Geração de adiposo humano Stem Cells através Dedifferentiation de adipócitos maduros em Culturas de teto
7 de março de 2015
Os adipócitos maduros podem representar uma fonte abundante de células-tronco por meio da desdiferenciação, o que leva a uma população homogênea de células semelhantes a fibroblastos. A digestão da colagenase é usada para isolar adipócitos maduros da gordura humana. O objetivo do nosso protocolo é obter células de gordura multipotentes e desdiferenciadas a partir de adipócitos humanos maduros.
Os depósitos maduros têm a capacidade de se diferenciarem em células precursoras in vitro. Isso é conseguido por meio do cultivo em selo, uma técnica na qual células maduras são cultivadas em um frasco completamente preenchido com meio de cultura e mantido em posição invertida. As células flutuantes aderem ao frasco e alteram sua morfologia, passando de uma célula redonda rica em lipídios para uma célula alongada semelhante a um fibroblasto. Homogêneo.
Populações de células alongadas podem ser obtidas e tratadas após o recebimento de amostras de tecido no laboratório. Pese os tecidos adiposos, dependendo do número de adipócitos necessários, e coloque um volume apropriado da amostra em um tubo de 50 ml. Após a digestão, espera-se obter aproximadamente 1 milhão de células por grama de tecido.
Culturas em teto são realizadas com 500.000 células por frasco de 25 centímetros e 50.000 células para cada poço de uma placa de seis poços, adicionando tampão KRH em trabalho suplementado com colagenase, picando o tecido com tesoura e incubando a preparação a 37 graus Celsius por 45 minutos. Durante a incubação, prepare o conjunto de tubos e seringa. Despeje a solução translúcida através de uma malha de náilon em um béquer de plástico com pinça.
Esfregue a preparação celular através da malha e lave com cinco ml do tampão KRH em trabalho delicadamente. Transfira a suspensão celular filtrada para um tubo de 50 ml com conjunto de tubo e seringa. Deixe os adipócitos maduros repousar por aproximadamente 10 minutos.
As células atingirão o topo do tampão por flutuação. Aspire lentamente o tampão a partir da parte inferior. Usando uma seringa e tubo, adicione 20 ml de tampão KRH em trabalho para lavar.
Repita os passos de lavagem duas vezes. Colete o tampão para levar a suspensão de adipócitos a um volume final de cinco ml e prossiga para contagem das células utilizando um hemocitômetro, encha um frasco T 25 até três quartos de seu volume com D-M-E-M-F 12 suplementado com 20% de soro de bezerro, transfira 500.000 adipócitos maduros para o frasco. Complete o volume do frasco com meio e remova as bolhas de ar da superfície superior.
Parafuse uma tampa inventada no frasco. Incube o frasco de cabeça para baixo por uma semana em uma incubadora de cultura celular com 5% de dióxido de carbono. Evite movimentar o frasco, pois as bolhas remanescentes podem interferir na aderência celular.
Coloque uma lamínula na parte inferior dos poços. Adicione o bucha plástica no poço e preencha o poço com oito ml de meio. Certifique-se de que não haja bolhas.
Coloque uma lamínula sobre o bujão, deixando um espaço para inserir a ponteira da pipeta. Colete 50.000 células e injete-as posicionando a ponteira entre a lamínula e o bujão. Incube a placa em uma incubadora de cultura celular com 5% de dióxido de carbono por uma semana ou menos.
Dependendo do desenho do experimento, são necessários pelo menos três dias para que as células adiram à lamínula em uma placa diferente. Inverta as lamínulas em dois mls de meio. Em culturas contínuas, as lamínulas podem então ser fixadas em formalina para experimentos de imunofluorescência ou para extrações de D-N-A-R-N-A e Proteína.
A desdiferenciação de adipócitos maduros causa grandes alterações na morfologia celular. Durante esse processo, os adipócitos perdem seu fenótipo e reduzem a expressão de transcritos normalmente associados à sua função de armazenamento de lipídios. Esta imagem de imunofluorescência representa células adiposas em diversos estágios de desdiferenciação.
As células com morfologia arredondada ainda expressam FABP4, um marcador de adipócito maduro, enquanto as células alongadas não o expressam mais, com base na literatura. Células adiposas diferenciadas, frequentemente chamadas de células adiposas D, podem ser obtidas de pacientes jovens, idosos, magros ou com base OB. Sua capacidade de cultura de longo prazo e sua comprovada multipotência.
Gosto também do seu potencial para engenharia de tecidos e terapia celular. Elas podem representar um novo modelo para a investigação específica da fisiologia de adipócitos.
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Visão Geral
Este estudo explora a desdiferenciação de adipócitos maduros em células-tronco multpotentes. Ao utilizar técnicas de digestão com colagenase e cultivo com selo, os pesquisadores podem isolar e cultivar essas células para obter uma população homogênea de células semelhantes a fibroblastos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Pesquisa com células-tronco
- Biologia do adipócito
- Técnicas de cultura celular
Contexto
- Os adipócitos maduros podem desdiferenciar-se em células precursoras.
- Esse processo pode ser realizado in vitro utilizando métodos específicos de cultivo.
- O isolamento de adipócitos é crucial para a obtenção de células-tronco.
- A digestão com colagenase é um método padrão para o isolamento celular.
Objetivo do Estudo
- Obter células adiposas dediferenciadas, multipotentes, a partir de adipócitos maduros humanos.
- Estabelecer um protocolo para o isolamento e cultivo dessas células.
- Investigar as alterações morfológicas durante a dediferenciação.
Métodos Utilizados
- Digestão com colagenase para isolamento de adipócitos maduros.
- Técnica de cultivo selado para promover a desdiferenciação.
- Avaliação da morfologia celular para confirmar a desdiferenciação.
- Quantificação do rendimento celular com base no peso do tecido.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de aproximadamente 1 milhão de células por grama de tecido adiposo.
- Células desdiferenciadas exibiram morfologia alongada semelhante à de fibroblastos.
- Populações homogêneas de células foram obtidas pelos métodos descritos.
- Demonstrou o potencial dos adipócitos maduros como fonte de células-tronco.
Conclusões
- Adipócitos maduros podem ser efetivamente convertidos em células-tronco multipotentes.
- Os métodos descritos oferecem uma abordagem confiável para a pesquisa com células-tronco.
- Este estudo contribui para a compreensão da plasticidade dos adipócitos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A dediferenciação de adipócitos maduros em células-tronco pluripotentes oferece uma nova fonte para aplicações em medicina regenerativa e engenharia de tecidos. Essa abordagem permite a caracterização específica de depósitos de função adipocitária e propriedades metabólicas, apoiando a validação de alvos em pesquisas sobre doenças metabólicas. O método fornece uma plataforma escalável para a geração de células semelhantes a fibroblastos com comprovada pluripotência, facilitando o desenvolvimento de modelos pré-clínicos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta de terapias focadas em adipócitos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da plasticidade dos adipócitos e a verificação de hipóteses terapêuticas em vias de doenças metabólicas.
- Valor Operacional: Fornece um sistema reprodutível para validação funcional de alvos por meio do isolamento de adipócitos específicos de depósitos.
- Valor Científico: Apoia a confiança preditiva ao gerar populações homogêneas de células dediferenciadas para esclarecimento de vias.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho subsequentes por meio de técnicas padronizadas de digestão com colagenase e cultivo em teto.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade dos ensaios por meio de um rendimento controlado de adipócitos (aproximadamente 1 milhão de células por grama de tecido).
- Valor Científico: Permite avaliação confiável de compostos utilizando células com morfologia semelhante a fibroblastos e com comprovada redução da expressão de FABP4 como marcador de desdiferenciação.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Valor Científico: Apoia o desenvolvimento de sistemas relevantes para doenças, permitindo a investigação específica de fisiologia de adipócitos.
- Valor Operacional: Garante continuidade translacional, desde a descoberta até a validação pré-clínica, por meio da capacidade de cultivo prolongado de células adiposas desdiferenciadas.
- Valor Científico: Facilita decisões de avanço ajustadas ao risco, demonstrando a multipotência e o potencial de engenharia de tecidos das células D-gordura.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos líderes e estudos pré-clínicos, especialmente para programas de doenças metabólicas e medicina regenerativa.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a redução de riscos biológicos por meio da modelagem da desdiferenciação de adipócitos in vitro.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios e resultados quantitativos por meio do isolamento padronizado de células e avaliação da morfologia.
- Análises: Fornece leituras mensuráveis, como alterações na expressão de FABP4, para comparar estados de desdiferenciação entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio da demonstração de cultura de longo prazo e da multipotência de adipócitos desdiferenciados.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade reutilizável para gerar células-tronco derivadas de adipócitos em múltiplas investigações específicas de depósitos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva por meio da redução da ambiguidade mecanicista na comutação de fenótipo de adipócitos.
- Valor Operacional: Padronização e escalabilidade por meio de protocolos definidos de digestão com colagenase e cultura invertida.
- Valor Estratégico: Decisões mais precisas de prosseguir ou não prosseguir ao permitir a caracterização específica de depósitos das propriedades metabólicas antes da otimização da substância líder.
- Impacto sobre o Portfólio: Priorização ajustada ao risco mediante avaliação validada do rendimento de células-tronco e do potencial de diferenciação.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em isolamento de adipócitos primários e técnicas de digestão com colagenase.
- Necessita de infraestrutura de cultura celular capaz de manter culturas em frascos invertidos ou placas de 6 poços com cultivo no teto.
- Exige padronização entre equipes para garantir rendimento consistente de adipócitos e avaliação de desdiferenciação entre laboratórios.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o protocolo a tecido adiposo de diferentes depósitos ou características de doadores.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de preenchimento preciso do meio de cultura para evitar a formação de bolhas durante a cultura invertida.
