Estabelecimento de epiteliais humanas Enteroids e Colonoids de tecido inteiro e biópsia
6 de março de 2015
Descrevemos um método para estabelecer enteróides humanos a partir de criptas do intestino delgado e colonóides a partir de criptas do cólon coletadas de tecido cirúrgico e biópsias. Neste artigo metodológico, apresentamos as modalidades de cultura que são essenciais para o crescimento e manutenção bem-sucedidos de enteróides e colonóides humanos.
O objetivo geral deste procedimento é gerar enteroides humanos a partir de tecidos intestinais. Isso é realizado primeiramente dissecando a mucosa intestinal do tecido submucoso subjacente. O segundo passo é incubar a mucosa com EDTA para promover a dissociação do epitélio do tecido conjuntivo.
Em seguida, as criptas intestinais são separadas do epitélio dissociado. Por fim, as criptas intestinais são cultivadas em matriz de membrana basal. Em última instância, técnicas de imuno-histoquímica são utilizadas para demonstrar a organização epitelial, bem como marcadores epiteliais específicos dos OID cultivados.
As implicações deste método residem no fato de que agora podemos gerar OID a partir de biópsias específicas de pacientes, o que significa que agora podemos utilizar esse tecido em laboratório para investigar doenças e diagnósticos intestinais, algo que até o momento nunca havíamos conseguido fazer. Após preparar os tampones e reagentes, conforme o protocolo descrito, descongele a membrana basal em gelo e pré-incube uma placa de 24 poços em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius assim que o tecido for recebido. Utilize PBS sem cálcio e magnésio ou DPBS para lavar o tecido até que o DPBS fique límpido.
Coloque o tecido em uma placa de Petri de vidro revestida com silicone, preenchida com DPBS gelado, com o lado mucoso voltado para cima, e fixe o tecido com pinças de minúscia, esticando-o e prendendo-o. Em seguida, sob um microscópio estereoscópico, utilize tesouras de dissecação microcirúrgicas e pinças curvas de ponta fina para remover a mucosa subjacente da submucosa e do tecido conjuntivo. Depois, com o lado mucoso voltado para cima, estique e fixe a mucosa dissecada, mantendo-a plana na placa de Petri de vidro revestida com silicone.
Usando pinças curvas, raspe suavemente a superfície da mucosa. Esta etapa é necessária para melhorar a qualidade do preparo. Cubra a mucosa com tampão de quelatização de EDTA recém-preparado a dois milimolares.
Em seguida, após lavar o tecido em gelo, de três a quatro vezes conforme descrito no protocolo no texto, sob microscópio estereoscópico, utilize pinças curvas para raspar suavemente a mucosa e liberar os criptas intestinais com uma pipeta. Remova cuidadosamente a suspensão de criptas da placa de Petri e transfira para um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, verifique o tecido para garantir que quase todos os criptas tenham sido removidos da mucosa.
Filtre a suspensão de criptas através de um filtro de 150 micrômetros duas vezes e use um microscópio para verificar o fluxo. Após lavar a suspensão de criptas e transferir o número de criptas necessário para um tubo cônico de cinco mililitros, de acordo com o protocolo descrito, centrifugue a fração de criptas por 10 minutos a 150 Gs e quatro graus Celsius. Em seguida, remova o sobrenadante utilizando ponteiras pré-resfriadas e matriz da membrana basal. Re-suspenda o pellet de criptas.
Adicione 50 microlitros de suspensão de criptas em matriz de membrana basal por poço à placa pré-aquecida, ejetando lentamente a matriz de membrana basal no centro do poço. Incube a placa em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 30 minutos para permitir a completa polimerização da matriz de membrana basal. Em seguida, recubra a matriz de membrana basal com 500 microlitros de meio completo para intestino humano miniatura, suplementado com 2,5 micromolar de CHIR 90221.
E Thien incuba o tecido trocando o meio após dois dias, e depois a cada dois dias subsequentes. Esta figura mostra um exemplo típico de criptas recém-isoladas a partir de tecido inteiro. O número de criptas isoladas de uma biópsia é menor do que no tecido inteiro.
Duas biópsias são geralmente realizadas em uma única passagem. Cada fragmento de biópsia resulta em uma superfície de 10 milímetros quadrados, com uma média de 50 a 100 criptas por biópsia. Após cultivo e matriz da membrana basal por cinco a seis dias, as criptas se arredondam para formar enterosferas no intestino delgado e colónosferas no cólon, sendo repicadas após sete dias.
Os enteroides ou OIs estabelecidos a partir de biópsias mostrados aqui passam pelo mesmo desenvolvimento, porém com menor densidade no momento da semeadura. Portanto, o envasamento geralmente é realizado após 10 a 12 dias em cultura. Como mostrado aqui, tanto os OIs quanto os OIs apresentam um lado luminal e são revestidos por um epitélio.
Células proliferativas podem ser observadas dentro dos OID e estão localizadas nas pontas dos brotos. A imagem confocal de OID corados com e-caderina, em verde, mostra as células epiteliais. Esta figura mostra enteroides crescendo a partir de um paciente com fibrose cística e uma enteropatia em tufo devido a uma mutação congênita no gene do componente epitelial de adesão celular.
Após seguir este procedimento ou métodos como PCR em tempo real ou Western blot, é possível responder perguntas adicionais relativas a um gene ou sonda de interesse. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar consistentemente Crips humanos para ser capaz de gerar eficientemente enteados em seu laboratório e responder perguntas específicas de seus pacientes.
Visão Geral
Este artigo descreve um método para estabelecer enteroides humanos a partir de criptas intestinais delgadas e colonoides a partir de criptas do cólon. O protocolo descreve as modalidades essenciais de cultura para o crescimento e manutenção bem-sucedidos desses organoides.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Gastroenterologia
Antecedentes
- Enteroides e colonoides humanos são derivados de tecidos intestinais.
- O método permite estudos específicos do paciente sobre doenças intestinais.
- Técnicas anteriores não tinham a capacidade de utilizar biópsias de pacientes de forma eficaz.
- A imuno-histoquímica é utilizada para analisar a organização epitelial.
Objetivo do Estudo
- Gerar organoides humanos a partir de tecidos intestinais.
- Facilitar a pesquisa sobre doenças e diagnósticos intestinais.
- Aprimorar o entendimento do comportamento das células epiteliais em cultura.
Métodos Utilizados
- Dissociação da mucosa intestinal do tecido submucoso.
- Incubação com EDTA para dissociação epitelial.
- Cultivo de criptas intestinais em matriz de membrana basal.
- Uso de imagem confocal e imunohistoquímica para análise.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de criptas intestinais a partir de biópsias.
- Geração de organoides que mimetizam a estrutura intestinal.
- Observação de células proliferativas dentro dos organoides.
- Demonstração do desenvolvimento de organoides específicos para cada paciente.
Conclusões
- O método permite a geração eficiente de enteroides humanos.
- Abre caminhos para o estudo de condições intestinais específicas de pacientes.
- Aplicações futuras incluem análise de expressão gênica e modelagem de doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Os modelos de enteroides e colonoides humanos fornecem um sistema fisiologicamente relevante para o estudo da biologia epitelial intestinal e dos mecanismos das doenças. Essa abordagem permite a modelagem de doenças específicas do paciente, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos pré-clínicos em programas de descoberta de fármacos voltados à gastroenterologia. O método conecta a biologia da descoberta com a pesquisa translacional ao gerar modelos de tecidos derivados de humanos escalonáveis e reprodutíveis.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas utilizando células epiteliais intestinais derivadas de pacientes que mantêm a diversidade e polaridade celulares nativas.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos ao modelar fenótipos epiteliais relevantes para doenças a partir de material de biópsia.
- Valor Traducional: Aumenta a confiança preditiva ao preservar os contextos genéticos específicos dos pacientes em um sistema de cultura 3D escalonável.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para Ensaios: Gera monocamadas epiteliais e esferoides padronizados adequados para fluxos de trabalho de triagem de compostos e imagem de alto conteúdo.
- Saída Quantitativa: Permite a medição da organização epitelial, proliferação e diferenciação por meio de imunohistoquímica e imagem confocal.
- Reprodutibilidade: Estabelece condições consistentes de isolamento e cultivo de criptas, essenciais para a padronização de ensaios entre laboratórios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Modelagem de Doenças: Facilita o estudo de condições intestinais específicas do paciente, como fibrose cística e enteropatia em tufo, utilizando organoides derivados de biópsia.
- Continuidade Pré-clínica: Permite a progressão do descobrimento à validação pré-clínica, mantendo a estrutura epitelial e a atividade das células-tronco ao longo do tempo.
- Alinhamento de Biomarcadores: Permite a correlação entre fenótipos de organoides e biomarcadores clínicos para decisões de avanço ajustadas ao risco.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta ao fornecer modelos epiteliais humanos para estudos de engajamento de alvos, ensaios de modulação de vias e triagem de toxicidade antes da otimização do composto líder.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias por meio da manipulação controlada de epitélios intestinais derivados de pacientes.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis para triagem de compostos por meio de semeadura padronizada de criptas e incorporação em matriz.
- Análises: Oferece leituras baseadas em imagem (por exemplo, polaridade epitelial, marcadores de proliferação) que permitem análise comparativa entre condições genéticas ou de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico ao preservar mutações específicas de pacientes e fenótipos epiteliais relevantes para distúrbios gastrointestinais.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma renovável para uso em múltiplos projetos, incluindo validação de alvos, estudos de mecanismo de ação e perfil de segurança.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio de modelos epiteliais humanos fisiologicamente relevantes.
- Valor Operacional: Protocolos padronizados de dissociação e cultivo garantem reprodutibilidade entre diferentes locais e operadores.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento ao reduzir a incerteza biológica na avaliação pré-clínica inicial.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em eficácia e toxicidade em sistemas intestinais derivados de humanos.
Considerações sobre a Implementação
- É necessária experiência em dissecação de tecidos, isolamento de criptas e técnicas de cultivo tridimensional para a geração bem-sucedida de organoides.
- O acesso à matriz da membrana basal, meios de cultura definidos e incubadoras com controle de CO2 é essencial para a formação consistente de organoides.
- A padronização do processamento de biópsias e da quantificação de criptas é necessária para a colaboração entre equipes e a comparabilidade dos dados.
- A adaptação a diferentes regiões intestinais (por exemplo, íleo versus cólon) requer a otimização das condições de dissociação e cultivo.
- A manutenção de longo prazo exige repiques regulares e trocas de meio para prevenir a perda de diferenciação e o crescimento excessivo.
