está realmente expresso na membrana plasmática.

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Biologia

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Medindo o transporte de catiões de Na, K e H, K-ATPase em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos por espectrofotometria de absorção atômica: uma alternativa para Ensaios de Radioisótopos

A eletroporação foi usada para inserir proteínas efetoras de virulência bacteriana purificadas diretamente em células eucarióticas vivas. A localização das proteínas foi monitorada por microscopia de imunofluorescência confocal. Este método permite estudos sobre tráfego, função e interações proteína-proteína usando proteínas exógenas ativas, evitando a necessidade de expressão heteróloga em células eucarióticas.

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Os proteolipossomas são usados para estudar canais purificados e transportadores reconstituídos em um ambiente bioquímico bem definido. Um procedimento experimental para medir o efluxo mediado por essas proteínas é ilustrado. As etapas para preparar proteolipossomas, realizar os registros e analisar os dados para determinar quantitativamente as propriedades funcionais da proteína reconstituída são descritas.

A proteolipossoma-Based Efluxo Ensaio para determinar as propriedades de uma única molécula de Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canais e Transportadores

arritmias cardíacas hereditárias são geralmente causadas por mutações que alteram a entrega de superfície de um ou mais canais de íons. Aqui, nós adaptar ensaios de citometria de fluxo para proporcionar uma quantificação da expressão de proteína total e a superfície celular relativa dos canais de iões recombinantes expressas em células TSA-201.

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Caracterização funcional de Na + / H + Trocadores de intracelular compartimentos usando a Seleção Proton-matança de expressá-las na membrana plasmática (Vídeo) | JoVE Journal

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