Acompanhando Rato Medula Óssea monócitos In Vivo

O objetivo geral deste procedimento é visualizar o tráfego de monócitos na medula óssea do crânio de um camundongo vivo usando imagens de dois fótons. Primeiro, o camundongo é anestesiado e injetado com uma solução de podridão, rumina dextrana para rotular a vasculatura. O mouse é então colocado em um suporte de metal personalizado e o couro cabeludo da parte de trás do osso parietal até o osso frontal é removido.

Um anel de borracha é então aplicado diretamente no crânio com cola cirúrgica e os reservatórios preenchidos com solução salina líquida. Finalmente, a microscopia multifóton é usada para rastrear o desenvolvimento de células fluorescentes ao longo do tempo na medula óssea do crânio. Isso pode ajudar a responder a uma questão-chave no campo da imunohematologia, como o mecanismo de mobilização de monócitos no estado estacionário ou após a quimioterapia.

Portanto, este método pode fornecer informações sobre o comportamento dos monócitos modulares. Também pode ser aplicado para estudar outros subconjuntos de células da medula óssea, dependendo da especificidade do repórter de gripe usado. O protocolo a seguir utiliza um microscópio multifóton acoplado a um laser de cristal de safira de titânio e um modulador operacional para controle de potência do laser.

Para permitir a gravação simultânea de três canais fluorescentes, a configuração deve incluir três detectores externos de varredura não DS ou nds com uma combinação de espelhos dicróicos de 565 nanômetros e 690 nanômetros, filtros passa-banda de 565, 610 nanômetros e 500 550 nanômetros e um filtro passa-curta de 485. Observe que, nesta configuração, a geração de segundo harmônico ou SHG e a proteína fluorescente ciano ou CFP são detectadas pelo NDD após o filtro passa-curto 485. O CFP também é detectado pelo NDD.

Após o filtro de passagem de banda 500 550 e Rod Domine Dextran é detectado pelo NDD. Após o filtro passa-banda 565 610, várias horas antes da imagem defina a câmara de aquecimento para 32 graus Celsius. Essa temperatura manterá o mouse em uma temperatura corporal ideal durante todo o experimento.

Observe que a câmara de aquecimento usada aqui é escura e cobre as objetivas e a placa motorizada do sistema. Isso ajuda a evitar a contaminação por luz externa. Para ligar o sistema primeiro, ligue o laser de safira de titânio e, em seguida, ligue o restante do sistema de microscópio.

Inicie o software de aquisição. Aqui, o software Zeiss Zen é usado. Defina a faixa de comprimento de onda do laser para 870 nanômetros.

Em seguida, selecione o NDD apropriado para gravação. O camundongo usado neste experimento é um camundongo transgênico chamado Mac blue, que expressa a proteína fluorescente ciano sob o controle do promotor do receptor CSF one. O método de anestesia recomendado depende da duração da imagem, por isso é melhor consultar o documento que acompanha para obter detalhes.

Um aspecto difícil deste procedimento é a injeção da veia T, uma vez que é bastante fácil perder a veia. Se isso acontecer, execute a injeção retroorbital. Assim que o mouse estiver anestesiado, use pinças para verificar se há inconsciência, estimulando a almofada do pé. Próximo.

Para corar a vasculatura, injete 200 microlitros de dextrano de domina de bastonete na veia da cauda ou para coloração de neutrófilos. Injete 100 microlitros de solução salina contendo LY seis GPE. Após a injeção, coloque a cabeça do camundongo entre as placas de retenção de um suporte estereotáxico feito sob medida adaptado ao microscópio e ao inalador de gás anestésico.

Isso garante que os movimentos respiratórios não afetem a imagem. Aperte as placas de retenção para esticar a pele entre as orelhas e a cabeça. Verifique a estabilidade.

Ao pressionar suavemente a cabeça com pinças, a cabeça não deve se mover. Em seguida, certifique-se de que o animal esteja respirando normalmente. Para preparar o mouse para imagens de dois fótons, use um dedo para aplicar etanol a 70% no cabelo do couro cabeludo, tomando cuidado para evitar os olhos.

Em seguida, coloque uma cortina com um recorte para expor o couro cabeludo. Em seguida, usando tesouras e pinças estéreis, corte a pele e remova totalmente o couro cabeludo da parte de trás do osso parietal até o osso frontal. Mantenha uma distância de três milímetros dos olhos e ouvidos para evitar sangramento extenso.

Remova o tecido conjuntivo solto ou periósteo que cobre o crânio. Em seguida, usando uma toalha de papel quente embebida em PBS, lave o cabelo restante conforme mostrado aqui. Usando uma agulha de calibre pequeno, aplique cola cirúrgica em toda a periferia de um anel de borracha de 10 milímetros de diâmetro.

Em seguida, coloque o anel de borracha diretamente no crânio com outra toalha de papel embebida em PBS. Limpe o interior do anel uma última vez. Adicione PBS quente para mergulhar completamente o crânio.

Em seguida, coloque o suporte estereotáxico sob a objetiva. Uma vez que o mouse esteja no lugar, use a ocular do microscópio com transmissão direta para visualizar o crânio e posicione-o aproximadamente no campo de visão do microscópio. No canto superior esquerdo da janela do software de imagem, clique em aquisição ao vivo.

Uma varredura ao vivo do tecido aparecerá no meio da janela usando o controle direcional do microscópio no software. Localize uma região com CFP e sinal de domine de haste para ajustar o foco. Em seguida, defina a potência do laser para o mínimo para obter a melhor relação sinal-ruído com o mínimo de danos fotográficos.

Em seguida, no software, clique na guia do canal e aumente a potência de ganho nos PMTs para cada NDD para reduzir o branqueamento e os danos da foto e, em seguida, clique na guia apropriada para definir as configurações de aquisição para digitalização única com um tempo de permanência de pixel de 1,58 microssegundos e uma resolução de 512 por 512 pixels com uma ampliação de 1,5. Uma vez definidos os parâmetros de gravação, clique no comando de aquisição ao vivo e pesquise o tecido para escolher um campo x, y, Z desejado para ser monitorado em tempo real. Aqui, um campo que inclui áreas vasculares e parenquimatosas é escolhido.

Ao lado para salvar ou registrar as coordenadas X, Y, Z do campo mostrado na aba de posições. Clique em adicionar. Repita esse processo com até três campos adicionais para registrar todas as coordenadas de interesse.

As coordenadas aparecerão na guia de posições ao lado para instruir o software. Para capturar uma pilha de imagens de três DZ, clique em mover para na guia de posições do software para ir para a primeira posição registrada e selecione Zack na caixa superior esquerda do software. Isso abrirá a guia da pilha Z, moverá para a posição Z mais alta e ajustará a potência do laser de acordo.

Clique em definir por último e vá para a posição mais profunda. Ajuste a potência do laser. Em seguida, clique em definir primeiro.

A espessura da pilha analisa deve ser adaptada rapidamente à célula estudada. As células em movimento sairão do francês rapidamente, então você precisará adquirir uma pilha mais grossa. Então você adquire para células de movimento lento.

Na caixa superior esquerda, selecione o comando de série temporal para abrir a guia de série temporal. Defina o número de ciclos e o intervalo de tempo. Aqui, um volume será adquirido a cada 30 segundos por 60 ciclos.

Isso representa 30 minutos em tempo real. Para iniciar a imagem de lapso de tempo na janela principal, selecione iniciar experimento durante todo o procedimento, continue monitorando o animal para garantir que ele esteja inconsciente. Certifique-se também de que o objetivo esteja devidamente imerso.

Depois que a sequência for capturada, use uma pipeta para adicionar PBS quente. Em seguida, comece uma segunda aquisição de 30 minutos. Se o desaparecimento progressivo do sinal for observado durante a aquisição, verifique se há vazamento de PBS.

Uma vez que todos os vídeos necessários são gravados, realizada a análise de dados conforme descrito no documento anexo para estudar a fisiologia da medula óssea por imagens intravitais, um camundongo transgênico Mac blue foi injetado com 2 milhões de dextranos de domina de bastonete Dalton e fotografado por microscopia de varredura a laser de dois fótons. Conforme demonstrado neste vídeo, na micrografia resultante, a vasculatura corada com 2 milhões de dextranos de domina de bastonete de Dalton é mostrada em osso vermelho, mostrada em azul é visualizada pela segunda geração harmônica. Os monócitos positivos para ECFP mostrados no ciano estão localizados dentro dos nichos parenquimatosos, que são vistos como áreas escuras entre a vasculatura e o osso, e dentro dos vasos.

Para calcular a trajetória celular individual, foi realizada uma imagem de lapso de tempo. Este vídeo mostra o comportamento migratório dos monócitos parenquimatosos. O sinal ECFP está em ciano e os caminhos migratórios para cada mancha vermelha aparecem em verde.

Aqui, o comportamento migratório dos monócitos vasculares pode ser visto. Esses dados podem ser usados para calcular a velocidade média e o deslocamento quadrado médio das células. Observe que os monócitos vasculares exibem deslocamento aumentado e velocidade aumentada em comparação com os monócitos parenquimatosos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rastrear monócitos da medula óssea de camundongos in vivo usando duas imagens fotográficas após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de imunologia explorarem a migração e interação celular na medula óssea, que representam um local muito importante de hematopoiese, mas também outras funções fundamentais, como priming de antígenos e memória imunológica.