Avaliação experimental de rato Sociabilidade utilizando uma abordagem de processamento de imagem automatizado

O objetivo geral desses experimentos comportamentais combinados com a análise automática é quantificar a sociabilidade dos camundongos de maneira eficiente em termos de tempo. Este método pode ajudar na triagem rápida de drogas para aumentar a sociabilidade em modelos de camundongos validados de transtornos do espectro do autismo. A principal vantagem da introdução da análise automatizada é que ela acelera o processo e torna a triagem mais eficiente.

A necessidade de um método automatizado para avaliar o comportamento social do camundongo surgiu porque a triagem visual em tempo real de uma única dose de um composto candidato leva mais de 50 horas. Mais tarde no vídeo, meu aluno de pós-graduação Frency Varghese demonstrará a análise automatizada. Comece com a configuração da gaiola de paredes pretas de três compartimentos.

Para a primeira sessão, coloque um copo de arame invertido vazio em cada compartimento final da gaiola. Agora prepare a câmera de vídeo para ver a gaiola de cima. Todos os três compartimentos devem ser vistos com uma resolução de pelo menos 720 por 480 pixels.

Em seguida, ilumine a gaiola com iluminação incandescente indireta de modo que o interior da gaiola, quando medido a partir do chão, não tenha mais de 3,5 Lux. Forneça também luz infravermelha para iluminar a gaiola em um nível que a câmera possa detectar. Tire uma imagem de quadro único da gaiola vazia para referência.

Para a primeira sessão, coloque o mouse de teste na gaiola. Em seguida, para enfileirar a análise automatizada do vídeo, acene com a mão sobre a gaiola apenas uma vez. Deixe o rato explorar a gaiola de teste por 10 minutos.

Em seguida, devolva-o à sua gaiola inicial. Para a segunda sessão, coloque o mouse de estímulo sob um dos dois copos invertidos. Selecione qual copo de forma contundente.

No software, indique em qual copo o mouse de estímulo foi colocado. Para convenções de nomenclatura, o copo que contém o mouse incluído é o copo social, enquanto o outro copo é o copo não social. Os compartimentos são nomeados de maneira semelhante.

Enfileire o início da segunda sessão com um aceno de mão como na primeira sessão. No final da segunda sessão, remova os copos invertidos para liberar o segundo mouse. Use outro aceno de mão para indicar o início da terceira sessão e deixe os dois ratos interagirem na gaiola de teste por 10 minutos.

Após 10 minutos, retorne os dois ratos às gaiolas de casa. Esta seção explica como processar os filmes usando a interface do usuário. No entanto, uma análise rápida do modo de lote sem entrada do usuário também é possível.

Comece carregando o filme usando o botão Carregar. Em seguida, selecione a configuração da gaiola. O programa de análise localiza os limites, compartimentos e copos da gaiola.

Selecione uma das quatro configurações predefinidas ou ajuste manualmente as coordenadas. Agora, para cada quadro do filme, execute as seguintes etapas de processamento. Primeiro converta os quadros em tons de cinza.

Em segundo lugar, subtraia o quadro de referência em tons de cinza feito durante os preparativos, zerando assim os valores de pixel em todos os lugares, exceto na posição do mouse. Terceiro, binarize os quadros definindo todos os pixels acima de um limite de brilho para branco e tornando todos os outros pretos. Ajuste esta configuração para corresponder às condições de iluminação.

Agora remova a cauda das imagens usando a função Corroer / Dilatar. Primeiro corroa a imagem binarizada três vezes. Em seguida, dilate o quadro seis vezes.

Em seguida, corroa os quadros mais três vezes. Isso pode exigir ajuste se uma resolução de pixel diferente for usada. As ondas de mão são facilmente identificadas como grandes saltos no volume de pixels brancos.

Isso permite a detecção automática de inícios e ordens de sessão de sessão. Em cada sessão, detecte o maior componente de pixels brancos usando o comando L/Comp. Isso elimina os pixels que não pertencem ao mouse.

Em seguida, use a função Find Ends para determinar os dois pixels mais distantes dentro do maior componente de pixels brancos. Estes são o nariz e a cauda. O software determina o centro de gravidade ou COG para o objeto de pixel branco e calcula sua direção de movimento de quadro a quadro.

Para sessões com dois mouses, dois objetos devem ser rastreados. Selecione e oriente os dois maiores objetos de pixel branco usando o mesmo conjunto de comandos. O software verifica automaticamente os COGs de quadro a quadro.

Se um dos objetos mudar de tamanho em mais de 20% ou um COG se mover mais longe do que o possível para um mouse, o limite de binarização será aumentado automaticamente até que esses critérios sejam atendidos. O software verifica automaticamente os centros de gravidade de quadro a quadro. Se um dos objetos mudar de tamanho em mais de 20% ou um centro de gravidade se mover mais longe do que o possível para um mouse, o limite de binarização será ajustado automaticamente até que esses critérios sejam atendidos.

As interações são detectadas automaticamente quando os objetos estão dentro de dois centímetros. Esses segmentos são reproduzidos para entrada do usuário. Para cada segmento, rotule a perspectiva do mouse de teste como Evitação social, Abordagem social ou Nenhuma.

Para verificar a análise automática, carregue o filme usando o botão Carregar. Em seguida, clique em Iniciar Sessão 1 para exibir o primeiro quadro dessa sessão. Use o comando Reproduzir/Parar para controlar a reprodução.

Os filmes processados mostram cada rato com um círculo de cores diferente em suas cabeças e caudas. Além disso, as medidas de sociabilidade são exibidas na tela e atualizadas durante a reprodução. Corrija quaisquer erros encontrados na análise automatizada.

O erro mais comum é um flip cabeça-cauda que pode ser corrigido com uma ferramenta na interface. Isso ocorre em cerca de 20% dos vídeos. No caso raro de um erro mais complicado, eles geralmente podem ser resolvidos indicando manualmente a localização do nariz do mouse em uma determinada série de quadros de vídeo.

Uma vez verificados, exporte os dados de sociabilidade em formato de planilha usando a função Exportar. Para exportar dados de vários filmes como uma única planilha, os filmes devem ser agrupados em uma pasta e a função Compilar Dados faz a operação. Na primeira sessão, um camundongo de teste BALB/c de quatro semanas foi rastreado movendo-se entre os compartimentos 59 vezes ao longo de 10 minutos.

O tempo gasto em cada compartimento é considerado uma linha de base para a preferência do compartimento sem estímulo social. Na segunda sessão, um copo social e não social foi apresentado com um camundongo ICR de quatro semanas escondido. Havia uma clara tendência para passar o tempo no compartimento social.

Especificamente, o rato passou mais tempo com o copo social do que com o copo não social. Na terceira sessão, os copos foram levantados e os camundongos foram autorizados a interagir. No total, 35 abordagens sociais foram feitas em 10 minutos.

Após seu desenvolvimento, essa técnica facilita a triagem mais rápida de medicamentos promissores para melhorar o domínio central dos sintomas de sociabilidade prejudicada em modelos de camundongos validados de transtornos do espectro do autismo. O processamento automatizado pode ser adaptado a diferentes designs e espécies de gaiolas. Qualquer comportamento de interesse pode ser avaliado, desde que um algoritmo para detectá-lo de forma confiável possa ser desenvolvido.