Determinando Membrane Topology Protein Usando Fluorescência Protease Protection (FPP)

O objetivo geral deste procedimento é determinar a topologia das proteínas integrais da membrana. Isso é obtido pela expressão de efusão, proteína entre a proteína fluorescente verde ou GFP e as caudas amino ou carboxila da membrana. Proteína de interesse em células para fins de controle, proteínas fluorescentes solúveis, como RFP, podem ser expressas.

Em seguida, a membrana plasmática está sujeita à permeação seletiva. Usando a escavação em detergente, as proteínas fluorescentes solúveis sairão da célula, enquanto as proteínas fluorescentes ligadas à membrana serão retidas dentro da célula. A etapa final é a aplicação de uma protease nas células permanentes e a determinação da retenção ou perda do sinal fluorescente.

Em última análise, as mudanças na intensidade de fluorescência observadas usando imagens de microscopia de fluorescência são usadas para mostrar a topologia e a orientação das proteínas integrais da membrana. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o mapeamento de epítopos, é que o procedimento não requer muitos equipamentos especializados ou vários reagentes que podem ser difíceis de encontrar. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia da proteína de membrana, como quais domínios de uma proteína de membrana integral podem estar localizados dentro do citosol versus quais domínios podem estar localizados dentro do lúmen de organelas, como o retículo endoplasmático ouro G ou endossomos.

Comece este procedimento com a geração e validação da proteína fluorescente KY, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, transfecte a proteína fluorescente KY em células renais embrionárias humanas ou células HEK 2 93 usando qualquer método padrão de transfecção de alta eficiência e baixa toxicidade, incluindo tecnologias baseadas em lipídios, virais ou eletroporação para gerar expressão transitória ou estável, as células são então revestidas em lamínulas revestidas de polilisina. Mantenha as células por cinco a 48 horas em meios de cultura de tecidos apropriados a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos com capacidade de dióxido de carbono.

Monitore as células quanto à expressão da proteína de fusão GFP usando microscopia de epifluorescência, e o sinal fluorescente intrínseco do sinal fluorescente GFP geralmente atinge um máximo dentro de 24 a 72 horas. Após a transfecção. Use as células quando o sinal fluorescente atingir um nível máximo, a expressão da proteína também pode ser monitorada por análise de immunoblot usando anticorpos direcionados contra a proteína de interesse ou a porção GFP.

Para começar, configure o sistema de perfusão alimentado por gravidade para tratar as células. Prepare seringas de 50 mililitros para soluções com tubos de polietileno conectados a reservatórios independentes e a um coletor com uma única saída no banho. Posicione uma pipeta de sucção para manter um volume de banho constante e obter a troca da solução alternando manualmente entre os reservatórios de perfusão para permeação da membrana plasmática.

Primeiro, remova o meio de cultura celular das células. Lave as células três vezes por um minuto cada. No tampão KHM, coloque as lamínulas em um estágio de microscópio de fluorescência e colete a primeira imagem, que representa a imagem não permeável de controle para permanenteizar seletivamente a membrana plasmática.

Adicione o dígito toin no buffer KHM às células, perfunda as células com buffer mais toin de dígito a uma taxa de cinco mililitros por minuto por 10 a 60 segundos. A confirmação de que a membrana plasmática é adequadamente permanente é facilmente realizada pela expressão de uma molécula solúvel de GFP ou RFP, que se difundirá prontamente para fora da célula seguinte à membrana. A permeação então confirma que o quimer da proteína GFP de interesse é integrado à membrana, confirmando a retenção celular do sinal fluorescente após o digon e a permeação da membrana plasmática.

Em seguida, expresse uma proteína fluorescente específica organal, como uma proteína mitocondrial, conforme referenciado no protocolo de texto. Determine as condições de expressão ideais como antes. Confirme se a escavação e a concentração são apropriadas para o tipo de célula empregada, garantindo que a morfologia dos canais de órgãos intracelulares permaneça constante durante a exposição prolongada.

Para cavar toin. Depois de lavar as células no tampão KHM, adicione protease diretamente nas células. Examine as células a uma taxa de fluxo de cinco mililitros por minuto, usando um sistema de perfusão alimentado por gravidade para banhar continuamente a preparação.

Em seguida, determine se o sinal fluorescente persiste ou se degrada. Colete imagens de microscopia fluorescente sob os conjuntos de filtros apropriados usando a função de captura de imagem de vídeo em um microscópio fluorescente controlado por computador. Quantifique as intensidades do sinal fluorescente em função da condição de incubação.

Obtenha a intensidade média de pixels dentro de uma região de interesse que envolve uma célula individual. Uma perda superior a 90% da intensidade do sinal inicial em 30 a 60 segundos é consistente com a degradação proteolítica da proteína GFP ky. Um desaparecimento completo do sinal fluorescente solúvel deve ocorrer dentro de 10 a 60 segundos após a aplicação do toin de dígitos.

A confirmação de que a proteína de interesse está associada a organelas intracelulares é obtida observando a retenção do sinal fluorescente após digon e permeação. A cauda carboxila da quinase LTK dois ancorada na membrana foi fundida à GFP e expressa transitoriamente fluorescente ltk. Dois sinais de GFP foram perdidos rapidamente após a adição de proteinase K, indicando a localização do terminal carboxila de ltk dois está dentro do citosol.

Cavi e GFP é uma proteína da membrana plasmática com uma porção GFP ligada ao domínio citosólico. Tal como acontece com LTK dois, o sinal de cavi e GFP é insensível a dígitos, mas sensível à adição subsequente de protease DS red mito codifica proteína fluorescente vermelha fundida à sequência de direcionamento mitocondrial da citocromo C oxidase após permeação de digon, bem como adição de proteinase K. Isso é consistente com o fato de o Fluor quatro estar nas mitocôndrias, onde não é exposto ao citosol.

Quando a porção fluorescente ligada a uma proteína de membrana está voltada para o exterior da célula, como na proteína príon ancorada em GPI ligada à proteína fluorescente amarela. O tratamento com proteinase deve extinguir rapidamente o sinal fluorescente sem a necessidade prévia de permeação de diabretes como esperado. Após o tratamento com proteinase, o sinal fluorescente extracelular desapareceu rapidamente para as células que expressam essa construção.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em uma a duas horas, se feita corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma maior compreensão de como determinar a topologia de sua proteína de membrana de interesse.