Name: Investigando única molécula de adesão de Força Atômica Spectroscopy (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprenda a acoplar polímeros individuais à ponta de microlâminas AFM usando PEG como ligante para espectroscopia de força. Este método reduz interações inespecíficas e permite medições precisas de adesão molecular em superfícies sólidas.

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Os autores agradecem à DFG (Hu 997/2-2) pelo apoio financeiro. FS reconhece a Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr foi apoiado pelo Elitenetzwerk Bayern no âmbito do programa de doutorado Ciência dos Materiais de Interfaces Complexas. SKi agradece ao SFB 863 pelo apoio financeiro.

NOTA: Consulte a Figura 2 para uma visão geral do fluxo do processo que compreende a preparação, as etapas de aquisição de dados e análise de dados. 1. Instalação do Reagente NOTA: Todos os produtos químicos devem ser manuseados com cuidado, e, portanto, um jaleco, luvas e proteção para os olhos devem ser usados. Todas as operações devem ser realizadas numa hote de laboratório. Em particular, as luvas especiais devem ser usados ​​em caso de utilização de clorofórmio. <ol><li> Use produtos químicos com baixo teor de água, tais como clorofórmio seca rapidamente e armazenar seco, mas não mais de uma semana. Armazenar os produtos químicos a -20 ° C e sob atmosfera de azoto ou árgon no estado gasoso, porque APTES ((3-aminopropil) triethoxysilan) (ver Tabela 1) e PEG (polietilenoglicol) são higroscópicos e PEG é sujeito a oxidação no ar. </li><li> Para evitar a exposição freqüente do estoque de oxigênio atmosférico e umidade, preparar alíquotas menores, de preferência dentro de um sistema de porta-luvas com uma atmosphe nitrogêniore. </li></ol> 2. Preparação do Equipamento NOTA: Para evitar uma possível contaminação cruzada, use vasos frescas e limpas para cada etapa. <ol><li> Limpa vidros e uma pinça em solução detergente durante 30 minutos num banho de ultra-sons a 60 ° C. </li><li> Enxágüe e equipamentos sonicate do passo 2.1 duas vezes com água ultrapura. </li><li> Equipamento de calor a partir do passo 2.1 em solução RCA (água ultrapura, peróxido de hidrogénio e amoníaco (5: 1: 1)) a 75 ° C num forno durante 45 minutos e, subsequentemente, lavar com água ultrapura. </li><li> Finalmente, secar os utensílios de vidro e pinças sob uma corrente de azoto seco ou num forno (100 ° C, 3 h). </li></ol> 3. Dica funcionalização NOTA: Use uma pinça, navios, etc. feita a partir de aço inoxidável, PTFE, vidro ou qualquer outro material que seja quimicamente estável em soluções orgânicas, se aplicável. Salvo disposição em contrário, realizar todas as etapas em RT. A quantidade de solução de incubação necessário depende do número de fichas de cantilever. Certifique-se de que as consolas estão imersos nas respectivas soluções em todos os tempos. NOTA: Use um capuz para evitar a inalação de vapores orgânicos. <ol><li> A formação de grupos OH na superfície do cantilever (&quot;activação&quot;) (aproximadamente 0,5 horas): <ol><li> Use uma pinça para colocar fichas frescos cantilever (materiais: o pecado, constante da mola: 10-100 PN / nm) sobre uma lâmina de vidro limpa e colocá-los em uma câmara de plasma (100 W). </li><li> Evacuar câmara (~ 0,1 mbar). </li><li> Flood câmara com gás oxigênio e evacuar novamente. </li><li> Ative o processo de plasma (poder: 20%, duração: 15 min, a pressão do processo: 0,25 mbar). </li></ol></li><li> Amino-silanização de consolas (aproximadamente 1 hr): <ol><li> Prepare os 2,5 ml de solução de APTES (ver Tabela 1) numa placa de Petri de vidro - fazer isso idealmente durante o processo de plasma. </li><li> Immediately após o processo de plasma, mergulhe cada cantilever por 1 segundo em acetona e colocá-los logo em seguida na solução APTES. </li><li> Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Cuidadosamente lavar os chips cantilever duas vezes em 10 ml de acetona e uma vez com 10 ml de clorofórmio. </li><li> Opcionais etapa final: fichas Lugar cantilever a partir da etapa anterior em uma lâmina de vidro limpa e asse por 30 minutos a 70 ° C. Note-se que também existem estratégias alternativas para a ativação de superfície, por exemplo, o tratamento UV 12. </li></ol></li><li> PEGuilação (aproximadamente 2 horas): NOTA: Execute as operações de 3.3.1-3.3.4 durante amino-silanização. NHS e grupos maleimida estão sujeitas a hidrólise em ambientes aquosos e PEG em si é sujeito a oxidação no ar. Portanto, o tempo (em especial entre as etapas) é um parâmetro crítico. Consulte a 13 para obter mais informações. <ol><li> Preparar a solução de clorofórmio (ver Tabela 1). </li><li> Para evitar a condensação, Quente PEG pulveriza até RT antes de abrir a alíquota e pesando a quantidade apropriada. </li><li> Para o acoplamento de polímeros ou de lípidos com grupos amino, resolver separadamente NHS-PEG-NHS (6 kDa) e metil-PEG-NHS (5 kDa) em solução de clorofórmio com vortex até que eles estão completamente resolvido. Consulte a Tabela 1 para concentrações. <ol><li> Alternativamente. para o acoplamento de polímeros com grupos tiol resolver separadamente NHS- PEG-Mal e metil-PEG-NHS em solução de clorofórmio. </li></ol></li><li> Misturar as soluções como necessária para ajustar uma determinada relação entre o número ou o NHS- maleimide- e as moléculas de PEG terminado em metilo (tipicamente 1: 500). Note-se que a proporção ideal tem de ser determinada de forma iterativa em uma série de ciclos de preparação-experimentais. </li><li> Incubar fichas cantilever na solução de PEG durante 1 hora num ambiente saturado de clorofórmio para evitar a evaporação do clorofórmio. </li></ol></li><li> Sonda conjugação molécula(&gt; 1 hora): NOTA: No seguinte 3.4.1-3.4.3, três exemplos para o acoplamento covalente de diferentes moléculas sonda para a ponta do AFM são descritos. Para cada molécula do protocolo tem de ser ajustada. Além disso, note, que no exemplo 1 e 3 do SNS-química é utilizada ao passo que no exemplo 2, o polímero funcionalizado tiol PI-g-PS é acoplado ao PEG por meio de maleimida-química. Para mais detalhes ver 14. <ol><li> Para poli (aminoácido) poli-D-tirosina (40-100 kDa) <ol><li> Dissolver o polytyrosine conjugado molécula sonda em NaOH 1 M. Ajustar a concentração de 1 mg / ml. </li><li> Troque o NaOH para tampão de borato de sódio (pH 8,1), utilizando colunas de spin dessalinização (7 kDa MWCO) imediatamente antes da funcionalização </li><li> Lavar as consolas primeiro com 5 ml de clorofórmio, em seguida, com 5 ml de etanol e finalmente com 5 ml de tampão de borato. </li><li> Incubar os chips cantilever durante 1 hora na solução tampão polytyrosine borato e depois enxaguar com tampão boratoe água ultrapura. Guarde em água ultrapura até que a medição. </li></ol></li><li> Para polímeros com uma espinha dorsal linear (poli-isopreno, 119 kDa), que tem cadeias laterais enxertadas (poliestireno, 88 kDa) 14 <ol><li> Dissolve-se o PI- g -PS em clorofórmio seco. Ajustar a concentração da solução de conjugação a 4 mg / ml. </li><li> Lavar as consolas com 5 ml de clorofórmio e incubar durante pelo menos 1 h na solução de conjugação. </li><li> Lavar novamente em 5 ml de clorofórmio e armazenar em clorofórmio num ambiente saturado-clorofórmio (para evitar a evaporação clorofórmio) até que a medição. </li></ol></li><li> Para o Papa lipídico <ol><li> Dissolver PAPA em clorofórmio seco. Ajustar a concentração para 20 mM. </li><li> Lavar as consolas com 5 ml de etanol e 5 ml de água ultrapura antes da incubação das consolas de 1 h na solução de lípidos. </li><li> Após a incubação, lavar consolas com 5 ml de clorofórmio, 5 ml de etanol e 5 ml de, água ultrapura quente (por esta ordem) para remover moléculas de sonda não ligados e se livrar de resíduos de clorofórmio. Use dicas funcionalizados imediatamente. Alternativamente, armazená-los em clorofórmio até ser necessário. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig1.jpg" /> Figura 1. (A) esquemático, mostrando o processo de funcionalização ponta usando o exemplo de NHS química. Ligação (B) Chemical empregada para anexar uma molécula sonda para a ponta através de um grupo amino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Preparação 4. Superfície <ol><li> Auto-montado monocamada (SAM) NOTA: Como a superfície para o primeiro exemplo, uma monocamada auto-montada foi escolhido. Consulte a literatura 15 </sup&gt; para mais detalhes. <ol><li> Lâminas de vidro limpas com uma solução de detergente e em seguida, duas vezes em água ultrapura num banho de ultra-sons durante 30 min cada. Em seguida, como um passo adicional de limpeza, colocá-los na solução de RCA (ver passo 2.3) a 75 ° C durante 15 min. </li><li> Brasão as lâminas com 10 níquel cromo nm e 100 nm de ouro em um coater vácuo. Então guarde na geladeira e limpo novamente na solução RCA diretamente antes da próxima etapa. </li><li> Incubar as lâminas do passo anterior em 2 mM de solução de 1-dodecanthiol / etanol durante 12 horas. Os grupos tiol que se ligam a superfície de ouro e uma monocamada auto hidrofóbico monta. Lavar as lâminas com etanol e água ultrapura e depois seco por uma corrente de azoto gasoso. Confirme a hidrofobicidade da superfície preparada com medidas de ângulo de contato estáticos em um goniômetro com uma câmera CCD de 10. </li></ol></li><li> Hydrogen diamante encerrado NOTA: Como uma superfície para o segundo exemplo, um diamante terminada hidrogénio foi escolhido. A preparação da superfície foi realizada como descrito anteriormente 16. </li><li> Bicamada lipídica Compatível NOTA: No último exemplo, uma superfície apoiada bicamada lipídica (SLB), foi utilizado como uma superfície. Para obter uma tal superfície, uma solução (0,1 mg / ml) de vesículas unilamelares grandes (LUV), contendo o fosfolipido POPC foram formados pelo método de extrusão. Em seguida, 50 ul da solução LUV foram colocadas sobre uma folha de mica clivada de fresco (A = 1 cm) e incubadas durante 30 min. Finalmente a solução foi lavada com 20 ml de água ultrapura. Veja 17,18 para uma descrição detalhada da preparação do SLBS. </li></ol> 5. Aquisição de Dados NOTA: Para os experimentos, use um AFM, que oferece a capacidade de medir em líquidos. Os procedimentos de aquisição de dados e análise de dados são aplicáveis ​​independentemente do modelo de AFM usado. Além disso, em algumas experiências, é vantajoso ter a possibilidade de controlar a temperature líquido no interior da célula. Cantilever deflexão foi detectado através do método de deflexão do feixe de laser 19. Constantes de flexão foram determinados com o método térmico ruído 20. <ol><li> Inserir o braço de suporte funcionalizado em um suporte de AFM cantilever que é adequado para a medição de fluidos. </li><li> Colocar a superfície (preparação ver acima) para ser amostrada na AFM e cobri-lo com o líquido. Ambos, o braço de suporte e a superfície deve agora ser imerso no líquido com a ponta cantilever que aponta na direcção da superfície. Note-se que, em muitos casos, uma gota de líquido é suficiente. Em qualquer caso, a evaporação do fluido deve ser evitado, por exemplo, usando uma célula de fluido em circuito fechado. </li><li> Se for o caso, ajustar a temperatura desejada no controlador. </li><li> Deixar o sistema equilibrar durante pelo menos meia hora. </li><li> Gravar um espectro de ruído térmico do cantilever com o cantilever longe a partir da superfície, a fim de excluir quaisquer efeitos de amortecimento superfície. Note-se que geralmente 10 ou mais espectros têm de ser acumulados para obter uma razão sinal-para-ruído suficiente. </li><li> Aproxime-se da superfície. Note-se que, a fim de conservar a geometria da ponta e ponta funcionalização o processo de abordagem tem de ser realizada com cuidado. Isto pode ser conseguido através de, por exemplo, aproximando-se em modo de contacto intermitente. </li><li> Determinar a sensibilidade inversa óptica alavanca (InvOLS) medido em nm / volt. Para fazer isso, empurrando a ponta cantilever contra uma superfície dura. <ol><li> Determinar os InvOLS medindo a inclinação da distância do curso de piezo versus a mudança na tensão fotodiodo. Unir a parte da curva de força-distância, em que a ponta do braço de suporte se encontra em contacto com a superfície. Em experimentos envolvendo uma superfície macia como bicamadas lipídicas, realizar esta etapa em áreas que não são cobertas com uma bicamada lipídica (&quot;pontos de defeitos&quot;). </li></ol></li><li> Determinar a constante da mola (pN / nm) por montagem de um oscilador de harmónica do espectro de ruído térmico. Usofunção de software automatizado para a primavera determinação constante; caso contrário, consultar a literatura 20. </li><li> Iniciar a experiência. <ol><li> Curvas numerosos força-recorde distância em cada condição experimental. Normalmente, usar os seguintes valores para os parâmetros experimentais: Taxa de amostragem de 5 kHz, velocidade de ponta de 1 mm / s, retrair distância de 1 m. NOTA: Por vezes, dependendo da dinâmica do experimento estudado, pode ser necessário esperar uma certa quantidade de tempo com a sua extremidade em contacto com a superfície (&quot;Tempo paragem&quot;). NOTA: O experimento parâmetros específicos pode desviar-se substancialmente dos valores indicados acima. </li><li> Durante a medição a longo prazo, de zero a posição do laser sobre o fotodíodo de tempos a tempos, reposicionando o fotodiodo. </li><li> Opcional: Depois de cada curva de força, mudar o local da AFM-ponta para outra posição xy. </li><li> No final da experiência, determinam a sensibilidade e a mola CONSTAnt novamente para verificar a consistência e estabilidade do sistema. NOTA: Comparando a constante da mola e sensibilidade antes e depois da experiência é também um meio para assegurar que as propriedades do sistema e as propriedades da ponta permaneceu inalterada ao longo do curso do experimento. Se a diferença das constantes de mola não é demasiado grande (&lt;= 15%), que pode ser calculada a média, uma vez que a incerteza intrínseca da mola determinação constante é também cerca de 15%. Para diferenças maiores, é aconselhável primeiro encontrar e eliminar a causa para a constante de mola aparente mudança antes de prosseguir com mais experiências. </li></ol></li></ol> 6. Data Preparation NOTA: Nesta seção geral etapas de preparação de dados que são tipicamente realizadas independente do tipo específico de experiência para converter unidades de Newton e nanométrica, bem como para corrigir os dados são descritos. As análises de dados específicos da experiência estão briefly descrito mais abaixo na respectiva seção exemplo representativo. <ol><li> Normalmente, realizar toda a preparação e análise de dados passos automaticamente por um algoritmo de home-escrita, por exemplo, com base no software IGOR Pro 6. </li><li> Converter o sinal de deflexão raw (Defl) [V] em vigor, multiplicando-o com os InvOLS [nm / V] e primavera constante [nN / nm]. </li><li> Compensar a força de tal forma que a força sobre o braço de suporte de uma distância suficiente da superfície (cantilever descarregada) torna-se 0 nN. </li><li> Calcula-se a posição real da ponta (também chamado de separação, quando medido em relação à superfície) z *, o que leva a flexão do braço de suporte em conta: <img alt="Equação 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52456/52456eq1.jpg" /></li><li> Deslocamento z *, de tal maneira que z * = 0 corresponde à posição z da superfície. NOTA: Aqui, F é a força que actua sobre a ponta e, por conseguinte, curvaé o braço de suporte (determinado no passo 6.2.), z é a posição medida do sensor z (determinado directamente pelo instrumento) e o símbolo k representa a constante da mola (determinado no passo 5.8). </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig2.jpg" /> Figura 2. Processo de diagrama de fluxo mostrando a preparação da amostra, a aquisição de dados e análise dos dados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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<li>Ebner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalization+of+probe+tips+and+supports+for+single-molecule+recognition+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+current+chemistry%22%5BJournal%5D)">Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy.</a> Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).</li>
<li>Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Adhesion+at+the+Solid-Liquid+Interface+Probed+by+a+Single-Molecule+Force+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor.</a> Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).</li>
<li>Morfill, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-matured+recombinant+antibody+fragments+analyzed+by+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy.</a> Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Durante as últimas décadas, os experimentos única molécula ter fornecido informações sem precedentes sobre mecanismos moleculares e acabou por ser uma abordagem de valor inestimável em ciências da vida e além. Para alcançar bons e estatísticas significativas de experiências SMFS, de preferência uma e a mesma molécula é usado ao longo de todo o decurso da experiência. Em contraste com as experiências com conjuntos de moléculas, as experiências SMFS são capazes de detectar eventos raros e estados moleculares escondidos. O...

Ao longo dos últimos 30 anos, microscopia de força atômica (AFM) acabou por ser uma técnica valiosa imagem para estudar biológicos 1,2 e sintéticas 3 materiais e superfícies, uma vez que fornece resolução espacial molecular em todas as três dimensões e pode ser operado em vários solvente ambientes. Além disso, a força molécula espectroscopia AFM-single (SMFS) permite medir forças que vão desde o PN a μN regime e deu uma visão sem precedentes por exemplo em proteína dobrar 4,5, física polímero 6-8, e interação molécula de superfície única 9 - 12 .A lógica por trás estudar moléculas individuais, em vez de um conjunto de moléculas é para evitar efeitos que muitas vezes mascaram eventos raros ou estados moleculares escondidos em média. Além disso, um grande número de parâmetros moleculares, tais como o comprimento do contorno, o comprimento Kuhn, a energia livre de adesão, etc., podem serobtida. Este é detalhado nos exemplos abaixo. Numa experiência típica AFM-SMFS, a molécula de sonda é acoplada a uma ponta muito afiada através de uma molécula ligante. A ponta em si está localizado na extremidade de um braço de suporte flexível. Se a ponta é colocada em contacto com a superfície da molécula de sonda irá interagir com esta superfície. Observando-se a deflexão do braço de suporte à retracção da ponta, a força, e, por conseguinte, a energia livre, para separar a molécula de superfície pode ser determinada. Para obter estatísticas significativas, um grande número de chamadas curvas força-distância tem que ser adquirido. Além disso, para ter verdadeiros experimentos única molécula (isto é, utilizando uma e a mesma molécula sonda ao longo da duração de todo o experimento) a molécula sonda deve ser acoplado de forma covalente à ponta de AFM. Aqui, um protocolo experimental para a funcionalização cantilever com uma única molécula através de uma ligação covalente é apresentado. A única molécula ou pode ser acoplada por via de um grupo amino ou um tiol grupo para a ponta do AFM. O processo de conjugação pode ser realizada numa ampla variedade de solventes orgânicos e aquosos () para ter em conta as propriedades de solvatação dos polímeros usados. Na primeira parte, um protocolo geral para ligar covalentemente uma molécula única (&quot;molécula sonda&quot;) através de uma molécula ligante de uma ponta de AFM é descrito. Para este fim, NHS- orgânico ou maleimida-química é utilizado 13. Junto com o protocolo por três moléculas de exemplo, os processos de aquisição de dados e análise de dados são descritos e referências para leitura são fornecidos. Os exemplos de moléculas são: o (linear) tirosina polímero, o polímero de enxerto PI- g -PS e o PAPA lipídica. Isto inclui ligeiras variações do protocolo, por exemplo, para ligar covalentemente cisteínas. Além disso, uma secção dedicada à preparação de superfícies diferentes, tais como uma superfície de diamante, um CH3 montado -auto-monocamada e bicamadas lipídicas. Essas interfaces tem proven ser boas referências e exemplos.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiais</td></tr><tr><td>Hellmanex III concentrado líquido alcalino (solução detergente)</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RCA (água ultrapura, peróxido de hidrogênio (35%), amônia (32%); 5:1:1(v/v/v))Reagente</td> <td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectabond / APTES (3-Aminopropil)trietoxissilano</td><td>Vectorlabs Acetona</td><td></td><td></td></tr><tr><td>seca (< 50 ppm H2O)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio seco (> 99,9%)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água ultrapura</td><td>Biochrom, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetraborato dissódico (>&nbsp; 99,5%)</td><td>Biochrom, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Biochrom, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monofuncional &alfa;-metoxi-&ômega;-NHS PEG, 5 kDa, " metil-PEG-NHS"</td><td>Rapp, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifuncional &alpha;,&omega;-bis-NHS PEG, 6&nbsp; kDa, " NHS-PEG-NHS"</td><td>Rapp, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifuncional &alfa;-maleimidohexanoico-&omega;-NHS PEG, 5 kDa, " Mal-PEG-NHS"</td><td>Rapp, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Molécula de sonda (polímero, lipídio, etc.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipamento</td></tr><tr><td>Quantidade suficiente de pratos cristalizantes de vidro com bico (10&nbsp; ml), placas de Petri de vidro (500 &micro; l) e tampas de vidro</td><td>VWR International GmbH, Alemanha</td><td></td><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Forno de laboratório modelo UF30</td><td>Memmert, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicador com temperatura controlada</td><td>VWR International GmbH, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de plasma "Femto", 100 W</td><td>Diener, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uma seringa de vidro separada para cada solvente orgânico</td><td>VWR International GmbH, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex misturador</td><td>VWR International GmbH, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (0,5 ml ou 1,5 ml)</td><td>Pipetas Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: 10-100 &micro; l, 50-200 e micro; l e 100-1.000&nbsp; &micro; l</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM com célula de fluido com temperatura controlada (por exemplo MFP-3D com BioHeater)</td><td>Asylulm Research, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soft SiN cantilevers cantilevers, normalmente feitos de nitreto de silício (SiN) (constante de mola inferior a 100 pN/nm, e.g. MLCT)</td><td>Bruker AXS, Santa Bárbara</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

investigando única molécula de adesão de força atômica spectroscopy

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Espectroscopia de força atômica é uma ferramenta ideal para estudar moléculas em superfícies e interfaces. Um protocolo experimental para acoplar uma grande variedade de moléculas individuais de forma covalente para uma ponta de AFM é apresentado. Ao mesmo tempo, a ponta de AFM é passivado para evitar interacções não específicas entre a ponta e o substrato, o que é um pré-requisito para estudar moléculas individuais ligados à ponta de AFM. As análises para determinar a força de adesão, o comprimento de aderência, e a energia livre destas moléculas em superfícies sólidas e bio-interfaces são pouco apresentados e referências externas para leitura são fornecidos. Exemplos são as moléculas a polytyrosine poli (aminoácidos), o polímero de enxerto PI- g -PS e o PAPA fosfolípido (1-palmitoil-2-oleoyl--sn-glicero-3-fosfoetanolamina). Estas moléculas são dessorvida a partir de diferentes superfícies como CH 3 -SAMs, hidrogénio terminada diamante e suportado bicamadas lipídicas sob várias condições do solvente. Finalmente, ovantagens da força espectroscópicas experiências de moléculas individuais são discutidas, incluindo meios para decidir se verdadeiramente uma única molécula tem sido estudada no experimento.

No que se segue, os resultados para o exemplo acima descrito, ou seja, a moléculas polytyrosine polímeros de poli (aminoácidos), o polímero de enxerto PI- g -PS e o PAPA fosfolípido, são apresentados. Primeiro para cada exemplo, experimentar detalhes específicos para a aquisição de dados e preparação de dados são fornecidos. Em seguida, os resultados exemplares para experimentos onde essas moléculas foram dessorvidas de superfícies diferentes (CH3 -SAMs, hidrogênio encerrado diamante e lipídios bicam...

< class = 'jove_content '> Um protocolo para acoplar uma grande variedade de moléculas individuais covalentemente em uma ponta AFM é apresentado. Procedimentos e exemplos para determinar a força de adesão e a energia livre dessas moléculas em suportes sólidos e bio-interfaces são fornecidos.

Investigando única molécula de adesão de Força Atômica Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

O objetivo geral deste procedimento é acoplar um único polímero à ponta de uma alavanca de AFM para realizar quatro experimentos espectroscópicos de dessorção superficial com as mesmas moléculas, repetidamente. Isso é alcançado primeiramente ativando a superfície da ponta por plasma, a fim de formar grupos hidroxila como segundo passo. A ponta da alavanca é silanizada com grupos amino por meio de uma solução de ensaio ascendente, que forma grupos amino na superfície da ponta.O terceiro passo é acoplar moléculas de polietilenoglicol aos grupos amino. Eles impedem interações inespecíficas entre a ponta e o substrato e atuam como moléculas espaçadoras para os polímeros. Por fim, os polímeros são conjugados às moléculas de polietilenoglicol para formar uma sonda.As medições sugerem que este procedimento realmente torna possível usar um mesmo sonda de força polimérica para um conjunto experimental completo, ou igualmente, para muitas centenas de curvas força-distância. As principais vantagens dos experimentos de molécula única em relação aos métodos de ensemble são que conformações raras e estados infrequentes podem ser estudados, os quais, de outra forma, estariam ocultos na média do e

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Research

JoVE Journal

Engineering

Engenharia

Um ensaio de freqüência de adesão para medir cinética de interação receptor-ligante, quando ambas as moléculas estão ancoradas nas superfícies das células que interagem é descrito. Este ensaio mecanicamente baseado é exemplificado usando uma micropipeta pressurizado glóbulo vermelho humano como sensor de adesão e integrinas αLβ2 e molécula-1 de adesão intercelular como interagindo receptores e ligantes.

Ensaio de aderência de freqüência para In Situ Análise Cinética de Cross-juncional interações moleculares na interface célula-célula

Os celulossomos são complexos multienzimáticos projetados para digerir celulose. O SMFS baseado em AFM foi usado para estudar as propriedades mecânicas e a configuração de dobramento de conjuntos de proteínas associadas ao celulossomo. Apresentamos um fluxo de trabalho completo para imobilização de proteínas, aquisição de dados e análise de dados para estudar as interações de complexos receptor-ligante individuais envolvidos na montagem do celulosomo.

Investigando Sistemas receptor-ligante do Celulossoma com base-AFM única molécula Força Espectroscopia

A nanoscopia de sonda coloidal pode ser usada em uma variedade de campos para obter informações sobre a estabilidade física e a cinética de coagulação de sistemas coloidais e auxiliar na descoberta de medicamentos e ciências de formulação usando sistemas biológicos. O método descrito fornece um meio quantitativo e qualitativo para estudar tais sistemas.

O exame quantitativo e qualitativo dos Interações partícula-partícula coloidal Usando Probe Nanoscopia

Aqui apresentamos um protocolo para medir a força das interações entre uma superfície inorgânica bem definida e tanto peptídeos ou aminoácidos por única molécula de medidas de espectroscopia de força utilizando um microscópio de força atômica (AFM). As informações obtidas a partir da medição é importante para entender melhor a interfase material de peptídeo-inorgânico.

Insights sobre as interações de aminoácidos e peptídeos com Materiais Inorgânicos Usando Single-Molecule Força Spectroscopy

Descrevemos os procedimentos detalhados e estratégias para medir as propriedades mecânicas e mecânicas vias desdobramento de moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica. Também mostramos resultados representativos como uma referência para a seleção e a justificativa de gravações de molécula de proteína única boa.

Espectroscopia de força das moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica

Este protocolo descreve a imobilização covalente de proteínas com um heterobifunctional agente de acoplamento silano para superfícies de óxido de silício projetado para a espectroscopia de força força atômica microscopia com base única molécula que é exemplificado a interação de RrgA (adesina pilus-1 ponta de S. pneumoniae) com fibronectina.

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

Aqui, apresentamos um protocolo para conjugar o monômero proteico por enzimas que formam polímero de proteína com uma sequência controlada e imobilizá-lo na superfície para estudos de espectroscopia de força de molécula única.

Síntese Enzimática Mediada oOAEP1 e Imobilização de Proteína Polimerizada para Espectroscopia de Força De Molécula Única

A fixação covalente de moléculas de sondas às pontas de cantilever da microscopia de força atômica (AFM) é uma técnica essencial para a investigação de suas propriedades físicas. Isso nos permite determinar a força de alongamento, a força de dessorção e o comprimento dos polímeros através da espectroscopia de força de molécula única baseada em AFM com alta reprodutibilidade.

Ligação covalente de moléculas únicas para espectroscopia de força baseada em AFM

A espectroscopia de força de conjunto (EFS) é uma técnica robusta para desdobramento mecânico e detecção em tempo real de um conjunto de estruturas biomoleculares em campos biofísicos e de biossensoriamento.

Espectroscopia de Força de Ensemble por Forças de Cisalhamento

Descreve-se a preparação de pontos quânticos coloidais com minimizada tamanho hidrodinâmico para uma única molécula de imagens de fluorescência. Em comparação com os pontos convencionais quântica, estas nanopartículas são semelhantes em tamanho às proteínas globulares e são optimizadas para uma única molécula de brilho, estabilidade contra a fotodegradação, e resistência a ligação não específica a proteínas e células.

Compactas pontos quânticos para uma única molécula de imagem

Aprenda a acoplar polímeros individuais à ponta de microlâminas AFM usando PEG como ligante para espectroscopia de força. Este método reduz interações inespecíficas e permite medições precisas de adesão molecular em superfícies sólidas.

Investigando única molécula de adesão de Força Atômica Spectroscopy

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