Investigando única molécula de adesão de Força Atômica Spectroscopy
27 de fevereiro de 2015
O objetivo geral deste procedimento é acoplar um único polímero a uma ponta cantilever A FM para fazer quatro experimentos espectroscópicos de dessorção de superfície com uma das mesmas moléculas várias vezes. Isso é conseguido primeiro pelo plasma ativando a superfície da ponta para formar grupos hidroxila como um segundo passo. A ponta do cantilever é amino siloizada por uma solução de teste ascendente, que forma grupos amino na superfície da ponta.
O terceiro passo é acoplar moléculas de polietilenoglicol aos grupos amino. Eles evitam interações inespecíficas entre a ponta e o substrato e servem como moléculas ligantes para os polímeros. Finalmente, os polímeros são conjugados às moléculas de polietilenoglicol para formar uma sonda.
As medições sugerem que este procedimento realmente torna possível usar uma e a mesma sonda de força de polímero para um conjunto experimental completo, ou da mesma forma, muitas centenas de curvas de distância de força. As principais vantagens dos experimentos de molécula única sobre os métodos de conjunto é que confirmações raras e estados pouco frequentes podem ser estudados, que de outra forma estariam ocultos na média do conjunto. Devido ao seu pequeno tamanho, esses experimentos podem ser comparados diretamente às simulações dinâmicas moleculares.
O primeiro passo é anexar covalentemente as moléculas da sonda à ponta do cantilever. Comece com nitreto de silício fresco. Chips cantilever, empregam chips com uma constante de mola de 10 a 100 pico newtons por nanômetro.
Use uma pinça para colocá-los em uma lâmina de vidro limpa ou placa de Petri. Em seguida, coloque a lâmina com os chips em uma câmara de plasma de 100 watts após evacuar a câmara e lavá-la com oxigênio operado a 0,25 milibar e 20 watts por 15 minutos. Nas próximas etapas, use um capuz para evitar a inalação de vapores orgânicos durante o processamento do plasma.
Prepare-se para a amino siloização dos cantilevers em uma placa de Petri de vidro, colocada 2,5 mililitros de solução de teste. Além disso, repare um vaso contendo acetona. Recupere os cantilevers imediatamente após a conclusão do processamento do plasma.
Mergulhe cada cantilever em acetona por um segundo e, em seguida, coloque-o na solução Optus. Incube os cantilevers por 15 minutos em temperatura ambiente antes de prosseguir. À medida que os cantilevers incubam, comece a preparação para o peguilação de modo a minimizar os efeitos da água e do ar nos componentes.
Comece com tubos eph previamente preparados, um contendo m peg, NHS e o outro corante. Estaca do NHS. Determine o peso do conteúdo de cada tubo.
Em seguida, trabalhe com o tubo contendo EG NHS e prepare-se para adicionar clorofórmio. Despeje o clorofórmio até atingir uma concentração final de 25 milimolares e solução suficiente para cobrir os cantilevers nas etapas subsequentes. Coloque o tubo em um misturador de vórtice para garantir que o pó se dissolva.
Coloque o tubo com o EG NHS de lado para trabalhar com a dieta. Estaca do NHS. Adicione um clorofórmio para atingir uma concentração final de 0,25 milimolar.
Use um misturador de vórtice para garantir que o pó seja dissolvido. Em seguida, misture as soluções para ajustar a proporção entre as moléculas de NHS da dieta e as moléculas de metil peg NHS. Essa proporção é normalmente de um para 500.
Obtenha uma pequena placa de Petri de vidro com tampa para limitar a evaporação e encha-a com a mistura como balanço. Termine a incubação. Na solução de teste APT, tenha dois recipientes com cerca de 10 mililitros de acetona e um com clorofórmio pronto para enxaguá-los.
Mergulhe cada um deles na acetona duas vezes e uma vez em clorofórmio e coloque-os na solução de polietilenoglicol. Cubra o prato e mantenha os balanços na solução. Durante uma hora, preparar o acoplamento covalente de uma molécula de sonda, neste caso o poliaminoácido poli de tirosina.
Comece com o volume de um hidróxido de sódio molar dissolvido neste, a molécula da sonda a uma concentração de um miligrama por mililitro. Para poli D tirosina, troque o hidróxido de sódio por oito a 8,5 pH de sódio. Oito buffer imediatamente antes da funcionalização.
À medida que os cantilevers completam sua incubação em solução de polietilenoglicol, prepare três recipientes para enxaguá-los e um recipiente com o furo de politirosina. A solução tampão oito para enxágue é de cinco mililitros de clorofórmio, cinco mililitros de etanol, cinco mililitros do tampão do furo. Use cerca de 300 microlitros da solução tampão de furo de politirosina.
Recupere os cantilevers e mergulhe cada um primeiro no clorofórmio, depois no etanol e, em seguida, no tampão do furo oito. Antes de colocá-los na politirosina, dê oito soluções tampão. Deixe os chips cantilever incubarem por uma hora após uma hora de prontidão, cerca de cinco mililitros de tampão de bate em um recipiente e cinco mililitros de água ultrapura em outro para enxaguar os cantilevers também têm 20 mililitros de água ultrapura para armazená-los.
Pegue os cantilevers e mergulhe cada um no tampão Boite, seguido de água ultrapura para enxaguar. Em seguida, mergulhe-o em água ultrapura para armazenamento. Os cantilevers agora podem ser usados para aquisição de dados.
Depois que a ponta A FM estiver funcionalizada e uma superfície tiver sido preparada e montada, inicie as etapas para uma aquisição de dados FM. Primeiro coloque o cantilever funcionalizado em um suporte de cantilever A FM adequado para medição em líquidos. Em seguida, conecte o suporte cantilever ao cabeçote A FM.
Prossiga despejando água na célula de fluido para imergir o cantilever e a superfície. Em seguida, abaixe a cabeça A FM na célula líquida. Deixe o sistema se equilibrar por pelo menos meia hora.
Após o equilíbrio. Posicione o cantilever longe da superfície e, em seguida, registre espectros de ruído térmico 10 ou mais espectros são necessários para obter uma relação sinal-ruído suficiente para excluir os efeitos de amortecimento da superfície. Em seguida, aproxime-se cuidadosamente da superfície para fazer uma medição da sensibilidade inversa da alavanca óptica.
Isso envolve empurrar a ponta do cantilever contra uma superfície dura para registrar a força versus a distância de deslocamento do pizo. Meça a inclinação durante o contato e inverta-a para determinar a sensibilidade inversa da alavanca óptica. Em seguida, a sensibilidade inversa da alavanca óptica e os espectros de ruído térmico Determine a constante de mola do cantilever encaixando um oscilador harmônico no espectro de ruído térmico.
Agora defina os parâmetros apropriados para a coleta de dados. Registre várias curvas de distância forçada para cada condição experimental no final da coleta de dados. Determine a sensibilidade e a constante da mola novamente, para verificar a consistência e estabilidade do sistema.
Este exemplo de um traço de distância forçada em vermelho é da retração de politirosina de uma água impura monocamada auto-montada de metila. A força de queda de passo único para zero indica o desprendimento de uma única molécula. O ajuste sigmoidal é mostrado em preto.
O comprimento do platô extraído e a força do platô são indicados com setas. A velocidade de retração da extensão do cantilever foi de 0,5 mícrons por segundo, e o tempo de permanência na superfície foi de um segundo. Diferentes ambientes líquidos para a medição causaram alterações na força de platô extraída.
Esses histogramas refletem a força de platô extraída para medições em água pura e medições em água. Misturas de etanol de pelo menos 300 traços de distância de força foram registrados para cada solução com um no mesmo polímero único. Aqui, histogramas análogos são mostrados para o comprimento do platô extraído para misturas de etanol em água pura e em água.
A adição de etanol enfraquece a interação hidrofóbica entre a politirosina e a superfície, levando a uma menor força de platô e uma diminuição no comprimento do platô. Isso é resumido nesta placa de comprimento de pico de platô versus força de pico de platô. Uma vez dominado, o protocolo de funcionalização pode ser feito em cerca de quatro horas após o desenvolvimento.
Essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da física e da química explorarem a adesão de infração de polímeros em interfaces.
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Visão Geral
Este protocolo detalha a ligação de polímeros individuais à ponta de uma alavanca de microscópio de força atômica (AFM) para experimentos espectroscópicos de dessorção superficial. Ele descreve os passos necessários para preparar a ponta e fixar moléculas de polietilenoglicol, que atuam como ligadores para os polímeros.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biofísica
- Química de Superfície
- Nanotecnologia
Antecedentes
- A microscopia de força atômica (AFM) é utilizada para análise de superfície.
- O acoplamento covalente de moléculas aumenta a especificidade nas medições.
- O polietileno glicol (PEG) é comumente usado para reduzir interações inespecíficas.
- A compreensão das forças de adesão é fundamental para diversas aplicações nas ciências dos materiais e na biologia.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para fixar moléculas individuais em pontas de microscopia de força atômica (AFM).
- Facilitar experimentos espectroscópicos repetidos com as mesmas moléculas.
- Aprimorar a precisão das medições de força de adesão em suportes sólidos.
Métodos Utilizados
- Ativação por plasma da superfície da ponta do MFA para introduzir grupos hidroxila.
- Silanização amino da ponta para criar grupos amino.
- Acoplamento de moléculas de polietilenoglicol aos grupos amino.
- Conjugação de polímeros às moléculas de PEG para formar uma sonda funcional.
Resultados Principais
- Demonstrou-se a fixação bem-sucedida de polímeros em pontas de AFM.
- Conseguiu-se a redução de interações inespecíficas utilizando ligantes PEG.
- Forças de adesão e medições de energia livre foram realizadas de forma eficaz.
- O método permite múltiplos experimentos com a mesma configuração molecular.
Conclusões
- O protocolo fornece uma abordagem versátil para o acoplamento molecular em pontas de AFM.
- Ele aumenta a confiabilidade dos estudos de interação em superfícies.
- Este método pode ser aplicado a diversos tipos de moléculas e superfícies.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A espectroscopia de força atômica em nível de molécula única permite a quantificação direta das forças de adesão molecular em biointerfaces, auxiliando na redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. Esta abordagem fornece dados quantitativos de alta resolução sobre interações moleculares, contribuindo para a validação de alvos e aumentando a confiança preditiva em portfólios de P&D da indústria biofarmacêutica. A capacidade de isolar e medir repetidamente eventos moleculares individuais aprimora a confiabilidade da tomada de decisões nas fases iniciais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a medição direta da adesão molecular, esclarecendo os mecanismos de interação no nível de única molécula.
- Apóia a validação funcional de alvos ao distinguir eventos de ligação específicos de eventos não específicos.
- Fornece dados quantitativos de força e energia para orientar modelos preditivos e triagem de alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Facilita a preparação de sondas passivadas e funcionalizadas para ensaios reprodutíveis de molécula única.
- Permite a geração de centenas de curvas força-distância por sonda, apoiando a padronização robusta do ensaio.
- Fornece saídas quantitativas (força de adesão, comprimento, energia livre) para avaliação confiável de compostos ou superfícies.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha dados de interação molecular com biointerfaces relevantes para doenças, garantindo continuidade translacional.
- Apóia o avanço ajustado ao risco ao fornecer subsídios mecanicistas sobre adesão molecular em condições fisiologicamente relevantes.
- Permite a comparação do comportamento molecular em diferentes ambientes solventes e superfícies.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta, desde a verificação inicial de hipóteses até o desenvolvimento de ensaios e seleção de modelos pré-clínicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a quantificação de interações moleculares específicas e mecanismos de adesão.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis para avaliação da prontidão do ensaio e de compostos.
- Análises: Gera curvas força-distância e distribuições estatísticas para comparação robusta de condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Relaciona dados de adesão molecular com a relevância em biointerfaces, apoiando o alinhamento de biomarcadores quando aplicável.
- Reutilização Empresarial: Oferece um protocolo padronizado adaptável a diversas moléculas e superfícies, com ampla utilidade em P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Fornece medições padronizadas, reprodutíveis e escaláveis em nível de molécula única.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou não avançar e a eficiência do capital ao fornecer dados moleculares de alta resolução no início do processo.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de candidatos com base em métricas quantitativas de adesão.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em operação de AFM e espectroscopia de força em nível de molécula única.
- Exige acesso a instrumentação especializada e infraestrutura analítica para aquisição e análise de dados.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes nos protocolos de funcionalização de sondas e de medição.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes sistemas moleculares ou químicas de superfície.
- Limitações práticas incluem produtividade e a necessidade de controle cuidadoso de interações não específicas.
