Isolamento de RNA celular subpopulações específicas Utilizando captura de Laser Microdissection combinada com o rápido immunolabeling

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como realizar a imunomarcação rápida de uma população de células cerebrais de camundongos isolada por microdissecção de captura a laser ou LCM, mantendo a integridade do RNA das amostras. Isso é feito primeiro congelando rapidamente o tecido cerebral dissecado. O cérebro é então cortado em seções finas em lâminas de microscópio de vidro livre de RNA e tratado com uma rápida coloração imunológica.

Finalmente, a população de células de interesse é isolada usando LCM. Em última análise, a coloração rápida seguida de microdissecção por captura a laser permite a identificação de alterações na expressão do gene de interesse na amostra de células experimentais. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a classificação de células ativadas por fluorescência, é que, com a nossa técnica, a resolução espacial é mantida, permitindo a solução da célula específica de ES do tecido circundante.

Geralmente, as pessoas novas nesta célula smith circulam porque esse procedimento inclui várias etapas críticas que exigem um trabalho rápido para manter a integridade do RNA nas amostras. Para preparar as amostras para secção, disseque os cérebros dos camundongos pós-natais do primeiro dia em meio L 15 gelado dentro de dois minutos após o sacrifício. Em seguida, coloque os cérebros em moldes de incorporação na orientação apropriada para seccionamento e preencha os moldes com tecido congelado, incorporando o meio.

Em seguida, congele imediatamente as amostras em nitrogênio líquido e armazene-as a menos 80 graus Celsius dentro de 30 segundos após o congelamento. Agora, trate as lâminas de vidro revestidas com membrana com descontaminação de RNA de superfície para remover quaisquer vestígios de RNA. Enxágue-os em água DEPC e deixe-os secar ao ar quando as lâminas estiverem secas.

Defina a temperatura da câmara do criostato para menos 20 graus Celsius e transfira a amostra congelada para o criostato. Para cada amostra, monte o bloco congelado na pinça de amostra e corte as amostras com uma espessura de 10 mícrons, coletando as seções nas lâminas revestidas com membrana. Depois de deixar as seções secarem por pelo menos 10 minutos, use uma caneta de barreira hidrofóbica para envolver os tecidos.

Após cerca de 10 segundos, coloque as lâminas em uma solução fixadora a frio recém-preparada por não mais de cinco minutos a menos 20 graus Celsius. Agora transfira as lâminas para uma bandeja limpa pré-tratada com solução de descontaminação de RNA de superfície. Primeiro, agite as lâminas uma vez para remover qualquer excesso de fixador e lave-as com seis a oito mergulhos rápidos Em D-E-P-C-P-B-S agite as lâminas.

Para remover o excesso de D-E-P-C-P-B-S, adicione 200 microlitros da solução de anticorpo primário a cada seção. Após 10 minutos em temperatura ambiente, lave as lâminas com três mergulhos rápidos em D-E-P-C-P-B-S e sacuda-as uma vez para remover o excesso de solução de lavagem. Em seguida, incubar as amostras em 200 microlitros da solução de anticorpos secundários à temperatura ambiente após seis minutos.

Lave as lâminas em D-E-P-C-P-B-S como acabamos de demonstrar e incube-as em uma solução BC recém-preparada por quatro minutos após outra lavagem rápida de D-E-P-C-P-B-S misture 196 microlitros de DAB recém-preparado com quatro microlitros de inibidor de RNA. Pouco antes de adicionar a solução à seção, deixe o DAB desenvolver por um a dois minutos, seguido de lavagem com ADEP, PCB. Em seguida, desidrate as seções com alguns segundos de incubação em etanol absoluto e seque as lâminas para prosseguir para o LCM.

Em seguida, 50 microlitros de tampão de lise de um kit de extração de RNA na tampa do tubo coletor. Em seguida, coloque uma lâmina sob o microscópio com o lado da amostra voltado para a tampa. Escolha a melhor ampliação para a amostra e ajuste o foco para ver as células de interesse.

Em seguida, defina a área de corte e comece a cortar com o laser. A coleta do material dissecado no tubo coletor cobre as células coletadas por 30 minutos a 42 graus Celsius. Durante esse tempo, pré-condicione uma coluna de purificação de RNA do kit de extração de RNA com 250 microlitros de tampão de condicionamento.

Em seguida, carregue 50 microlitros de etanol nas células lisadas na coluna e centrifugue a coluna por dois minutos a 16.000 Gs e temperatura ambiente, seguida de dois enxágues com tampão de lavagem. Finalmente, eluir o RNA no volume mínimo recomendado de 11 microlitros de água livre de RNA mantendo dois microlitros de lado para testar a qualidade do RNA. Este procedimento rápido de imunomarcação permite a visualização das células de interesse, mantendo a integridade do RNA experimental.

Dependendo do experimento, o LCM pode ser usado como demonstrado para isolar células individuais ou regiões maiores de interesse. O RNA degradado tem um impacto considerável na qualidade da análise a jusante. Cada amostra é, portanto, processada em um bioanalisador de plataforma baseado em microfluido X para permitir a quantificação e verificação da integridade do RNA isolado, conforme demonstrado.

Por exemplo, aqui, os resultados típicos do bioanalisador são degradados e de boa qualidade. Amostras de RNA são mostradas. De fato, gel digital e eletroferogramas demonstram a importância do uso de um inibidor de rase em cada solução para proteger o RNA seguindo este procedimento, o RNA de alta qualidade pode ser processado posteriormente para aplicações a jusante, incluindo sequenciamento de RNA MICROARRAY ou Q-R-D-P-C-R, por exemplo, nesses gráficos, o enriquecimento médio para a expressão gênica de TH e AA DC na amostra microdissecada em relação às seções do mesencéfalo foi determinado em mais de 170 vezes.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar o trabalho muito rapidamente e com material livre de RNAs. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar uma população específica de células de qualquer tecido.