Zebrafish queratinócitos explantes para estudar migração celular Collective e reepitelização na cicatrização de feridas cutâneas

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer culturas explicativas de queratócitos de peixe-zebra para uso em estudos de migração celular coletiva e cicatrização de feridas epiteliais. Isso é feito removendo primeiro as escamas com tecido epitelial anexado do peixe-zebra adulto anestesiado. As escamas com tecido anexado são colocadas em uma placa de cultura para permitir que as células adiram.

Em seguida, o meio de cultura é adicionado junto com quaisquer tratamentos indicados pelo planejamento experimental. Finalmente, as células são incubadas e observadas por microscopia de vídeo pelo período de tempo desejado. Em última análise, uma variedade de ensaios pode ser usada para demonstrar mudanças na migração ou morfologia celular, bem como a expressão de proteínas ou outros marcadores ao longo do tempo.

A principal vantagem desta técnica sobre o método existente, como o método de cultura de células transformadas, é que a cultura de explantes é primária, que se reagrupa de perto com as propriedades da célula in vivo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da cicatrização de feridas epiteliais, como o papel da migração coletiva e da transição epitelial para mesenquimal. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque as escamas podem não se prender à superfície de crescimento ou podem não crescer em qualquer placa de cultura.

Demonstrando este procedimento estarão Jose Rap PanIN, estudante de medicina, Chana TI e Agnes Pasquale, ambos pesquisadores associados seniores em meu laboratório. Para se preparar para este experimento, desclore aproximadamente 1,5 litro de água da torneira usando um agente de descloração comercial ou deixando a água repousar por 24 horas e, em seguida, use 500 mililitros para encher cada um dos três copos de um litro. Rotule um copo para segurar o peixe antes de qualquer procedimento e um segundo para recuperação no terceiro copo.

Adicione 100 microgramas por mililitro de trica. Para anestesiar peixes, encha uma bandeja rasa com gelo. Aqueça o meio de cultura à temperatura ambiente e reúna pinças de joalheiro limpas.

Limpe as pinças mergulhando as pontas em etanol a 70% e passando-as por um bico de bunsen, permitindo que o etanol queime. Pegue o número desejado de peixes e coloque em um copo de armazenamento. Transfira um único peixe para o béquer de anestesia.

Depois de anestesiar o peixe de acordo com o protocolo de texto, transfira-o para o gelo e coloque-o horizontalmente com a cauda voltada para a mão que segura a pinça. Para retirar as escamas, posicione a pinça paralelamente ao peixe. Com a ponta na borda de uma escama, pressione o lado plano da pinça levemente na lateral do peixe para fazer com que a escama se eleve do corpo do peixe.

Use a pinça para segurar a balança, depois arranque-a e, sem invertê-la, coloque-a na placa de cultura de tecidos. Repita o procedimento, removendo no máximo 12 escamas de um adulto grande, evitando a região branquial, a linha lateral e as nadadeiras. Coloque o peixe no copo de recuperação e monitore para garantir que ele se recupere dos efeitos da anestesia.

Em seguida, transfira o peixe para um tanque individual e deixe o peixe se recuperar por 21 dias para permitir a regeneração completa da escama. Dependendo do experimento, coloque até 20 escalas por plástico. Prato tratado com cultura de tecidos de 35 milímetros, ou quatro a seis escalas por copo.

Prato inferior, deixe as escamas aderirem ao prato antes de adicionar suavemente 1,2 mililitros de meio completo a cada prato de cultura. Incubar as culturas X explanadas a 28 graus Celsius pelo período de tempo desejado com ou sem tratamento para realizar microscopia. Depois de remover um prato contendo folhas de células da incubadora, posicione-o no microscópio stage.

Use uma objetiva de quatro x para focar inicialmente para facilitar a captura de imagens ao longo do tempo. Marque a localização de cada folha de célula e/ou a orientação do prato no palco. Fotografe as folhas de células em vários pontos de tempo de acordo com o protocolo experimental e, se apenas imagens estáticas forem necessárias para o experimento, coloque de volta na incubadora.

Para fixar amostras para microscopia de imunofluorescência, prepare e pré-aqueça as soluções à temperatura ambiente. Para visualizar os locais OSE sob fluorescência, use placas de cultura de prato de 35 milímetros com fundo de vidro para cultivar berinjelas conforme descrito anteriormente neste vídeo, sem remover o meio de cultura, adicione 0,8 mililitros de 4% de paraldeído em 1,1 XPBS a cada prato. Incube em temperatura ambiente por cinco minutos.

Em seguida, aspire a solução. Adicione mais 0,8 mililitros de fixador a cada prato e, após uma segunda incubação de cinco minutos, aspire a solução. A menos que esteja usando ligantes externos ou epítopos, faça permanente nas células adicionando 0,5 mililitros de 0,2% TRITTON X 100 em uma incubação XPBS por cinco minutos.

Antes de remover a solução, adicione 0,5 mililitros de 1% BSA em um XPBS e incube em temperatura ambiente por uma hora ou a quatro graus Celsius durante a noite após a incubação, aspire a solução e prossiga com a coloração de anticorpos. Como alternativa, adicione um a dois mililitros de 1% BSA em um XPBS e armazene a quatro graus Celsius por três a quatro semanas. Realize a imunofluorescência.

De acordo com o protocolo de texto ilustrado aqui, folhas de queratócitos podem ser observadas migrando de baixo da escama poucas horas após o estabelecimento da cultura EXPLAN. Ocasionalmente, um queratinócito de migração individual, que se separou da lâmina de migração coletiva, pode ser observado. A taxa inicial de avanço da folha é extremamente rápida, mas essa taxa diminui rapidamente à medida que as células se espalham durante as primeiras 48 horas de cultura.

O rápido aumento não está associado à proliferação celular, pois após a marcação por 24 horas com o EDU fluorescente, aproximadamente 10% das células mostram evidências de divisão celular uma taxa muito menor do que a observada em linhagens celulares transformadas. Quando o tratamento é adicionado no momento em que X explan é estabelecido, alguns compostos alteram a migração celular coletiva. Por exemplo, como mostrado aqui, alguns inibidores de MMP diminuem a área da folha celular após 24 horas.

Em cultura, quando o peptídeo contendo RGD solúvel é adicionado ao meio de cultura para interromper a formação de adesão, o claudicante na borda de ataque da folha encolhe rapidamente e, subsequentemente, a borda de ataque da folha se desprende e se retrai e menos de dois minutos para avaliar a localização de proteínas dentro da folha ou dentro de células de litro e seguidoras, A folha inteira pode ser fixada e manchada conforme mostrado nesta figura. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 10 a 15 minutos se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de adicionar meios de cultura pré-aquecidos somente depois de dar tempo para que os citos adiram à placa de cultura seguindo este procedimento.

Outro método como o QPCR pode ser realizado para responder a qualquer pergunta adicional, como alterações na expressão gênica em relação ao tempo e/ou condição de tratamento. Depois de assistir a este procedimento, você deve ter uma ideia muito melhor de como estabelecer culturas de explicação IDE para uso em uma variedade de procedimentos.