Geração de Murino Marcapasso Cardíaco Agregados célula com base na ES-Cell-Programação em combinação com Myh6-Promotor-Seleção

O objetivo geral deste procedimento é gerar células nodais sinusais altamente puras. Isso é feito primeiro induzindo a diferenciação celular, modificando o meio e fazendo gotas suspensas que resultam na formação de corpos embrionários de tamanho definido. Em seguida, os corpos embrionários são assentados em um prato revestido de gelatina para formar uma camada de células.

Em seguida, a seleção de antibióticos é iniciada e apenas os cardiomiócitos sobrevivem. Finalmente, a camada celular é dissociada para obter células nodais sinusais únicas de batimento rápido ou pequenos corpos nodais sinusais. Em última análise, a imagem de células vivas é usada para mostrar altas frequências de batimentos das células nodais sinusais.

A principal vantagem desse método é que você pode produzir células nodais sinusais altamente puras, por exemplo, para testes de drogas. O método pode nos ajudar a responder a perguntas-chave na doença do nó sinusal porque as células nos darão insights sobre os mecanismos subjacentes. A tecnologia será apresentada no laboratório por Julia Yung, nossa aluna de doutorado que desenvolveu o método, começando com uma linha de células ES e células-tronco pluripotentes co-cultivadas com células alimentadoras irradiadas, conforme descrito no protocolo de texto, dois dias antes do procedimento de diferenciação remover as PSCs das células alimentadoras aspirando primeiro o meio.

Use 10 mililitros de PBS para lavar as células. Em seguida, adicione sete mililitros de solução de colagenase quatro e incube as células por 10 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, coloque um filtro estéril de 40 micrômetros em um tubo de 50 mililitros.

Em seguida, enxágue cuidadosamente as colônias de PSC pipetando a solução de colagenase para cima e para baixo cinco vezes. Transfira a suspensão da célula para o filtro e use oito mililitros de PBS para enxaguar o filtro três vezes. Em seguida, vire o filtro e coloque-o de cabeça para baixo em uma placa de Petri e pipete 10 mililitros de PBS no fundo do filtro.

Para remover as colônias de PSC, agora transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros e centrifugue por cinco minutos a 300 vezes. G. Remova o PBS, suspenda as células em um mililitro de Accutane e incube a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, adicione 10 mililitros de PBS.

Misture a solução celular pipetando para cima e para baixo cinco vezes e centrifugue por cinco minutos a 300 vezes G.Uma vez que o PBS é removido, use 10 mililitros de meio de cultivo celular para ressuspender as células e determinar o número de células semente. 15.000 células por centímetro quadrado em um frasco de filtro de 75 centímetros quadrados e cultive-as por dois dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono quando o frasco deve ser 50 a 70% confluente. Após a colheita das células e suspensão do Resus em meio de diferenciação de acordo com o protocolo de texto, pipetar 20 mililitros de água e cinco mililitros de gota suspensa ou solução HD em uma placa de Petri quadrática para evitar o ressecamento do hds.

Em seguida, pipete até 50 mililitros de suspensão celular em uma bandeja. Em seguida, vire a tampa da placa de Petri e, usando uma pipeta de 12 canais, coloque 180 HDS, cada um contendo 20 microlitros de suspensão de células na tampa. Vire cuidadosamente a tampa e coloque-a na placa de Petri.

Depois de incubar por dois dias, para permitir que as células formem ebs, vire cuidadosamente a tampa da placa de Petri quadrática e transfira o EBS derivado de duas placas de Petri para um tubo de 50 mililitros. Aguarde 10 minutos para deixar o EBS assentar no fundo do tubo e, em seguida, aspire o máximo de meio possível. Use 10 mililitros de meio de diferenciação para suspender o EBS e transfira a suspensão para uma placa de Petri de 10 centímetros.

Uma vez que as células tenham sido cultivadas em suspensão por quatro dias, de acordo com o protocolo de texto, transfira o EBS para uma placa de cultura de células de 10 centímetros quadrados revestida com gelatina e incube nos próximos dois a seis dias sob um microscópio, verifique as células quanto a focos de batimento e a formação de uma camada de células três dias após as células terem começado a bater, aspire o meio e adicione 10 mililitros de diferenciação fresca. Meio contendo 400 microgramas por mililitro de G quatro 18 para as células quatro dias depois. Remova cuidadosamente o meio sem aspirar a camada celular.

Em seguida, adicione 10 mililitros de PBS para lavar as células. Depois de remover cuidadosamente o PBS, adicione 10 mililitros de solução de colagenase quatro e transfira as células para um tubo de 50 mililitros. Em seguida, depois de incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos, misture vigorosamente a suspensão pipetando para cima e para baixo 10 vezes e incube as células a 37 graus Celsius por mais cinco minutos.

Uma suspensão de pequenos clusters deve estar presente. Em seguida, adicione 20 mililitros de PBS e centrifugue por 10 minutos a 300 vezes. G, aspire cuidadosamente o PBS e se gerar corpos sino atriais induzidos ou sabs, use 12 mililitros de meio de diferenciação contendo 400 microgramas por mililitro de G quatro 18 para Resus, suspenda as células e veja dois mililitros cada em seis poços de uma placa revestida de gelatina de 24 poços para gerar células nodais únicas em vez de adicionar meio de diferenciação.

Depois de remover o PBS, use cinco mililitros de Accutane para suspender as células e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos. Pipete para cima e para baixo vigorosamente. Misture a suspensão após incubação a 37 graus Celsius por cinco minutos.

Adicione 20 mililitros de PBS e centrifugue por cinco minutos a 300 vezes G com 12 mililitros de diferenciação. Meio contendo G quatro 18. Suspenda as células e veja dois mililitros cada em seis poços de uma cultura de placa revestida de gelatina de 24 poços e realize a análise das células de acordo com o protocolo de texto.

Usando o protocolo demonstrado neste vídeo, o isab S pode ser gerado a partir de células-tronco pluripotentes com uma frequência de batimento de cerca de 450 batimentos por minuto, como visto aqui após a dissociação do isab S. As células individuais observadas mostram as formas típicas das células do nó sinusal que inclui células fusiformes e aranhas. Essas células apresentam altos níveis de expressão de proteínas essenciais para a função do nó sinusal, como o cátion dependente de nucleotídeos cíclicos ativado por hiperpolarização. Canal quatro, HCN quatro, conexão quatro, cinco, conexão 30.2 e MYH seis.

Quando tratadas com o bloqueador de canais ZD 7 2 88, ou o agonista do receptor muscarínico caracol, as células derivadas de isab exibem uma frequência de batimento significativamente reduzida. O agonista do receptor beta adrenal isopreno, por outro lado, leva a uma frequência elevada de batimentos. No geral, nossa técnica abrirá caminho para entender melhor a funcionalidade e as doenças do marcapasso cardíaco.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar células nodais sinusais totalmente funcionais a partir de células-tronco potentes de PLU.