Avaliação experimental de rato Sociabilidade utilizando uma abordagem de processamento de imagem automatizado
15 de maio de 2016
Este protocolo descreve um método para quantificar a sociabilidade rato. Os ratos são filmadas enquanto se movem e interagem em uma gaiola especial. Processamento de filme permite a quantificação automática de sociabilidade com excelente precisão e confiabilidade.
O objetivo geral desses experimentos comportamentais combinados com a análise automática é quantificar a sociabilidade dos camundongos de maneira eficiente em termos de tempo. Este método pode ajudar na triagem rápida de drogas para aumentar a sociabilidade em modelos de camundongos validados de transtornos do espectro do autismo. A principal vantagem da introdução da análise automatizada é que ela acelera o processo e torna a triagem mais eficiente.
A necessidade de um método automatizado para avaliar o comportamento social do camundongo surgiu porque a triagem visual em tempo real de uma única dose de um composto candidato leva mais de 50 horas. Mais tarde no vídeo, meu aluno de pós-graduação Frency Varghese demonstrará a análise automatizada. Comece com a configuração da gaiola de paredes pretas de três compartimentos.
Para a primeira sessão, coloque um copo de arame invertido vazio em cada compartimento final da gaiola. Agora prepare a câmera de vídeo para ver a gaiola de cima. Todos os três compartimentos devem ser vistos com uma resolução de pelo menos 720 por 480 pixels.
Em seguida, ilumine a gaiola com iluminação incandescente indireta de modo que o interior da gaiola, quando medido a partir do chão, não tenha mais de 3,5 Lux. Forneça também luz infravermelha para iluminar a gaiola em um nível que a câmera possa detectar. Tire uma imagem de quadro único da gaiola vazia para referência.
Para a primeira sessão, coloque o mouse de teste na gaiola. Em seguida, para enfileirar a análise automatizada do vídeo, acene com a mão sobre a gaiola apenas uma vez. Deixe o rato explorar a gaiola de teste por 10 minutos.
Em seguida, devolva-o à sua gaiola inicial. Para a segunda sessão, coloque o mouse de estímulo sob um dos dois copos invertidos. Selecione qual copo de forma contundente.
No software, indique em qual copo o mouse de estímulo foi colocado. Para convenções de nomenclatura, o copo que contém o mouse incluído é o copo social, enquanto o outro copo é o copo não social. Os compartimentos são nomeados de maneira semelhante.
Enfileire o início da segunda sessão com um aceno de mão como na primeira sessão. No final da segunda sessão, remova os copos invertidos para liberar o segundo mouse. Use outro aceno de mão para indicar o início da terceira sessão e deixe os dois ratos interagirem na gaiola de teste por 10 minutos.
Após 10 minutos, retorne os dois ratos às gaiolas de casa. Esta seção explica como processar os filmes usando a interface do usuário. No entanto, uma análise rápida do modo de lote sem entrada do usuário também é possível.
Comece carregando o filme usando o botão Carregar. Em seguida, selecione a configuração da gaiola. O programa de análise localiza os limites, compartimentos e copos da gaiola.
Selecione uma das quatro configurações predefinidas ou ajuste manualmente as coordenadas. Agora, para cada quadro do filme, execute as seguintes etapas de processamento. Primeiro converta os quadros em tons de cinza.
Em segundo lugar, subtraia o quadro de referência em tons de cinza feito durante os preparativos, zerando assim os valores de pixel em todos os lugares, exceto na posição do mouse. Terceiro, binarize os quadros definindo todos os pixels acima de um limite de brilho para branco e tornando todos os outros pretos. Ajuste esta configuração para corresponder às condições de iluminação.
Agora remova a cauda das imagens usando a função Corroer / Dilatar. Primeiro corroa a imagem binarizada três vezes. Em seguida, dilate o quadro seis vezes.
Em seguida, corroa os quadros mais três vezes. Isso pode exigir ajuste se uma resolução de pixel diferente for usada. As ondas de mão são facilmente identificadas como grandes saltos no volume de pixels brancos.
Isso permite a detecção automática de inícios e ordens de sessão de sessão. Em cada sessão, detecte o maior componente de pixels brancos usando o comando L/Comp. Isso elimina os pixels que não pertencem ao mouse.
Em seguida, use a função Find Ends para determinar os dois pixels mais distantes dentro do maior componente de pixels brancos. Estes são o nariz e a cauda. O software determina o centro de gravidade ou COG para o objeto de pixel branco e calcula sua direção de movimento de quadro a quadro.
Para sessões com dois mouses, dois objetos devem ser rastreados. Selecione e oriente os dois maiores objetos de pixel branco usando o mesmo conjunto de comandos. O software verifica automaticamente os COGs de quadro a quadro.
Se um dos objetos mudar de tamanho em mais de 20% ou um COG se mover mais longe do que o possível para um mouse, o limite de binarização será aumentado automaticamente até que esses critérios sejam atendidos. O software verifica automaticamente os centros de gravidade de quadro a quadro. Se um dos objetos mudar de tamanho em mais de 20% ou um centro de gravidade se mover mais longe do que o possível para um mouse, o limite de binarização será ajustado automaticamente até que esses critérios sejam atendidos.
As interações são detectadas automaticamente quando os objetos estão dentro de dois centímetros. Esses segmentos são reproduzidos para entrada do usuário. Para cada segmento, rotule a perspectiva do mouse de teste como Evitação social, Abordagem social ou Nenhuma.
Para verificar a análise automática, carregue o filme usando o botão Carregar. Em seguida, clique em Iniciar Sessão 1 para exibir o primeiro quadro dessa sessão. Use o comando Reproduzir/Parar para controlar a reprodução.
Os filmes processados mostram cada rato com um círculo de cores diferente em suas cabeças e caudas. Além disso, as medidas de sociabilidade são exibidas na tela e atualizadas durante a reprodução. Corrija quaisquer erros encontrados na análise automatizada.
O erro mais comum é um flip cabeça-cauda que pode ser corrigido com uma ferramenta na interface. Isso ocorre em cerca de 20% dos vídeos. No caso raro de um erro mais complicado, eles geralmente podem ser resolvidos indicando manualmente a localização do nariz do mouse em uma determinada série de quadros de vídeo.
Uma vez verificados, exporte os dados de sociabilidade em formato de planilha usando a função Exportar. Para exportar dados de vários filmes como uma única planilha, os filmes devem ser agrupados em uma pasta e a função Compilar Dados faz a operação. Na primeira sessão, um camundongo de teste BALB/c de quatro semanas foi rastreado movendo-se entre os compartimentos 59 vezes ao longo de 10 minutos.
O tempo gasto em cada compartimento é considerado uma linha de base para a preferência do compartimento sem estímulo social. Na segunda sessão, um copo social e não social foi apresentado com um camundongo ICR de quatro semanas escondido. Havia uma clara tendência para passar o tempo no compartimento social.
Especificamente, o rato passou mais tempo com o copo social do que com o copo não social. Na terceira sessão, os copos foram levantados e os camundongos foram autorizados a interagir. No total, 35 abordagens sociais foram feitas em 10 minutos.
Após seu desenvolvimento, essa técnica facilita a triagem mais rápida de medicamentos promissores para melhorar o domínio central dos sintomas de sociabilidade prejudicada em modelos de camundongos validados de transtornos do espectro do autismo. O processamento automatizado pode ser adaptado a diferentes designs e espécies de gaiolas. Qualquer comportamento de interesse pode ser avaliado, desde que um algoritmo para detectá-lo de forma confiável possa ser desenvolvido.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para quantificar a sociabilidade de camundongos utilizando análise automatizada de gravações em vídeo. A abordagem aumenta a eficiência do triagem de sociabilidade em modelos de camundongos de transtornos do espectro autista.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Análise Comportamental
- Pesquisa em Autismo
Antecedentes
- A avaliação da sociabilidade em camundongos é fundamental para compreender os comportamentos sociais.
- Os métodos tradicionais são demorados e intensivos em mão de obra.
- A análise automatizada pode reduzir significativamente o tempo necessário para avaliações de sociabilidade.
- Este método é particularmente relevante para triagem de fármacos na pesquisa do autismo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método eficiente no tempo para quantificar a sociabilidade em camundongos.
- Facilitar a triagem rápida de compostos que possam aumentar a sociabilidade.
- Melhorar a precisão e a confiabilidade das avaliações de sociabilidade.
Métodos Utilizados
- Gravação em vídeo de camundongos em uma gaiola especialmente projetada com três compartimentos.
- Processamento automatizado dos dados de vídeo para quantificação da sociabilidade.
- Comparação dos resultados com os métodos tradicionais de triagem visual.
- Demonstração do processo de análise automatizada.
Resultados Principais
- O método automatizado fornece medições precisas e confiáveis da sociabilidade.
- Reduz significativamente o tempo necessário para avaliações de sociabilidade.
- Permite a triagem eficiente de fármacos em modelos de camundongos.
- Demonstrou eficácia em uma configuração experimental real.
Conclusões
- A análise automatizada é uma ferramenta valiosa para avaliar a sociabilidade de camundongos.
- Este método pode acelerar pesquisas em transtornos do espectro autista.
- Estudos futuros podem se basear nesta abordagem para investigações comportamentais adicionais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação automatizada da sociabilidade em camundongos permite a triagem rápida de compostos que visam déficits de comportamento social em modelos validados de transtornos do espectro autista. Ao reduzir o tempo de avaliação de mais de 50 horas por dose para um processamento eficiente em lotes, este método apoia a validação de alvos em alta produtividade e a identificação de compostos líderes. Ele fornece leituras comportamentais quantitativas e reprodutíveis que melhoram a confiança preditiva nas decisões iniciais de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Quantifica a sociabilidade por meio do tempo gasto próximo a estímulos sociais versus não sociais e da contagem de aproximações sociais, permitindo a investigação mecanicista de hipóteses terapêuticas.
- Valor Operacional: O rastreamento automático do nariz e a análise de movimento eliminam a pontuação manual, aumentando a produtividade e reduzindo a variabilidade entre observadores.
- Valor Preditivo: Gera métricas de sociabilidade com resposta dose-dependente que apoiam a redução de riscos dos alvos e a triagem de portfólios na descoberta de fármacos para o sistema nervoso central.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Aparelho padronizado com três compartimentos e análise automatizada de vídeo cria uma plataforma reprodutível para avaliação da sociabilidade.
- Saídas Quantitativas: Mede transições entre compartimentos, tempo na zona social e eventos de aproximação/evitação social como variáveis contínuas para triagem de compostos.
- Escalabilidade: Capacidade de processamento em lote permite avaliar múltiplos compostos em paralelo, apoiando a progressão de "hit" a líder.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela diretamente a sociabilidade prejudicada, um domínio sintomático central nos transtornos do espectro autista, permitindo o alinhamento translacional de biomarcadores.
- Continuidade Pré-clínica: Permite a avaliação longitudinal de alterações na sociabilidade ao longo de diferentes regimes de tratamento em modelos murinos validados.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Dados objetivos sobre sociabilidade orientam decisões de avançar/não avançar, reduzindo a ambiguidade mecanicista nos fenótipos comportamentais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se no continuum de descoberta que vai da verificação da hipótese sobre o alvo até a identificação de compostos ativos e a avaliação de eficácia pré-clínica, oferecendo a sociabilidade como um ponto final quantificável para compostos que modulam o comportamento social.
- Biologia da Descoberta: Permite a avaliação orientada por hipóteses dos mecanismos de sociabilidade ao quantificar a preferência por interação social e comportamentos de aproximação.
- Triagem: Fornece escores padronizados e automatizados de sociabilidade que apoiam a reprodutibilidade do ensaio e a comparação de compostos entre placas e dias.
- Análises: Gera índices numéricos de sociabilidade (tempo, transições, contagens de aproximações) que facilitam a análise estatística e a modelagem de relações estrutura-atividade.
- Pesquisa Translacional: Estabelece conexão com a relevância clínica ao modelar um domínio diagnóstico central do autismo, apoiando a validação pré-clínica alinhada a biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: O fluxo de trabalho automatizado adapta-se a diferentes designs de gaiolas e espécies, permitindo aplicação transversal em programas de farmacologia comportamental.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece medidas objetivas e quantitativas da sociabilidade que reduzem a subjetividade e aumentam a confiança no engajamento do alvo.
- Valor Operacional: A automação reduz o tempo de manipulação por ensaio de horas para minutos, permitindo campanhas de triagem de alto rendimento.
- Valor Estratégico: Acelera a otimização de compostos líderes ao fornecer retorno rápido sobre sociabilidade, melhorando a eficiência do capital em programas do SNC.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em perfis robustos de sociabilidade em modelos relevantes para a doença.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em neurociência comportamental e algoritmos de rastreamento de vídeo para configuração e validação.
- Exige iluminação padronizada, câmera com capacidade infravermelha e resolução mínima de 720x480 para detecção confiável do nariz.
- Exige temporização consistente das sessões e posicionamento dos estímulos contrabalançado para evitar viés posicional.
- Envolve verificação manual da orientação cabeça-cauda em cerca de 20% dos vídeos para corrigir erros de rastreamento automatizado.
- Depende do ajuste do limiar de binarização para manter a precisão do rastreamento sob diferentes condições de iluminação e linhagens de camundongos.
