Name: Geração de adiposo humano Stem Cells através Dedifferentiation de adipócitos maduros em Culturas de teto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprenda a gerar células-tronco adiposas humanas por desdiferenciação de adipócitos maduros usando digestão com colagenase e cultura de teto. Este método fornece populações homogêneas para pesquisa em engenharia de tecidos.

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Este estudo foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá Discovery Grant (371697-2011, AT). Os autores querem agradecer a ajuda dos cirurgiões bariátricos Drs. S. Biron, FS. Hould, S. Lebel, O. Lescelleur, P. Marceau, bem como Christine Racine e Caroline Gagnon do Banco de Tecidos IUCPQ. Agradecemos ao Sr. Jacques Cadorette, dos serviços audiovisuais da IUCPQ, pela gravação e edição de vídeo.

Declaração de Ética: O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da IUCPQ antes de recrutamento de pacientes. Para efeitos deste artigo / vídeo, obtivemos tecidos a partir de 2 pacientes: 1) um paciente do sexo masculino 62 anos de idade, com um IMC de 50,7 kg / m 2 e 2) uma paciente de 35 anos de idade, com um IMC de 57 kg / m 2. Experiências pode ser feito com ambos os compartimentos de gordura, mas têm sido limitadas a um compartimento de gordura para o propósito deste vídeo. Aspectos técnicos do vídeo foram realizadas com o paciente 1 e FABP4 imunofluorescência foi realizada com células indiferenciadas de paciente 2. Processamento 1. Amostra <ol><li> Peça cirurgiões para coletar tecido adiposo dos compartimentos de gordura omental e subcutâneas, no momento da cirurgia bariátrica laparoscópica. </li><li> Rapidamente trazer amostras de tecido adiposo para o laboratório da RT e processar imediatamente. </li><li> Executar a digestão no laboratório, numa atmosfera não-estéril. Océlulas acabará por ser transferida para a sala de cultura e cultivado em condições estéreis. Para evitar a contaminação, preparar tampão de KRH com água destilada e filtrou-se e seguir por filtração (filtro de 0,22 um) antes da digestão. Tubos cuidadosamente limpos com etanol prévia de transferência na capa de cultura celular para frasco e placa preparação. </li><li> Coloque o tecido adiposo em um prato pré-pesados ​​e peso recorde. Fixar um pequeno pedaço de cada amostra de tecido (menos de 1 cm 2) em tampão de formalina a 10% à temperatura ambiente durante pelo menos 24 horas antes do bloco de parafina. Utilize esta amostra embutido para experimentos de imunohistoquímica (técnica não apresentado). </li><li> Coloque outra peça em um tubo de 50 ml e flash por congelação em azoto líquido antes do armazenamento a -80 ° C para estudos posteriores sobre os tecidos adiposos inteiros (por exemplo, a expressão do gene - técnica não mostrado). </li></ol> 2. Collagenase Digestão <ol><li> Coloque o pedaço de tecido adiposo remanescente em 50 ml de um tuser para a digestão. </li><li> Adicionar 4 ml de KRH-WB suplementados com colagenase (350 U / ml) por grama de amostra no tubo de digestão. </li><li> Picar o tecido adiposo com uma tesoura. </li><li> Coloque suspensão de tecido adiposo picada num agitador, 37 ° C, máximo de 90 rpm, durante um período de incubação de 45 minutos (máximo 1 h). </li></ol> 3. Purificação de adipócitos e pré-adipócitos <ol><li> Despeje a solução translúcida com alguns pedaços de gordura através de um nylon 400? M malha em um copo de plástico. </li><li> Com uma pinça, esfregue a preparação de células na malha de nylon e lavar com 5 ml de KRH-WB. </li><li> Delicadamente transferir a suspensão de células filtrada para um tubo de 50 ml com o tubo de plástico em que uma seringa de 60 cc e ligado na extremidade de tubos. </li><li> Deixe a suspensão com adipócitos maduros repouso durante aproximadamente 10 min, permitindo que as células atingissem a parte superior do tampão por flutuação. </li><li> Lentamente aspirar o tampão na parte inferior do tubo por meio de 60cc Syrinsucção ge. </li><li> Adicionar 20 ml de KRH-WB para lavar. Repita a partir do passo 3.4 para 2 lavagens adicionais. </li><li> Recolhe-se o tampão para trazer a suspensão dos adipócitos para um volume final de 5 ou 10 ml, dependendo da quantidade de células. Prosseguir com etapas na seção 5. </li><li> Recuperar a fracção do estroma vascular do tampão recolhido com a seringa de 60 cc por centrifugação (3000 rpm, TA, 5 min), para posterior cultura de células primária, se desejado (técnica não mostrado). </li></ol> 4. adipócito maduro Contagem de Células <ol><li> Carregar 10 ml de suspensão de adipocitos suavemente agitada em uma câmara de contagem (hemocitómetro). Efectuar a contagem de células em quadruplicado. </li><li> Calcular o número de células maduras isoladas. </li></ol> 5. maduro adipócito Dedifferentiation em T-25 Flask <ol><li> Encha a 25 cm2 de cultura de tecidos frasco a ¾ do volume com DMEM / F12-20% de soro. </li><li> De acordo com a contagem de células, despeje 500.000 células maduras no balão. </li&gt; <li> Encher o balão completamente através de um tubo de 50 ml com meio e retire o máximo de bolhas possível. </li><li> Colocar a tampa não ventilado no frasco. </li><li> Limpar o balão com etanol antes da incubação para evitar a contaminação. </li><li> Incubar o frasco de cabeça para baixo por uma semana sem tocá-lo para evitar o movimento na cultura que possa interromper a adesão celular. </li><li> Antes de inverter o frasco a 7 dias de cultura invertido, manipular suavemente o frasco e remover todo o meio no frasco por aspiração, evitando movimentos bruscos. </li><li> Adicionar 12 ml de DMEM-F12-20 soro% bezerro e cultivar células com técnicas convencionais. Um filtrada, tampa ventilada pode ser adicionado ao frasco. </li></ol> 6. adipócito maturo desdiferenciação em uma placa de 6 poços <ol><li> Coloque uma lamela sobre o fundo de cada poço de uma placa de 6 poços </li><li> Adicionar um ½ &quot;bucha de plástico em cima de cada lamela. </li><li> Encha os poços com 8 ml de 20% de meio de soro de vitelo-DMEM. </li><li> Coloque uma lamela em cada bucha de plástico. </li><li> Insira ponta da pipeta entre a lâmina e o tubo para injetar células sob o slide (50.000 células por poço). </li><li> Incubar as placas numa incubadora de cultura de células padrão, a 37 ° C com 5% de CO 2 durante uma semana. </li><li> Lamela reverso com células ligadas em todos os poços contendo 2 ml de meio suplementado com 20% de soro de bezerro e perseguir cultura. </li><li> Use lamela com células submetidos desdiferenciação para vários fins, incluindo a imunofluorescência (técnica não mostrado). </li></ol>

<ol><li>Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ceiling+culture+of+mature+human+adipocytes%3A+use+in+studies+of+adipocyte+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions.</a> J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).</li>
<li>Matsumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocyte-derived+dedifferentiated+fat+cells+exhibit+multilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential.</a> J Cell Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).</li>
<li>Poloni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dedifferentiated+adipocytes+show+similar+properties+to+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).</li>
<li>Perrini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+gene+expression+and+cytokine+release+profiles+highlight+the+heterogeneity+of+distinct+subsets+of+adipose+tissue-derived+stem+cells+in+the+subcutaneous+and+visceral+adipose+tissue+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans.</a> PLoS One. 8 (3), e57892(2013).</li>
<li>Kishimoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteoblastic+differentiation+ability+of+human+dedifferentiated+fat+cells+is+higher+than+that+of+adipose+stem+cells+from+the+buccal+fat+pad%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Oral+Investig%22%5BJournal%5D)">The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad.</a> Clin Oral Investig. , (2013).</li>
<li>Kou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenotype+and+tissue-specific+nature+of+multipotent+cells+derived+from+human+mature+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The phenotype and tissue-specific nature of multipotent cells derived from human mature adipocytes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 444 (4), 543-548 (2014).</li>
<li>Jumabay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+derived+from+mouse+and+human+white+mature+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes.</a> Stem Cells Transl Med. 3 (2), 161-171 (2014).</li>
<li>Sugawara, A., Sato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+dedifferentiated+fat+cells+for+periodontal+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration.</a> Hum Cell. 27 (1), 12-21 (2014).</li>
<li>Kikuta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+effects+of+dedifferentiated+fat+cell+transplantation+in+rabbit+models+of+bone+defect+and+ovariectomy-induced+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomy-induced osteoporosis.</a> Tissue Eng Part A. 19 (15-16), 1792-1802 (2013).</li>
<li>Obinata, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+mature+adipocyte-derived+dedifferentiated+fat+%28DFAT%29+cells+improves+urethral+sphincter+contractility+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Urol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT) cells improves urethral sphincter contractility in a rat model.</a> Int J Urol. 18 (12), 827-834 (2011).</li>
<li>Jumabay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiated+fat+cells+convert+to+cardiomyocyte+phenotype+and+repair+infarcted+cardiac+tissue+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats.</a> J Mol Cell Cardiol. 47 (5), 565-575 (2009).</li>
<li>Ohta, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocyte-derived+cells%2C+dedifferentiated+fat+cells+%28DFAT%29%2C+promoted+functional+recovery+from+spinal+cord+injury-induced+motor+dysfunction+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats.</a> Cell Transplant. 17 (8), 877-886 (2008).</li>
<li>Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreno-Navarrete%2C+JMF-r+%22Adipose+Tissue+Biology%22">Adipose Tissue Biology</a>. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).</li>
<li>Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+models+for+differentiation%3A+preadipocytes+and+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%22%5BJournal%5D)">Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes.</a> Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).</li>
<li>Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+an+adipose+tissue+depot+for+sampling%3A+factors+in+selection+and+depot+specificity%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity).</a> Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).</li>
<li>Tchernof, A., Despres, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+human+visceral+obesity%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of human visceral obesity: an update.</a> Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).</li>
<li>Rodbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+Isolated+Fat+Cells.+I.+Effects+of+Hormones+on+Glucose+Metabolism+and+Lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis.</a> J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).</li>
<li>Watson, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Markers+and+Functional+Attributes+of+Human+Adipose-Derived+Stem+Cells+and+Dedifferentiated+Adipocyte+Cells+from+Subcutaneous+Fat+of+an+Obese+Diabetic+Donor%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Comparison of Markers and Functional Attributes of Human Adipose-Derived Stem Cells and Dedifferentiated Adipocyte Cells from Subcutaneous Fat of an Obese Diabetic Donor.</a> Adv Wound Care. 3 (3), 219-228 (2014).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Desdiferenciação de adipócitos maduros com a técnica de cultura de tecto é uma nova abordagem para a obtenção de células estaminais do tecido adiposo a partir de uma pequena amostra de tecido adiposo nativa. Com base em nossa experiência e na de outros dois, um grama de tecido é suficiente para a chapa um balão de 25 cm 2 e obter uma população de células DFAT para que homogeneidade tem sido demonstrado por Poloni e colaboradores 3. Adipócito desdiferenciação parece possível com células d...

A desdiferenciação in vitro de adipócitos maduros é alcançada por meio de uma técnica chamada cultura de teto1. Devido à sua tendência natural de flutuar em soluções aquosas, os adipócitos maduros isolados aderem à superfície de um frasco invertido totalmente preenchido com meio de cultura. Ao longo de alguns dias, as células modificam sua morfologia esférica e se tornam células semelhantes a fibroblastos. As células resultantes, chamadas de células de gordura desdiferenciada (DFAT), são multipotentes2. Artigos de pesquisa sobre desdiferenciação de adipócitos, especialmente em células humanas, são limitados. No entanto, eles já forneceram informações interessantes sobre multipotência, fenótipo celular e capacidade replicativa das células DFAT2. Os adipócitos maduros originários de vários compartimentos de gordura foram desdiferenciados com sucesso, incluindo aqueles originados dos tecidos adiposos visceral e subcutâneo humano2-4. Além desses depósitos, Kishimoto e colaboradores coletaram amostras de tecido adiposo das bolsas de gordura bucal e adipócitos desdiferenciados em células DFAT5. Matsumoto e colaboradores geraram com sucesso células DFAT subcutâneas de pacientes cobrindo uma ampla gama de idades, e a maioria das células teve uma alta taxa proliferativa e menos de 6% de senescência, mesmo após 10 passagens em cultura2.
DFAT as células foram rediferenciadas com sucesso em várias linhagens, incluindo linhagens adipogênicas, osteogênicas, condrogênicas e neurogênicas2,3,6. Essas células expressam vários marcadores de células-tronco embrionárias, como Nanog e os quatro fatores pluripotentes identificados Oct4, c-myc, Klf4 e Sox23. Eles também expressam marcadores específicos para cada uma das três camadas germinativas7. Além disso, as células DFAT são semelhantes às células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea (MSC derivadas de BM) com base em sua assinatura epigenética3. Explorando a capacidade das células-tronco das células DFAT, muitos grupos investigaram seu potencial para tratar ou melhorar várias doenças8,9. Melhorias de condições patológicas, como tecido cardíaco inferrado, lesão medular e disfunção do esfíncter uretral, foram observadas com injeções de células DFAT em modelos de doença em ratos10-12. 
Além das propriedades das células-tronco das células DFAT, elas podem representar um novo modelo celular para estudos de fisiologia de adipócitos. A linhagem celular 3T3-L1 é frequentemente usada para esse fim, pois essas células se diferenciam em adipócitos aderentes que armazenam lipídios sob estimulação adipogênica13. No entanto, essas células se originam do tecido embrionário de camundongo13. Além disso, a especificidade do depósito não pode ser investigada com este modelo e pode não refletir totalmente a fisiologia dos adipócitos humanos14. Outros laboratórios trabalham com células adiposas isoladas de depósitos de gordura murina, mas a distribuição de gordura não é dimórfica em camundongos e a configuração anatômica da cavidade abdominal do roedor impede a extrapolação direta para humanos15. Para estudar os adipócitos no contexto da fisiopatologia da obesidade humana, a consideração da distribuição da gordura corporal e das diferenças específicas do depósito de gordura tornou-se essencial16. Algumas limitações das culturas primárias de pré-adipócitos, incluindo quantidades de células obtidas de amostras de biópsia de tecido adiposo e sua senescência após algumas passagens na cultura, criaram a necessidade de modelos alternativos. Perrini e colaboradores investigaram a especificidade do depósito na expressão gênica de células DFAT originárias da gordura visceral e subcutânea e as compararam com células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASC) do mesmo depósito de gordura. Eles demonstraram que as diferenças na expressão e função gênica foram encontradas principalmente entre depósitos do que entre tipos de células, sugerindo que as células DFAT são fisiologicamente próximas do ASC do mesmo depósito. As células DFAT podem representar uma alternativa interessante aos modelos disponíveis para estudos sobre distribuição de gordura na fisiopatologia da obesidade humana. Além disso, a cultura de teto é um método promissor para obter células-tronco adultas para fins de engenharia de tecidos. 
Aqui, descrevemos a digestão da colagenase, uma técnica amplamente utilizada para isolar adipócitos maduros das amostras de gordura subcutânea e/ou visceral17, e as etapas subsequentes para realizar a cultura de teto e desdiferenciar essas células em células multipotentes, semelhantes a fibroblastos.

<table><tbody><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina</td><td>Sigma</td><td>A4036</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>Qualquer marca pode ser usada</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>Qualquer marca pode ser usada</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>Qualquer marca pode ser usada</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td></td><td></td><td>Qualquer marca pode ser usada</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td>Qualquer marca pode ser usada</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>Qualquer marca pode ser usada</td></tr><tr><td>Glicose</td><td></td><td></td><td>Qualquer marca pode ser usada</td></tr><tr><td>Tipo I colagenase</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>LS-004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, sem fenol vermelho</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11039-021</td><td>Adicione ao meio : 20% de soro de bezerro, gentamicina (50 &micro; g/ml) e fungizone (2,5 &micro; g/ml)</td></tr> <tr><td>Soro de bezerro, suplementado com ferro, de bezerros alimentados com fórmula</td><td>Sigma</td><td>C8056-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>1/2 Em bucha de plástico</td><td>Iberville</td><td>2704-CP</td><td>SKU:1000120918 (Home Depot)</td></tr><tr><td>Nitrogênio líquido</td><td>Linde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluton de formalina, tamponado neutro, 10%</td><td>SIGMA</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>estéreisTesoura <td></td><td></td><td></td><td>estéril</td></tr><tr><td>Seringas de 60 cc</td><td>Seringa</td><td></td><td></td>BD</tr><tr><td>Tubo de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plástico Krebs-Ringer-Henseleit tampão de estoque (KRH)</td><td></td><td></td><td>Prepare o tampão de estoque da seguinte forma: 25 mM HEPES pH 7,6, 125 mM NaCl, 3,73 mM KCl, 5 mM CaCl2,2H2O, 2,5 mM MgCl2,6H2O, 1 mM K2HPO4. Ajuste o pH para 7,4.</td></tr><tr><td>Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB)</td><td></td><td></td><td>Adicione os seguintes componentes recentemente ao tampão KRH: 4% de albumina de soro bovino, 5 mM de glicose, 0,1 &micro; M adenosina, 560 &micro; M ácido ascórbico</td></tr><tr><td>KRH-WB suplementado com colagenase</td><td></td><td></td> Tipo I <td>Adicionar 350 U/ml de colagenase Tipo I</td></tr><tr><td>T25 frasco de cultura de tecidos com tampa não ventilada</td><td>Sarsted ou outra marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 6 poços</td><td>BD Falcon ou outra marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura do microscópio 22x22</td><td>Fisherbrand</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Copos</td><td></td> <td>estéreis</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de adiposo humano stem cells através dedifferentiation de adipócitos maduros em culturas de teto

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Foi demonstrado que os adipócitos maduros revertem seu fenótipo em células semelhantes a fibroblastos in vitro por meio de uma técnica chamada cultura de teto. Os adipócitos maduros também podem ser isolados do tecido adiposo fresco para caracterização específica do depósito de sua função e propriedades metabólicas. Aqui, descrevemos um protocolo bem estabelecido para isolar adipócitos maduros de tecidos adiposos usando digestão de colagenase e etapas subsequentes para realizar culturas de teto. Resumidamente, os tecidos adiposos são incubados em um tampão Krebs-Ringer-Henseleit contendo colagenase para romper a matriz tecidual. Os adipócitos maduros flutuantes são coletados na superfície superior do tampão. As células maduras são colocadas em um frasco T25 completamente cheio de meio e incubadas de cabeça para baixo por uma semana. Uma abordagem alternativa de cultura em placas de 6 poços permite a caracterização de adipócitos em desdiferenciação. A morfologia dos adipócitos muda drasticamente ao longo do tempo de cultivo. A imunofluorescência pode ser facilmente realizada em lâminas cultivadas em placas de 6 poços, conforme demonstrado pela coloração de imunofluorescência FABP4. A proteína FABP4 está presente em adipócitos maduros, mas regulada negativamente por meio da desdiferenciação das células adiposas. A desdiferenciação de adipócitos maduros pode representar um novo caminho para a terapia celular e engenharia de tecidos.

As principais alterações morfológicas ocorrer a amadurecer adipócitos durante desdiferenciação (Figura 1). Como mostrado na Figura 2, as células submetidas a desdiferenciação foram coradas com um anticorpo anti-FABP4 para análise de fluorescência. As células com uma morfologia redonda expressa a proteína FABP4 enquanto a maioria das células semelhantes a fibroblastos não o fez. Depois de desdiferenciação, células DFAT pode ser cultivada com os procedimentos padrão para diversas passagen...

Os adipócitos maduros podem representar uma fonte abundante de células-tronco por meio da desdiferenciação, o que leva a uma população homogênea de células semelhantes a fibroblastos. A digestão da colagenase é usada para isolar adipócitos maduros da gordura humana. O objetivo do nosso protocolo é obter células de gordura multipotentes e desdiferenciadas a partir de adipócitos humanos maduros.

Geração de adiposo humano Stem Cells através Dedifferentiation de adipócitos maduros em Culturas de teto

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Os depósitos maduros têm a capacidade de se diferenciarem em células precursoras in vitro. Isso é conseguido por meio do cultivo em selo, uma técnica na qual células maduras são cultivadas em um frasco completamente preenchido com meio de cultura e mantido em posição invertida. As células flutuantes aderem ao frasco e alteram sua morfologia, passando de uma célula redonda rica em lipídios para uma célula alongada semelhante a um fibroblasto. Homogêneo.Populações de células alongadas podem ser obtidas e tratadas após o recebimento de amostras de tecido no laboratório. Pese os tecidos adiposos, dependendo do número de adipócitos necessários, e coloque um volume apropriado da amostra em um tubo de 50 ml. Após a digestão, espera-se obter aproximadamente 1 milhão de células por grama de tecido.Culturas em teto são realizadas com 500.000 células por frasco de 25 centímetros e 50.000 células para cada poço de uma placa de seis poços, adicionando tampão KRH em trabalho suplementado com colagenase, picando o tecido com tesoura e incubando a preparação a 37 graus Celsius por 45 minutos. Durante a incubação, prepare o conjunto de tubos e seringa. Despeje a solução translúcida através de uma malha de náilon em um béquer de plástico com pinça.Esfregue a preparação celular através da malha e lave com cinco ml do tampão KRH em trabalho delicadamente. Transfira a suspensão celular filtrada para um tubo de 50 ml com conjunto de tubo e seringa. Deixe os adipócitos maduros repousar por aproximadamente 10 minutos.As células atingirão o topo do tampão por flutuação. Aspire lentamente o tampão a partir da parte inferior. Usando uma seringa e tubo, adicione 20 ml de tampão KRH em trabalho para lavar.Repita os passos de lavagem duas vezes. Colete o tampão para levar a suspensão de adipócitos a um volume final de cinco ml e prossiga para contagem das células utilizando um hemocitômetro, encha um frasco T 25 até três quartos de seu volume com D-M-E-M-F 12 suplementado com 20% de soro de bezerro, transfira 500.000 adipócitos maduros para o frasco. Complete o volume do frasco com meio e remova as bolhas de ar da superfície superior.Parafuse uma tampa inventada no frasco. Incube o frasco de cabeça para baixo por uma semana em uma incubadora de cultura celular com 5% de dióxido de carbono. Evite movimentar o frasco, pois as bolhas remanescentes podem interferir na aderência celular.Coloque uma lamínula na parte inferior dos poços. Adicione o bucha plástica no poço e preencha o poço com oito ml de meio. Certifique-se de que não haja bolhas.Coloque uma lamínula sobre o bujão, deixando um espaço para inserir a ponteira da pipeta. Colete 50.000 células e injete-as posicionando a ponteira entre a lamínula e o bujão. Incube a placa em uma incubadora de cultura celular com 5% de dióxido de carbono por uma semana ou menos.Dependendo do desenho do experimento, são necessários pelo menos três dias para que as células adiram à lamínula em uma placa diferente. Inverta as lamínulas em dois mls de meio. Em culturas contínuas, as lamínulas podem então ser fixadas em formalina para experimentos de imunofluorescência ou para extrações de D-N-A-R-N-A e Proteína.A desdiferenciação de adipócitos maduros causa grandes alterações na morfologia celular. Durante esse processo, os adipócitos perdem seu fenótipo e reduzem a expressão de transcritos normalmente associados à sua função de armazenamento de lipídios. Esta imagem de imunofluorescência representa células adiposas em diversos estágios de desdiferenciação.As células com morfologia arredondada ainda expressam FABP4, um marcador de adipócito maduro, enquanto as células alongadas não o expressam mais, com base na literatura. Células adiposas diferenciadas, frequentemente chamadas de células adiposas D, podem ser obtidas de pacientes jovens, idosos, magros ou com base OB. Sua capacidade de cultura de longo prazo e sua comprovada multipotência.Gosto também do seu potencial para engenharia de tecidos e terapia celular. Elas podem representar um novo modelo para a investigação específica da fisiologia de adipócitos.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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Aprenda a gerar células-tronco adiposas humanas por desdiferenciação de adipócitos maduros usando digestão com colagenase e cultura de teto. Este método fornece populações homogêneas para pesquisa em engenharia de tecidos.

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