Estabelecimento de epiteliais humanas Enteroids e Colonoids de tecido inteiro e biópsia
6 de março de 2015
Descrevemos um método para estabelecer enteróides humanos a partir de criptas do intestino delgado e colonóides a partir de criptas do cólon coletadas de tecido cirúrgico e biópsias. Neste artigo metodológico, apresentamos as modalidades de cultura que são essenciais para o crescimento e manutenção bem-sucedidos de enteróides e colonóides humanos.
O objetivo geral deste procedimento é gerar entradas humanas a partir de tecidos intestinais. Isso é feito dissecando primeiro a mucosa intestinal do tecido submucoso subjacente. O segundo passo é incubar a mucosa com EDTA para promover a dissociação do epitélio do tecido conjuntivo.
Em seguida, as criptas intestinais são separadas do epitélio dissociado. Finalmente, as criptas intestinais são cultivadas em matriz de membrana basal. Em última análise, técnicas de imuno-histoquímica são usadas para mostrar a organização epitelial, bem como marcadores epiteliais específicos dos OIDs cultivados.
As implicações desse método são o fato de que agora podemos gerar OIDs a partir de biópsias específicas do paciente, o que significa que agora podemos usar esse tecido no laboratório para examinar doenças e diagnósticos intestinais, o que antes nunca fomos capazes de fazer. Depois de preparar os tampões e reagentes, de acordo com o protocolo de texto, descongele a membrana basal em gelo e pré-incube uma placa de 24 poços em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius quando o tecido for recebido. Use o PBS do KO sem cálcio e magnésio ou DPBS para lavar o tecido até que o DPBS esteja claro.
Coloque o tecido em uma placa de Petri de vidro revestida de silicone cheia de DPBS gelada com o lado da mucosa voltado para cima e com pinos de minuchin, prenda o tecido esticando-o e prendendo-o. Em seguida, sob um microscópio de dissecação, use uma tesoura de microdissecação e uma pinça curva de ponta fina para remover a mucosa subjacente da submucosa e do tecido conjuntivo. Em seguida, com o lado da mucosa voltado para cima, estique e prenda a mucosa dissecada na placa de Petri de vidro revestida de silicone.
Usando uma pinça curva, raspe suavemente a superfície da mucosa. Esta etapa é necessária para melhorar a qualidade do preparo. Cubra a mucosa com tampão de quelação de EDTA de dois milimolares recém-preparado.
Em seguida, depois de lavar o tecido no gelo, três a quatro vezes de acordo com o protocolo de texto sob um microscópio de dissecação, use uma pinça curva para raspar suavemente a mucosa para liberar as criptas intestinais com uma pipeta. Remova cuidadosamente a suspensão da cripta da placa de Petri e transfira-a para um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, verifique o tecido para se certificar de que quase todas as criptas foram removidas da mucosa.
Filtrar a suspensão da cripta através de um filtro de 150 micrómetros duas vezes e utilizar um microscópio para verificar o fluxo Depois de lavar a suspensão da cripta e transferir o número de criptas necessárias para um tubo inferior redondo de cinco mililitros, de acordo com o protocolo de texto, centrifugar a fracção da cripta durante 10 minutos a 150 Gs e quatro graus Celsius. Em seguida, remova o sobrenadante usando pontas de pipeta pré-resfriadas e matriz de membrana basal ressuspende. A pelota da cripta.
Aplique 50 microlitros de suspensão de cripta na matriz da membrana do embasamento por poço na placa pré-aquecida, ejetando lentamente a matriz da membrana do embasamento no centro do poço. Incube a placa em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius 5% por 30 minutos para permitir uma polimerização completa da matriz da membrana basal. Em seguida, cubra a matriz da membrana basal com 500 microlitros de meio miniintestinal humano completo, suplementado com 2,5 micromolares cada um de CHIR 9 0 2 2 1.
E Thien incuba o tecido mudando o meio após dois dias, depois em dias alternados. Esta figura mostra um exemplo típico de criptas recém-isoladas de todo o tecido. O número de criptas isoladas de uma biópsia é menor do que no tecido total.
Duas mordidas de biópsia geralmente são realizadas em uma única passagem. Cada mordida de biópsia resulta em uma superfície de 10 milímetros quadrados com uma média de 50 a 100 crips por biópsia. Após a cultura e a matriz da membrana basal por cinco a seis dias, os Crips se arredondam para formar esferas entero para o intestino delgado e esferas de cólon para cólon e são passados Após sete dias.
Os enters ou OIDs estabelecidos a partir de biópsias mostradas aqui sofrem o mesmo desenvolvimento em uma densidade mais baixa na semeadura. Portanto, o acondicionamento geralmente é feito após 10 a 12 dias em cultura. Como mostrado aqui, tanto os OIDs quanto os OIDs apresentam um lado luminal e são revestidos por um epitélio.
As células proliferativas podem ser observadas dentro dos OIDs e estão localizadas nas pontas dos botões. A imagem confocal de OIDs corados com e catrina aqui em verde mostra as células epiteliais. Esta figura mostra entradas crescendo de um paciente com fibrose cística e uma enteropatia em tufos devido a uma mutação congênita no gene da molécula de adesão de células epiteliais.
Seguir este procedimento ou o método como PCR em tempo real ou sangue ocidental pode ser usado para responder a perguntas adicionais sobre um gene ou problema de interesse. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar consistentemente Crips humanos para poder gerar entradas com eficiência em seu laboratório para responder a perguntas específicas do paciente.
Visão Geral
Este artigo descreve um método para estabelecer enteroides humanos a partir de criptas intestinais delgadas e colonoides a partir de criptas do cólon. O protocolo descreve as modalidades essenciais de cultura para o crescimento e manutenção bem-sucedidos desses organoides.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Gastroenterologia
Antecedentes
- Enteroides e colonoides humanos são derivados de tecidos intestinais.
- O método permite estudos específicos do paciente sobre doenças intestinais.
- Técnicas anteriores não tinham a capacidade de utilizar biópsias de pacientes de forma eficaz.
- A imuno-histoquímica é utilizada para analisar a organização epitelial.
Objetivo do Estudo
- Gerar organoides humanos a partir de tecidos intestinais.
- Facilitar a pesquisa sobre doenças e diagnósticos intestinais.
- Aprimorar o entendimento do comportamento das células epiteliais em cultura.
Métodos Utilizados
- Dissociação da mucosa intestinal do tecido submucoso.
- Incubação com EDTA para dissociação epitelial.
- Cultivo de criptas intestinais em matriz de membrana basal.
- Uso de imagem confocal e imunohistoquímica para análise.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de criptas intestinais a partir de biópsias.
- Geração de organoides que mimetizam a estrutura intestinal.
- Observação de células proliferativas dentro dos organoides.
- Demonstração do desenvolvimento de organoides específicos para cada paciente.
Conclusões
- O método permite a geração eficiente de enteroides humanos.
- Abre caminhos para o estudo de condições intestinais específicas de pacientes.
- Aplicações futuras incluem análise de expressão gênica e modelagem de doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Os modelos de enteroides e colonoides humanos fornecem um sistema fisiologicamente relevante para o estudo da biologia epitelial intestinal e dos mecanismos das doenças. Essa abordagem permite a modelagem de doenças específicas do paciente, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos pré-clínicos em programas de descoberta de fármacos voltados à gastroenterologia. O método conecta a biologia da descoberta com a pesquisa translacional ao gerar modelos de tecidos derivados de humanos escalonáveis e reprodutíveis.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas utilizando células epiteliais intestinais derivadas de pacientes que mantêm a diversidade e polaridade celulares nativas.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos ao modelar fenótipos epiteliais relevantes para doenças a partir de material de biópsia.
- Valor Traducional: Aumenta a confiança preditiva ao preservar os contextos genéticos específicos dos pacientes em um sistema de cultura 3D escalonável.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para Ensaios: Gera monocamadas epiteliais e esferoides padronizados adequados para fluxos de trabalho de triagem de compostos e imagem de alto conteúdo.
- Saída Quantitativa: Permite a medição da organização epitelial, proliferação e diferenciação por meio de imunohistoquímica e imagem confocal.
- Reprodutibilidade: Estabelece condições consistentes de isolamento e cultivo de criptas, essenciais para a padronização de ensaios entre laboratórios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Modelagem de Doenças: Facilita o estudo de condições intestinais específicas do paciente, como fibrose cística e enteropatia em tufo, utilizando organoides derivados de biópsia.
- Continuidade Pré-clínica: Permite a progressão do descobrimento à validação pré-clínica, mantendo a estrutura epitelial e a atividade das células-tronco ao longo do tempo.
- Alinhamento de Biomarcadores: Permite a correlação entre fenótipos de organoides e biomarcadores clínicos para decisões de avanço ajustadas ao risco.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta ao fornecer modelos epiteliais humanos para estudos de engajamento de alvos, ensaios de modulação de vias e triagem de toxicidade antes da otimização do composto líder.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias por meio da manipulação controlada de epitélios intestinais derivados de pacientes.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis para triagem de compostos por meio de semeadura padronizada de criptas e incorporação em matriz.
- Análises: Oferece leituras baseadas em imagem (por exemplo, polaridade epitelial, marcadores de proliferação) que permitem análise comparativa entre condições genéticas ou de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico ao preservar mutações específicas de pacientes e fenótipos epiteliais relevantes para distúrbios gastrointestinais.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma renovável para uso em múltiplos projetos, incluindo validação de alvos, estudos de mecanismo de ação e perfil de segurança.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio de modelos epiteliais humanos fisiologicamente relevantes.
- Valor Operacional: Protocolos padronizados de dissociação e cultivo garantem reprodutibilidade entre diferentes locais e operadores.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento ao reduzir a incerteza biológica na avaliação pré-clínica inicial.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em eficácia e toxicidade em sistemas intestinais derivados de humanos.
Considerações sobre a Implementação
- É necessária experiência em dissecação de tecidos, isolamento de criptas e técnicas de cultivo tridimensional para a geração bem-sucedida de organoides.
- O acesso à matriz da membrana basal, meios de cultura definidos e incubadoras com controle de CO2 é essencial para a formação consistente de organoides.
- A padronização do processamento de biópsias e da quantificação de criptas é necessária para a colaboração entre equipes e a comparabilidade dos dados.
- A adaptação a diferentes regiões intestinais (por exemplo, íleo versus cólon) requer a otimização das condições de dissociação e cultivo.
- A manutenção de longo prazo exige repiques regulares e trocas de meio para prevenir a perda de diferenciação e o crescimento excessivo.
