Análise dos efeitos de células estromais no recrutamento de leucócitos de Fluxo

O objetivo geral deste procedimento é examinar como as células residentes no tecido influenciam a capacidade das células endoteliais vasculares de promover o recrutamento de leucócitos durante a inflamação. Isso é realizado primeiramente estabelecendo culturas co-cultivadas de células endoteliais com células-tronco mesenquimais, utilizando um dos dois modelos vasculares in vitro: o modelo de lâmina microscópica e o modelo de filtro. Essas culturas são então tratadas com citocina antes do ensaio de fluxo.

O sistema de fluxo baseado é então montado de maneira sequencial, com modificações realizadas conforme o sistema modelo utilizado. O passo final consiste em perfundir leucócitos sobre as células endoteliais e observar seu recrutamento a partir do fluxo, bem como seu comportamento subsequente. Em última análise, esses ensaios de adesão baseados em fluxo e multicelulares demonstraram que a comunicação cruzada entre células-tronco mesenquimais e células endoteliais suprime o recrutamento de neutrófilos durante a inflamação.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo do tráfego de leucócitos, como, por exemplo, como as células residentes nos tecidos, tais como as células-tronco mesenquimais, modificam esse processo? Essa alteração ocorre em doenças como inflamação crônica ou câncer? Podemos utilizar esse conhecimento para auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas? Para começar, estabeleça culturas co-culturas de células endoteliais com células-tronco mesenquimais utilizando o modelo de lâmina microscópica ou o modelo de filtro, conforme descrito no protocolo do texto, para montar o sistema de fluxo.

Primeiro, ligue o aquecedor e ajuste-o a 37 graus Celsius. Em seguida, acople uma seringa de 20 mililitros com o êmbolo removido, bem como uma seringa de cinco mililitros a uma torneira de três vias. Depois, meça e corte um pedaço longo de tubo de 2,4 milímetros com comprimento aproximadamente igual à distância entre a válvula e a torneira de três vias.

Corte um pedaço de tubo com oito a 10 milímetros de comprimento e 1,3 milímetro de diâmetro e insira-o em uma extremidade do tubo grosso. Fixe o lado do tubo grosso na torneira de três vias e conecte o tubo fino. Conecte a extremidade a uma porta da válvula microeletrônica de três vias para formar o reservatório de lavagem.

Em seguida, fixe a torneira à câmara de plexiglass usando fita microporosa. Depois, prepare um pedaço de tubo grosso e fino com seis a oito milímetros de comprimento e insira o tubo fino em uma das extremidades do tubo grosso. Conecte a extremidade do tubo grosso a uma seringa de dois mililitros com o êmbolo removido.

Agora, conecte a extremidade do tubo fino da seringa de dois mililitros a uma porta da válvula microeletrônica para formar o reservatório de amostra. Em seguida, meça e corte um pedaço longo de tubo fino com o comprimento correspondente à distância entre a válvula microeletrônica e o centro da platina do microscópio. Para o modelo de lâmina microscópica, fixe um pedaço de tubo grosso de oito a 10 milímetros na extremidade do tubo fino.

Em seguida, coloque um conector em forma de L na extremidade da tubulação grossa. Este será conectado ao microscópio ou ao modelo de filtro. Fixe um segmento de oito a 10 milímetros de tubo azul Portex para conexão ao manômetro na extremidade da tubulação fina.

Em seguida, coloque a extremidade do tubo fino na microválvula. O tubo torna-se a saída comum para os reservatórios de lavagem e de amostra. Encha os reservatórios com solução salina tamponada com fosfato contendo albumina sérica bovina.

Prepare brevemente o PBSA passando-o através da tubulação para remover quaisquer bolhas de ar, em seguida, conecte a tubulação do manômetro a uma seringa de vidro de 50 mililitros. Enquanto isso, no modelo com lâmina microscópica, conecte apenas um pedaço de tubo grosso de 10 a 12 milímetros à extremidade da tubulação do manômetro que leva à seringa de vidro. Coloque um conector em forma de L na extremidade do tubo grosso.

Priminga a seringa preenchendo-a com 10 mililitros de PBSA. Inverta a seringa de modo que a extremidade conectada ao tubo fique voltada para cima e elimine todas as bolhas de ar antes de reabastecê-la com cinco mililitros de PBSA. Por fim, coloque a seringa de vidro em uma bomba de infusão para infusão e retirada.

Defina a taxa de recarga e o diâmetro da seringa de vidro para configurar as microplacas para fluxo. Coloque a microplaca na platina de um microscópio invertido de contraste de fase. Gire a torneira de três vias para permitir que o PBSA passe pela tubulação de entrada.

Conecte o conector em forma de L à porta de entrada do canal da lâmina microscópica. Em seguida, coloque o conector em forma de L da bomba de seringa na porta de saída do canal. Remova qualquer resíduo de PBSA que tenha escorrido sobre a lâmina microscópica.

Alternativamente, para o modelo de filtro, primeiro corte um pedaço de filme para em tamanho idêntico ao do lamínula de vidro utilizando um molde metálico. Em seguida, recorte uma fenda de 20 por quatro milímetros no filme para utilizando um molde metálico para criar o canal de fluxo. Use a junta de paraform para marcar o canal de fluxo sobre o lamínula de vidro.

Alinhe as bordas do filtro de seis poços sobre o lamínula de vidro. Certifique-se de que o filtro cubra as marcações do canal de fluxo. Corte cuidadosamente o filtro usando um bisturi tipo 10.

A seguir, cubra cuidadosamente o filtro com uma junta de paraforma, garantindo que o entalhe do canal de fluxo esteja no centro do filtro. Use um pedaço de tecido limpo e remova quaisquer bolhas. Agora, coloque a lamínula no recesso da placa inferior da câmara de fluxo de plexiglass.

Posicione a placa de plexiglass superior sobre a parte superior da junta e parafuse as placas juntas. Gire a torneira de três vias para permitir que o tampão de lavagem PBSA flua através da válvula. Em seguida, conecte a tubulação do manômetro à porta de entrada da placa de plexiglass superior.

Execute o PBSA através do canal de fluxo para permitir que as bolhas passem. Em seguida, conecte a tubulação do manômetro da bomba de seringa à porta de saída da placa de perspex. Remova qualquer PBSA que tenha escorrido sobre a placa superior da câmara.

Por fim, coloque a câmara sobre a platina de um microscópio invertido com contraste de fase e ajuste o foco para visualizar as células endoteliais acima dos filtros, a fim de perfundir leucócitos sobre as células endoteliais. Configure a bomba de seringa para reabastecimento e pressione iniciar após o ajuste do foco. Para visualizar a monocamada de células endoteliais, adicione dois mililitros de neutrófilos purificados ao reservatório de amostra e deixe aquecer por dois minutos.

Em seguida, lave o endotélio com PBSA durante dois minutos. Abra a válvula para perfundir neutrófilos sobre o endotélio. Administre a dose única de neutrófilos por quatro minutos.

Feche a válvula e perfunda PBSA a partir do reservatório de lavagem pelo tempo restante do experimento. Durante a realização do experimento, certifique-se de que bolhas de ar não passem em nenhum momento do ensaio, pois isso irá perturbar a monocamada de células endoteliais e causar a dessão de neutrófilos aderidos. Registre o recrutamento de neutrófilos durante o fluxo de neutrófilos ou após a perfusão, utilizando um software de captura de imagem digital.

Identifique o centro do canal movendo a objetiva até a borda do canal no orifício de entrada e determinando o meio do orifício. Faça gravações digitais de pelo menos cinco a dez campos no centro do canal de fluxo durante o registro do fluxo de neutrófilos. Capture imagens de um único campo a cada 10 segundos durante um minuto, desloque-se ao longo do canal e grave outro campo por um minuto.

Repita este processo durante todo o período do bolus para registrar a pós-perfusão. Faça um registro de dez segundos em cinco a dez campos ao longo do centro do canal de fluxo para avaliar o comportamento dos leucócitos. Adquira imagens a cada segundo dentro do intervalo de dez segundos.

Isso permite tempo suficiente para a captura a partir do fluxo e para a análise do comportamento de neutrófilos aderentes. Registre um único campo contendo pelo menos 10 neutrófilos transmigrados durante cinco minutos, capturando imagens a cada 30 segundos. Isso pode ser usado para calcular a velocidade das células migradas; registre outra série de campos de dez segundos.

Isso permite que os neutrófilos tenham tempo para migrar através da monocamada endotelial. Por fim, pare a bomba de seringa e remova o tubo de saída, seguido pelo tubo de entrada, desmonte a câmara de fluxo e enxágue o reservatório de amostra com PBSA; repita o procedimento para os filtros e canais da lâmina microscópica subsequentes antes de prosseguir para a análise do recrutamento e comportamento dos leucócitos, conforme descrito no protocolo textual. No modelo da lâmina microscópica, a estimulação com citocina utilizando fator de necrose tumoral alfa aumentou significativamente a adesão de neutrófilos ao endotélio de maneira dependente da dose.

Além disso, foi observada uma diminuição dependente da dose de TNF-alfa na porcentagem de neutrófilos que rolavam sobre a superfície endotelial. Isso se refletiu em A-T-N-F-L com aumento dependente da dose e na porcentagem de neutrófilos que migravam através da monocamada endotelial e, portanto, realizando migração transendotelial. Resultados semelhantes foram observados com o ensaio de fluxo baseado em filtro.

Por exemplo, a estimulação por TNF alfa aumentou a adesão de neutrófilos de maneira dependente da dose. O cultivo conjunto de células endoteliais com células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea reduziu significativamente a adesão de neutrófilos em comparação com células endoteliais cultivadas isoladamente, conforme esperado para o modelo de lâmina microscópica.

Novamente, efeitos semelhantes foram observados quando o modelo baseado em filtro foi utilizado, com menor adesão observada na co-cultura em comparação com a monocultura. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como examinar a forma como as células estromais se comunicam com as células endoteliais para influenciar o recrutamento de leucócitos durante a inflamação.