Isolamento de RNA celular subpopulações específicas Utilizando captura de Laser Microdissection combinada com o rápido immunolabeling

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como realizar a imunomarcação rápida de uma população de células cerebrais de camundongo isolada por microdissecção a laser ou LCM, mantendo a integridade do RNA das amostras. Isso é conseguido primeiramente congelando rapidamente o tecido cerebral dissecado. Em seguida, o cérebro é cortado em seções finas sobre lâminas de microscopia de vidro livres de RNase e submetido a uma imunomarcação rápida.

Por fim, a população celular de interesse é isolada utilizando microdissecção a laser. Em última análise, a coloração rápida seguida pela microdissecção com captura a laser permite a identificação de alterações na expressão do gene de interesse na amostra celular experimental. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a triagem de células ativadas por fluorescência, é que com a nossa técnica, a resolução espacial é mantida, permitindo a separação específica da célula de ES a partir do tecido circundante.

Normalmente, pessoas novas nesta técnica de célula smith realizam círculos, porque este procedimento inclui várias etapas críticas que exigem trabalho rápido para manter a integridade do RNA nas amostras. Para preparar as amostras para o seccionamento, dissecar os cérebros de camundongos pós-natais do primeiro dia em meio L 15 gelado dentro de dois minutos após o sacrifício. Em seguida, colocar os cérebros em moldes para inclusão na orientação apropriada para o seccionamento e preencher os moldes com meio de inclusão para tecido congelado.

Em seguida, congele imediatamente as amostras em nitrogênio líquido e armazene-as a menos 80 graus Celsius dentro de 30 segundos após o congelamento rápido. Agora, trate as lâminas de vidro revestidas com membrana com descontaminação de RNA da superfície para remover quaisquer traços de RNA. Enxágue-as em água DEPC e deixe secar ao ar quando as lâminas estiverem secas.

Regule a temperatura da câmara do criostato para menos 20 graus Celsius e transfira a amostra congelada para o criostato. Para cada amostra, monte o bloco congelado na pinça do espécime e corte os espécimes com espessura de 10 mícrons, coletando as seções em lâminas revestidas com membrana. Após deixar as seções secarem por pelo menos 10 minutos, use uma caneta de barreira hidrofóbica para contornar os tecidos.

Após cerca de 10 segundos, coloque as lâminas em solução fixadora fria recém-preparada por não mais de cinco minutos a menos 20 graus Celsius. Agora transfira as lâminas para uma bandeja limpa previamente tratada com solução de descontaminação de RNA. Primeiro, agite as lâminas uma vez para remover qualquer excesso de fixador e lave-as com seis a oito mergulhos rápidos em D-E-P-C-P-B-S, sacudindo as lâminas.

Para remover o excesso de D-E-P-C-P-B-S, adicione 200 microlitros da solução de anticorpo primário a cada seção. Após 10 minutos à temperatura ambiente, lave as lâminas com três mergulhos rápidos em D-E-P-C-P-B-S e agite-as uma vez para remover o excesso de solução de lavagem. Em seguida, incube as amostras em 200 microlitros da solução de anticorpo secundário à temperatura ambiente após seis minutos.

Lave as lâminas em D-E-P-C-P-B-S conforme demonstrado anteriormente e incube-as em solução BC recém-preparada por quatro minutos, após outra lavagem rápida em D-E-P-C-P-B-S. Misture 196 microlitros de DAB recém-preparado com quatro microlitros de inibidor de RNA. Pouco antes de adicionar a solução à seção, deixe o DAB desenvolver por um a dois minutos, seguido por lavagem com A-D-E-P-C-P-B-S. Em seguida, desidrate as seções com uma incubação de alguns segundos em etanol absoluto e agite as lâminas para secar antes de prosseguir para LCM.

A seguir, adicione 50 microlitros de tampão de lise de um kit de extração de RNA na tampa do tubo de coleta. Em seguida, posicione uma lâmina sob o microscópio com o lado da amostra voltado para a tampa. Escolha a melhor ampliação para a amostra e ajuste o foco para visualizar as células de interesse.

Em seguida, defina a área de corte e inicie o corte com o laser. Colete o material dissecado na tampa do tubo de coleta e incube as células coletadas por 30 minutos a 42 graus Celsius. Durante esse período, pré-condicione uma coluna de purificação de RNA do kit de extração de RNA com 250 microlitros de tampão de condicionamento.

Em seguida, adicione 50 microlitros de etanol às células lisadas na coluna e centrifugue a coluna por dois minutos a 16.000 Gs e temperatura ambiente, seguido de duas lavagens com tampão de lavagem. Por fim, elua o RNA no volume mínimo recomendado de 11 microlitros de água livre de RNA, reservando dois microlitros para testar a qualidade do RNA. Este procedimento rápido de imunomarcação permite a visualização de células de interesse mantendo a integridade do RNA experimental.

Dependendo do experimento, a MCL pode ser usada conforme acabou de ser demonstrado para isolar células individuais ou regiões maiores de interesse. O RNA degradado tem um impacto considerável na qualidade da análise posterior. Cada amostra é, portanto, processada adicionalmente em uma plataforma bioanalisadora baseada em microfluido X para permitir a quantificação e verificação da integridade do RNA isolado, conforme acabou de ser demonstrado.

Por exemplo, aqui, resultados típicos do bioanalisador de amostras de RNA de qualidade degradada e boa são mostrados. De fato, o gel digital e os eletroferogramas demonstram a importância de usar um inibidor de RNase em cada solução para proteger o RNA; após este procedimento, o RNA de alta qualidade pode ser posteriormente processado para aplicações downstream, incluindo sequenciamento de RNA, microarray ou Q-R-T-P-C-R. Por exemplo, nestes gráficos, determinou-se que o enriquecimento médio da expressão gênica de TH e AADC na amostra microdissecada em relação às secções do mesencéfalo foi superior a 170 vezes.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar rapidamente e com materiais livres de RNAses. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar uma população específica de células de qualquer tecido.