Um Guia para a geração e uso hiPSC NPCs derivados para o Estudo das Doenças Neurológicas

O objetivo geral deste procedimento é gerar células progenitoras neurais ou NPCs a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas ou hiPSCs como uma plataforma para estudar os mecanismos celulares e moleculares que contribuem para doenças neurológicas. Isso é realizado primeiramente diferenciando hiPSCs usando inibidores duplos da via SMAD em rosáceas neurais. O segundo passo consiste em colher essas rosáceas neurais e permitir que cresçam em populações expansíveis de NPCs.

Em seguida, transdução com lentivírus com infecção por centrifugação. Esse passo para melhorar a eficiência é utilizado para manipular a expressão gênica. O passo final é cultivar as NPCs em suspensão para que formem espontaneamente neuroesferas.

Por fim, esta plataforma pode ser utilizada para analisar uma variedade de fenótipos celulares. Por exemplo, medir o efeito da manipulação genética na neuro-migração. Embora este método possa fornecer informações sobre mecanismos celulares, como a migração.

Também pode ser aplicado para estudar outros processos biológicos, como replicação, estresse oxidativo, apoptose e crescimento de neurites. A diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas humanas ou PSCs altas leva à formação de rosáceas neurais visíveis, caracterizadas como aglomerados arredondados de células neuroepiteliais com polaridade apicobasal, para a seleção enzimática de rosáceas neurais no dia 14. Aspire o meio dos corpos embrionários aderidos ou EBEs e adicione um mililitro de reagente de seleção de rosáceas neurais por poço de uma placa de seis poços, incubando a 37 graus Celsius por uma hora.

Após uma hora. Utilize um pipetador P1000 para remover suavemente a enzima de cada poço e adicione um mililitro de D-M-E-M-F12 por poço. Para lavar as rosáceas, recolha o mililitro de D-M-E-M-F12 e expulse-o rapidamente de volta para o poço, destacando assim as rosáceas da placa.

Colete as rosetas em um tubo de falcão. Pipete outro mililitro de DMEM/F12 e expulse rapidamente no mesmo poço para destacar as rosetas remanescentes. Não tente e evite quebrar os agregados de rosetas. Colete as rosetas neurais no mesmo tubo de falcão.

Pode-se adicionar mais enzima e repetir este procedimento caso as rosetas não se soltem facilmente quando todas as rosetas neurais tiverem sido coletadas. Centrifugue o tubo Falcon a 300 G por três minutos. Aspire a solução de lavagem e ressuspense.

Suspenda as rosetas em dois mililitros de meio de células progenitoras neurais. Transfira as células para uma placa de seis poços revestida com laminina de poli-L-ornitina e cultive a 37 graus Celsius por uma semana. Neste laboratório, as células progenitoras neurais ou NPCs são cultivadas em placas de matrigel, alimentadas a cada dois dias e mantidas em alta densidade.

Para dividir as NPCs, primeiro aspire o meio e, em seguida, adicione um mililitro de accutase aquecido por poço de uma placa de seis poços e incube a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Transfira suavemente as células destacadas para um tubo de 15 mililitros contendo D-M-E-M-F 12 com o mínimo estresse mecânico possível. Não triture as células durante o processo. Peline as células por centrifugação a 1000 ×g por cinco minutos; após a centrifugação, aspire o sobrenadante e re-suspenda as NPCs.

Em cerca de um mililitro de meio NPC por poço original de uma placa de seis poços, espera-se de cinco a dez milhões de células por poço confluente de uma placa de seis poços após a ressuspensão e contagem celular. Repique a placa de NPCs com aproximadamente um a dois milhões de células por poço de uma placa de seis poços para manter os NPCs. A eficiência da formação de neuroesferas varia entre experimentos e linhagens celulares, mas geralmente ocorre melhor quando entre 200.000 e um milhão de células são semeadas por poço de uma placa de seis poços não aderente; se ocorrer agregação, reduza o número de células semeadas. Idealmente, dentro de um a dois dias após a divisão.

Os NPCs de NP devem ser transduzidos com vetores lentivirais ou retrovirais para aumentar a porcentagem de células transfectadas. Utilize infecção por centrifugação. Aspire o meio de cada poço e substitua pelos lentivírus ou retrovírus relevantes de superexpressão ou controle, titulados na multiplicidade de infecção desejada e diluídos.

No meio NPC, utilize 1,5 mililitro por poço de uma placa de seis poços, gire a 1000 G e temperatura ambiente por uma hora em uma centrífuga de placa. Após a centrifugação, devolva a placa ao incubador para reduzir a morte celular. Substitua o meio dentro de oito horas após a infecção com centrifugação.

Inicie este procedimento lavando os neuroesferoides derivados de NPC uma vez no meio de NPC para remover detritos celulares. Incline a placa em um ângulo de 45 graus e permita que os neuroesferoides sedimentem; em seguida, remova o máximo de meio possível sem aspirar os neuroesferoides. Substitua por meio fresco.

Em seguida, selecione manualmente as ESFERAS NEURAIS derivadas de NPC sob um microscópio usando uma pipeta P200, transferindo uma esfera neural para cada poço de uma placa de 96 poços revestida com matrigel. É importante selecionar esferas neurais de tamanhos semelhantes para reduzir a variabilidade nos resultados. Adicione 0,5 miligramas adicionais de matrigel diluído em meio para NPC frio às esferas neurais em cada placa de 96 poços.

Usando uma ponteira de pipeta, posicione manualmente cada neuroesfera individual no centro do poço. Permita que a migração da neuroesfera ocorra por 48 horas. Após fixar e corar as células com os marcadores imunohistoquímicos desejados, fotografe as neuroesferas por completo utilizando um objetivo de microscópio Forex. Para medir a migração radial, utilize o software ImageJ.

Use a ferramenta de seleção manual para traçar manualmente a borda das células mais distantes migradas. Certifique-se de que a área esteja marcada na janela de configurações de medição localizada na guia analisar. Em seguida, utilize a função medir para calcular a área da forma resultante.

Utilize o valor da medida da área e a equação da área de um círculo para determinar o raio externo da mesma forma, traçando a borda da neuroesfera original. Meça a área e calcule o raio interno. Calcule a migração radial total como a diferença entre os raios externo e interno.

Essas imagens mostram as etapas da diferenciação neural de PSCs altas, desde PSCs altas até corpos embrionários, rosetas neurais, NPCs e neurônios. NPCs validados expressam o marcador de NPCs nestina e o fator de transcrição de células-tronco neurais SOX2 na maioria das células. A marcação para tubulina beta três também é visível em todas as populações de NPCs. Os NPCs também expressam o fator de transcrição de células-tronco neurais PAX6 e o marcador de progenitores de cérebro anterior FOXG1.

TBR2, mas não marcadores de mesencéfalo, como LMX1A e FOXA2, NPCs podem se diferenciar em 70 a 80% de neurônios positivos para beta3-tubulina, mostrados em verde, e 20 a 30% de astrócitos positivos para proteína ácida fibrilar glial, mostrados em vermelho, NPCs de alta qualidade e de alta PSC. NPCs expressam nestina e SOX2 na maioria das células, enquanto NPCs de baixa qualidade apresentam áreas de células negativas para SOX2 e apenas células negativas para nestina. Neurônios de quatro semanas diferenciados a partir de NPCs de alta qualidade expressam MAP2AB e beta3-tubulina.

Após transdução bem-sucedida com um vetor lentiviral ou retroviral de alto título. Mais de 80% das células são marcadas pelo repórter fluorescente. A inclusão no vetor da geração de neuroesferas resulta em uma população de neuroesferas de tamanho relativamente homogêneo, que pode permanecer saudável em cultura por aproximadamente uma semana.

Com alimentação regular, a migração de neuroesferas ocorre de forma robusta em neuroesferas saudáveis, conforme ilustrado por estas imagens de campo claro antes e após 48 horas de migração em Matrigel após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da esquizofrenia explorarem a neuro-migração em NPCs derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas. Não se esqueça de que trabalhar com um retrovírus pode ser potencialmente perigoso e todo o trabalho de cultura de tecidos deve ser realizado em condições de BL dois mais quando houver presença potencial de vírus.