Tridimensional modelo de co-cultura para Interaction Tumor estromal-

O objetivo geral deste procedimento é investigar as interações celulares entre células de câncer de pulmão e fibroblastos associados ao câncer por meio de um método de co-cultura tridimensional. Isso é realizado por meio da cultura primária de fibroblastos humanos associados ao câncer de pulmão a partir de tecido pulmonar coletado, que é cortado em pedaços de um milímetro. O segundo passo é preparar géis de colágeno incorporados com fibroblastos, misturando uma solução de colágeno utilizando as células trypsin eyes e transferindo para uma placa de seis poços para gelificação.

Em seguida, células de adenocarcinoma pulmonar são semeadas sobre a superfície de cada gel para preparar um co-cultivo tridimensional de células cancerígenas e fibroblastos, e o gel é separado da borda do poço para gerar um cultivo flutuante. O passo final consiste em realizar o cultivo na interface ar-líquido e o ensaio de invasão, expondo os géis contraídos ao ar ao colocá-los sobre uma malha posicionada em uma placa de seis poços. Por fim, exames histológicos são utilizados para avaliar a invasão das células cancerígenas e alterações morfológicas.

A principal vantagem deste procedimento em relação a métodos existentes, como o cultivo em monocamada bidimensional, é que as interações multicelulares podem ser investigadas em cultivo tridimensional de condição. Este procedimento inicia-se com o cultivo primário de fibroblastos a partir de tecido pulmonar coletado, conforme descrito e referenciado no protocolo textual. Neste vídeo, são utilizados pulmões de camundongo em vez de tecido de câncer pulmonar humano.

Coloque a amostra de tecido pulmonar em uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros sem meio de cultura. Corte o tecido em pequenos fragmentos de aproximadamente um milímetro de tamanho utilizando pinça estéril e bisturi. Durante este processo, evite que o fragmento fique seco, caso contrário, a eficiência da migração celular será prejudicada. Posicione os pequenos fragmentos de tecido pulmonar separados uns dos outros, mantendo uma área vazia ao redor de cada peça.

Faça arranhões na superfície da placa de cultura de tecidos usando uma lâmina de bisturi. Alternativamente, a cobertura com fragmentos de tecido aumenta a eficácia da migração celular e da propagação celular após várias passagens. Primeiro, coloque graxa de silicone em dois pontos, separados por 1,5 centímetro, em cada poço.

Em seguida, coloque os pedaços de tecido picado individualmente no centro de cada poço. Depois, fixe a lamínula à superfície da placa usando graxa de silicone. Adicione cuidadosamente o meio de cultura ao recipiente ou placa de seis poços antes que os fragmentos de tecido sequem.

O crescimento celular eficiente é perdido em grande parte. Se as amostras secarem, não despeje o meio muito rapidamente para evitar a dessacoplamento das seções de tecido para a formação de gel de colágeno. Lave os fibroblastos com solução salina tamponada com fosfato uma vez ou PBS e adicione tripsina para destacar as células em crescimento após a tripsinização por aproximadamente cinco minutos.

A 37 graus Celsius, desprenda as células utilizando nove mililitros de DMEM suplementado com 10% de FBS, colete as células suspensas no meio em um tubo de 10 mililitros e centrifugue-as a 200 a 300 ×g para formar pellets celulares. Suspenda os pellets resultantes em FBS 100% com uma densidade de meio milhão de células por mililitro. Resfrie os reagentes, pipetas e tubos para a preparação do gel de colágeno em uma geladeira antes da preparação do gel de colágeno.

Em seguida, prepare o gel de colágeno misturando vigorosamente a suspensão de fibroblastos em colágeno tipo I A em FBS, DMEM 5X e tampão de reconstituição, pipetando com cuidado para garantir uma mistura homogênea e evitando a formação de bolhas durante o processo de pipetagem. Em seguida, adicione três mililitros da mistura a cada poço de uma placa de seis poços e deixe gelificar no incubador a 37 graus Celsius, sem perturbação, por 30 a 60 minutos, para o cultivo de células cancerígenas sobre o gel de colágeno Resus. Suspenda as células cancerígenas no meio de co-cultura 3D numa densidade de um vezes 10 à quinta células por mililitro.

Coloque cuidadosamente dois mililitros da solução suspensa de células de adenocarcinoma pulmonar A549 sobre a superfície de cada gel. Modifique o número de células cancerígenas ou de fibroblastos em co-cultura conforme as condições experimentais para realizar a contração do gel. Incube os géis durante a noite a 37 graus Celsius para que as células cancerígenas adiram ao gel de colágeno.

Em seguida, desprenda cada um e gere uma cultura flutuante em cada poço. Da placa de seis poços, utilize uma agulha inclinada de 21 gauge ou uma espátula pequena para separar cada gel da borda do poço a cada dois a três dias. Renove os poços com dois mililitros de meio de co-cultura 3D.

Meça o tamanho de cada gel todos os dias durante cinco dias. Por fim, consulte o protocolo em texto para análise do gel de colágeno. Após cultivar os géis de colágeno a 37 graus Celsius por cinco dias.

Exponha os géis contraídos ao ar colocando-os sobre uma malha. Em novas placas de seis poços, faça a malha a partir de filtros celulares comercialmente disponíveis utilizados para citometria de fluxo. Encha cuidadosamente cada poço com 11 mililitros de meio de co-cultura tridimensional.

Posicione os géis sobre a malha usando uma colher estéril e remova todo o meio remanescente dos géis nesta condição. Os géis ficam submersos no meio, enquanto a superfície superior do gel fica exposta ao ar. Defina esta condição de cultivo como interface ar-líquido.

Este método de co-cultivo que imita o microambiente tumoral é uma ferramenta útil para investigar as interações entre células cancerígenas e fibroblastos incorporados em géis de colágeno. Células A549 foram co-cultivadas em um gel de colágeno contendo fibroblastos, e a camada de células A549 foi exposta ao ar colocando-se o gel sobre uma malha em meio de cultura. É mostrada aqui uma imagem representativa do gel colocado sobre a malha em um poço de uma placa de seis poços, para análises histológicas com hematoxilina, eosina e eoin.

A coloração de cortes transversais de um gel cultivado tridimensionalmente revelou a invasão de células 5 49 no gel de colágeno incorporado com fibroblastos associados ao câncer de pulmão. Após este procedimento, outros métodos, como expressão gênica ou silenciamento gênico, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a função específica de um gene na interação tumor-estroma.