Name: A Volume Bioassay pequeno para avaliar Bacteriana / fitoplâncton Co-cultura utilizando água-Pulse-Amplitude Modulada (água-PAM) Fluorometria (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Aprenda a realizar bioensaio miniaturizado para triagem rápida de culturas de microalgas e identificação de interações microbianas usando fluorometria WATER-PAM. Este método avalia a saúde fotossintética do Fotossistema II.

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Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (concessão 402105), Fundação Canadense para Inovação (bolsa 129087) e Alberta Education and Training (concessão AAETRCP-12-026-SEG) para RJC.

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Os autores não têm nada a divulgar.

O crescimento de algas em um formato miniaturizado. A miniaturização de culturas de algas a um volume de 1 ml de cultura numa placa de microtitulação permite a replicação dentro de uma experiência para ser aumentado. É importante garantir a alga é saudável durante todo um experimento; executar uma curva de crescimento (Figura 2), utilizando o formato de placa de microtitulação para avaliar vários meios de algas, para garantir o cumprimento dos requisitos nutricionais da alga. A...

Fisiologia fitoplâncton tem sido tradicionalmente estudadas em experimentos meso-escala que varia de 20 ml em frascos cónicos de 5 L em garrafões 1-7. Esta escala experimental requer subsampling para o monitoramento experimental, como sacrificar amostras idênticas, para cada ponto de tempo cria uma montagem experimental incontrolável. A capacidade para aumentar o número de experiências independentes utilizando o mesmo espaço incubadora diurna ao miniaturizar o volume experimental para experiências fisiológicas algas vai reduzir ou eliminar as limitações de sub-amostragem e pseudo-replicação a partir de grandes volumes. Um formato de placa de microtitulação foi desenvolvido para bioensaios de algas, utilizando um volume de 1 ml de cultura para manipulação experimental algas em condições variáveis. Este pequeno volume experimental permite o número de repetições de ser aumentada, aumenta a reprodutibilidade experimental devido a uma menor variabilidade entre as amostras replicadas eexperiências, e permite a replicação verdadeira, mantendo controles experimentais (ou seja, culturas de algas axênicos) para 140 dias (Figura 2) 12. Este formato de placa de microtitulação é facilmente adaptado para uma variedade de questões experimentais, tais como: não uma bactéria ter uma interacção simbiótica, neutro ou patogénica com o seu hospedeiro de algas? É a adição de um composto estimulante ou tóxico para uma alga? Estas e outras questões podem ser abordadas de uma forma de alto rendimento rápido, utilizando este novo formato 9-11. Uma placa de 48 poços de cultura de microtitulação permite a cada poço 1 ml de ser uma montagem experimental independente que é amostrada num único ponto de tempo. Vários parâmetros podem ser amostrados a partir desse volume de 1 ml, incluindo, mas não limitados a: a fluorescência e os parâmetros fotoquímicos utilizando-amplitude modulada ÁGUA-Pulse (WATER-PAM) fluorometria (ver Materiais e Equipamento tabela) 13. ÁGUA-PAM fluorometria é uma técnica rápida e não-invasiva, que pode ser utilizado para monitorizar as experiências realizadas com 13 algas. Ele permite a medição da eficiência fotossintética e saúde PSII de um pequeno volume de cultura (150-300 mL de cultura diluída em meio a um 2 - Volume 4 ml de água-PAM) 14,15. Além ÁGUA-PAM fluorometria, esta configuração pode ser usada para medir uma variedade de outros parâmetros, incluindo, mas não limitados a: a microscopia para visualizar as bactérias associadas às células de algas e as alterações na morfologia de células de algas; colônia de bactérias (UFC) contagens de unidade; e citometria de fluxo para a contagem de células de algas e as subpopulações de identificação.

<table><tbody><tr><td>10 pés cúbicos Incubadora diurna (6012-1)</td><td>Caron Corporate</td><td>112310-6012-1-11</td><td><a href="http://www.caronproducts.com">www.caronproducts.com</a></td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask 25 cm2, Vent/Close Cap, volume de trabalho de 7 ml, 200/cs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N156340</td><td><a href="http://www.fishersci.ca">www.fishersci.ca</a></td></tr><tr><td>Placas TC multipoços - Material</td> de <td>Laboratório de Descoberta BD Biosciences</td> de 48 poços <td>353078</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com/">www.bdbiosciences.com</a></td></tr><tr><td>P1000 Gilson The Pipetting Standard&mdash; Pipetman</td><td>Mandel de Gilson Scientific Company Inc.</td><td>GF-F123602</td><td><a href="http://www.mandel.ca">www.mandel.ca</a></td></tr><tr><td>P10mL Gilson O Padrão de Pipetagem &mdash; Pipetman</td><td>Mandel de Gilson Scientific Company Inc.</td><td>GF-F161201</td><td><a href="http://www.mandel.ca">www.mandel.ca</a></td></tr><tr><td>Wide Orifício Pontas não estéreis [100&ndash; 1.250 &micro; l]</td><td>VWR International</td><td>89079-468</td><td><a href="http://www.ca.vwr.com">www.ca.vwr.com</a></td></tr><tr><td>Pontas ultrafinas não estéreis [100&ndash; 1.250 &micro; l]</td><td>VWR International</td><td>89079-470</td><td><a href="http://www.ca.vwr.com">www.ca.vwr.com</a></td></tr><tr><td>Finntip 10 ml [Vol: 1 - 10 ml]</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9402151</td><td><a href="http://www.fishersci.ca">www.fishersci.ca</a></td></tr><tr><td>WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED)</td><td>Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Alemanha</td><td>EDEE0232</td><td><a href="http://www.walz.com">www.walz.com</a></td></tr> <tr><td>cubeta de vidro de quartzo de 15 mm de diâmetro (WATER-K)</td><td>Caron Corporate</td><td></td><td><a href="http://www.caronproducts.com">www.caronproducts.com</a></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (ACS cristalino/certificado), Fisher Chemical</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td><a href="http://www.fishersci.ca"> www.fishersci.ca</a></td></tr><tr><td>BD Difco Caldo Marinho 2216</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com">www.bdbiosciences.com</a></td></tr><tr><td>BD Bacto Agar</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com">www.bdbiosciences.com</a></td></tr><tr><td>Kit Médio L1, 50 L</td><td>NCMA [Centro Nacional de Algas Marinhas e Microbiota</td><td>NCMA [Centro Nacional de Algas Marinhas e Microbiota</td><td><a href="http://www.ncma.bigelow.org">www.ncma.bigelow.org</a></td></tr></tbody></table>

a volume bioassay pequeno para avaliar bacteriana / fitoplâncton co-cultura utilizando água-pulse-amplitude modulada (água-pam) fluorometria

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry

Os métodos convencionais para manipulação experimental de microalgas têm empregado grandes volumes de cultura (20 ml a 5 L), de modo que a cultura pode ser sub-amostrado ao longo da experiência 1-7. A subamostragem de grandes volumes pode ser problemática por várias razões: 1) que provoca variação no volume total e a área superficial: proporção em volume da cultura durante a experiência; 2) pseudo-replicação (isto é, a partir de duplicados de amostras ao mesmo balão de tratamento 8) é muitas vezes utilizados em vez de repetições verdadeiras (isto é, a amostragem de tratamentos replicados); 3) A duração da experiência é limitado pelo volume total; e 4) culturas axênicas ou a microbiota bacteriana normal são difíceis de manter, durante experimentos de longa duração como a contaminação geralmente ocorre durante subamostragem. A utilização de placas de microtitulação permite volumes de 1 ml de cultura a serem utilizados para cada replicado, com até 48 tratamentos separados dentrouma placa de 12,65 cm x 8,5 x 2,2, diminuindo desse modo o volume e permitindo experimental para replicação extensiva subamostragem sem qualquer tratamento. Além disso, esta técnica pode ser modificado para caber uma variedade de formatos, incluindo: experimentais bacteriana-co-culturas de algas, algas, exames de fisiologia e toxina de rastreio 9-11. Pode ser amostrado poços individuais com uma alga, bactéria e / ou co-culturas para numerosos procedimentos laboratoriais, incluindo, mas não limitados a: ÁGUA-Pulse-amplitude modulada (WATER-PAM) fluorometria, microscopia, colónia bacteriana forming unit (ufc) condes e citometria de fluxo. A combinação do formato de placa de microtitulação e água-PAM fluorometria permite múltiplas medições rápidas de rendimento fotoquímico e outros parâmetros fotoquímicos com baixa variabilidade entre as amostras, de alta reprodutibilidade e evita as muitas armadilhas de subamostragem um garrafão ou erlenmeyer sobre o curso de um experimento .

Leituras fluorometria WATER-PAM. ÁGUA-Pulse-Amplitude Modulada (PAM) fluorometria é um método rápido e eficiente para determinar a fluorescência (um proxy para o teor de clorofila) e produção fotossintética (saúde PSII) de culturas de algas. O software PAM WinControl gera uma planilha de valores de dados em bruto para (a seguir estão os parâmetros básicos para escuras adaptado amostras de algas): F 0 = fluorescência das células de adaptação ao escuro ...

O objetivo deste procedimento é demonstrar a reprodutibilidade e adaptabilidade do uso de um formato de placa de microtitulação para triagem de microalgas. Esta tela rápida combina fluorometria WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) para medir o rendimento fotossintético como um indicador da saúde do fotossistema II (PSII) com co-culturas de pequenas bactérias e algas.

A Volume Bioassay pequeno para avaliar Bacteriana / fitoplâncton Co-cultura utilizando água-Pulse-Amplitude Modulada (água-PAM) Fluorometria

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be ...

O objetivo geral do seguinte experimento é apresentar um bioensaio algal miniaturizado destinado à triagem rápida de culturas de algas, com o intuito de identificar simbioses microbianas ou patógenos que possam influenciar a saúde ou a fisiologia da cultura algal. Isso é alcançado primeiramente pela preparação de misturas controle de algas e bactérias com meio de cultura, além da preparação de culturas experimentais de algas e bactérias em co-cultivo em várias concentrações. A próxima etapa consiste em preparar placas de 48 poços com alíquotas das misturas para um ensaio rápido, robusto e replicável.Em seguida, as placas são incubadas e monitoradas por meio de fluorometria de amplitude modulada por pulso, que realiza medições que indicam a saúde fotossintética do sistema. Os resultados desse experimento de curso temporal revelam um efeito patogênico, simbiótico ou neutro das bactérias sobre as algas. Telas adicionais de pequeno volume também podem ser aplicadas durante o experimento de curso temporal.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos convencionais que utilizam grandes volumes em bioensaios com algas é que o bioensaio miniaturizado permite o uso de pequenos v

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Este artigo descreve métodos diferentes de...

Co-cultura de Modelos Pseudomonas aeruginosa Biofilmes Grown no Live Células Airway Humanos

O ensaio descreve um meio rápido de medir a formação de biofilme no início de bactérias e fungos. Este método utiliza uma placa de microtitulação, como o substrato para formação de biofilme microbiano, e do biofilme é visualizada utilizando cepa cristal violeta. O ensaio fornece tanto um ensaio qualitativo ou quantitativo para a formação de biofilme cedo.

Dish microtitulação Assay formação de biofilme

Fonte: Weber, N. et. al., Transformação Natural, Expressão de Proteínas e Crioconservação da Cianobactéria Filamentosa Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra um ensaio focado baseado em LED para estudar fototaxia em cianobactérias filamentosas. As bactérias migram em direção à fonte de luz, formando um acúmulo denso no centro iluminado, que é visualizado e quantificado por meio da análise da intensidade de pixels da imagem capturada.

Ensaio de fototaxia de cianobactérias filamentosas usando iluminação de luz focalizada

Este vídeo demonstra um ensaio para triagem de compostos antimicrobianos que eliminam biofilmes com eficiência usando uma placa de pino. A metodologia monitora o estado metabólico do biofilme após o tratamento com compostos antimicrobianos, facilitando a determinação da concentração mínima de erradicação do biofilme.

Um ensaio de biofilme de placa de Peg para triagem de agentes antibacterianos

Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para avaliar a disponibilidade de nutrientes orgânicos e inorgânicos e a abundância e estrutura das comunidades microbianas e virais em ambientes marinhos remotos.

Desvendando os jogadores invisíveis no Oceano - Um Guia de Campo para Química da Água e Microbiologia Marinha

Um ensaio de todo Bioreporter celular com Burkholderia sartisoli RP037-MCHE foi desenvolvido para detectar frações de um contaminante orgânico (ou seja, fluoreno) disponível para a degradação bacteriana após o transporte ativo por micélio ponte poros cheios de ar em um sistema modelo insaturada água.

Uma Abordagem Bioreporter celular todo avalie Transportes e biodisponibilidade de contaminantes orgânicos em água insaturadas Sistemas

Este artigo descreve o processo de montagem e operação de um biorreator fotossintético de bench-scale que pode ser usado, em conjunto com outros métodos, para estimar os parâmetros de crescimento cinético pertinentes. Este sistema monitora continuamente o pH, a luz e a temperatura usando sensores, uma unidade de aquisição e controle de dados e software de aquisição de dados de código aberto.

Construção e configuração de um Bioreactor Fotossintético Algal com Escala de Banco com Monitoramento de Temperatura, Luz e pH para testes de crescimento cinético

Citometria de fluxo em combinação com o cluster visual oferece um método fácil de usar e rápido para o estudo de biofilmes aquáticos. Pode ser usada para a caracterização do biofilme, detecção de mudanças na estrutura da comunidade de biofilme e detecção de partículas abióticas incorporado no biofilme.

Caracterização de biofilmes aquáticos com citometria de fluxo

Esta publicação descreve o desenho de fotobioreatores laboratoriais (PBRs) com regimes de luz personalizáveis. O crescimento de cianobactérias ou microalgas, usando bicarbonato como fonte de carbono, é monitorado continuamente pela medição da produção volumétrica de oxigênio. Esses PBRs facilitam comparações rápidas e replicadas de crescimento laboratorial com pouca intervenção do usuário durante os experimentos.

Operação de Fotobioreatores laboratoriais com Medições de Crescimento Online e Regimes de Luz Personalizáveis

Fluorometer de taxa de repetição rápida (FRRf) é um método benéfico para medir fotofilosiologia fotossiológica II e produtividade primária. Aqui descrevemos um protocolo para medir a fotofisiologia PSII de algas epizoicas, Colacium sp. em zooplâncton substrato usando FRRf tipo cuvette.

Medindo fotofisiologia do estágio anexado de Colacium sp. por um fluorômetro de taxa de repetição rápida do tipo cuvette

O protocolo introduz um método de alta produtividade para medir o relaxamento da extinção não fotoquímica por fluorometria modulada de clorofila modulada de pulso. O método é aplicado ao max glycine cultivado em campo e pode ser adaptado a outras espécies para testar a diversidade genética ou populações de reprodução.

Análise de alta produtividade da extinção não fotoquímica nas culturas usando fluorometria modulada de clorofila modulada de pulso

Aprenda a realizar bioensaio miniaturizado para triagem rápida de culturas de microalgas e identificação de interações microbianas usando fluorometria WATER-PAM. Este método avalia a saúde fotossintética do Fotossistema II.

A Volume Bioassay pequeno para avaliar Bacteriana / fitoplâncton Co-cultura utilizando água-Pulse-Amplitude Modulada (água-PAM) Fluorometria (Vídeo) | JoVE Journal

A Volume Bioassay pequeno para avaliar Bacteriana / fitoplâncton Co-cultura utilizando água-Pulse-Amplitude Modulada (água-PAM) Fluorometria

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