Caracterização funcional de Na ⁺ / H ⁺ Trocadores de intracelular compartimentos usando a Seleção Proton-matança de expressá-las na membrana plasmática

O objetivo geral do experimento a seguir é medir a atividade de trocadores de prótons de sódio expressos intracelularmente. Isso é obtido selecionando primeiro as células que expressam os trocadores de prótons de sódio intracelulares na membrana plasmática por seleção de morte de prótons. Como segunda etapa, as células selecionadas são acidificadas e, em seguida, a recuperação do pH intracelular é medida para confirmar a atividade de troca de prótons de sódio das células.

A cinética rápida do transporte de íons é então medida para determinar as constantes de afinidade para o cátion transportado e os inibidores. Em última análise, o monitoramento das mudanças no pH intracelular e na cinética rápida das células somáticas selecionadas permite a caracterização funcional da troca intracelular de proteínas. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a expressão de transportadores mutantes ou o uso por células, é que ela permite a expressão de transportadores intracelulares do tipo branco na membrana plasmática, tornando possível medir diretamente sua função.

Demonstrando o procedimento estará o poeta Dr.Mallory, um cientista pesquisador do meu laboratório para iniciar o procedimento de morte de prótons. Primeiro, incubar as células que expressam o trocador de prótons de sódio intracelular de interesse na solução de carga a 37 graus Celsius e uma incubadora livre de dióxido de carbono por uma hora. Em seguida, aspire a solução de carga e lave as células duas vezes com meio fresco.

Após a segunda lavagem, aspirar o meio e incubar as células em solução de recuperação numa incubadora sem dióxido de carbono. Após mais uma hora, substitua o meio de recuperação por meio de cultura regular e faça crescer as células em condições de cultura padrão. Repetindo este ciclo de seleção duas vezes por semana até que clones estáveis surjam para obter imagens do pH de fluorescência intracelular das células.

Primeiro equipou um conjunto de imagens que consiste em um microscópio invertido acoplado a uma câmera de vídeo de alta sensibilidade com filtros de interferência de banda estreita de 450 nanômetros e 490 nanômetros emparelhados com os filtros de densidade neutra de quartzo apropriados para excitação. Se possível, use o conjunto apropriado de filtros e condições de iluminação para estabelecer valores de fluorescência comparáveis para os canais um e dois, de modo que a proporção se aproxime de um para medir a atividade direta do trocador de prótons de sódio. Em seguida, acidifique as células com uma incubação de uma hora em solução de carregamento de amônio.

Na ausência de dióxido de carbono durante os últimos cinco minutos da incubação, as células com uma proporção métrica fluorescente sensível ao pH morrem. No final do período de incubação, rin as células com solução de carga de amônio para eliminar a sonda extracelular e montar as células tingidas no microscópio. Selecione as regiões de interesse onde os valores fluorescentes serão medidos conforme apropriado.

Em seguida, registre várias imagens para estabelecer uma linha de base e perfundir as células com a solução RIN para iniciar uma queda na fluorescência. Depois que o pH se estabilizar, examine as células com a solução de interesse para medir as taxas de recuperação de pH mediadas pela troca de hidrogênio de lítio, hidrogênio de sódio ou hidrogênio de potássio. Agora examine as células com a solução de hippies suplementada com cloreto de potássio e gerina.

Em seguida, colete as medições de fluorescência das imagens e exporte os dados para um programa de planilha em formato de texto para medir a taxa inicial do trocador de prótons de sódio. Sete, pela rápida absorção de lítio, acidificam as células e placas de vários poços pela técnica de carregamento de Imodium, como acabamos de demonstrar. Em seguida, enxágue as placas duas vezes rapidamente, conforme demonstrado.

Em seguida, incube as células em soluções de captação contendo um a 10 micromolares de lítio e as concentrações desejadas do cátion ou inibidores de interesse por cerca de um minuto ou menos no final do período de captação, remova cuidadosamente o meio de captação e lave rapidamente as células quatro vezes com PBS gelado em menos de 10 segundos no total para evitar o efluxo de lítio e, em seguida, coloque as células em 250 microlitros de ácido nítrico a 25% por bem por pelo menos uma hora. Raspando cada poço com a extremidade da ponta da pipeta no final da incubação e transferindo as suspensões de cada poço para novos tubos de microcentrífuga. Finalmente, centrifugue as amostras por cinco minutos a 15.000 G à temperatura ambiente para remover os detritos celulares e, em seguida, medir o teor de lítio do snat por espectroscopia de absorção atômica.

De acordo com as instruções do fabricante, a seleção de matança de prótons é baseada na difusão da base fraca de amônio. Por exemplo, as células que não expressam um trocador de prótons de sódio funcional na membrana plasmática não podem recuperar um valor de pH neutro e, portanto, exibem um aspecto acidificado típico com uma forma plana e um citosol granular, como visto nesta imagem representativa após repetidos ciclos de seleção, células que sobrevivem de forma completa e estável. A acidificação, no entanto, forma clones celulares individuais como visto aqui, como demonstrado a atividade e seletividade iônica dos trocadores de prótons de sódio intracelulares expressos na membrana plasmática podem ser caracterizadas medindo as mudanças no pH intracelular induzidas sob várias condições experimentais, conforme observado nesses gráficos após a acidificação da carga de Imodium.

Quanto à cinética enzimática, a resposta à dose para as taxas iniciais de captação pode ser usada para derivar os valores da constante de afinidade para os substratos e para os valores da constante de inibição dos inibidores. De fato, uma característica interessante dos transportadores é que diferentes cátions de acoplamento competirão pelo transporte, produzindo a possibilidade de medir a constante de afinidade pelo sódio por competição com a absorção de lítio, conforme demonstrado nesta figura Seguindo este procedimento. Outros experimentos como BioInovação de superfície celular acoplado ao silenciamento de RNA podem ser realizados para verificar se o transportador de interesse é de fato expresso na membrana plasmática.