Name: Imagem Contraste em embriões de camundongos Usando de alta freqüência ultra-som (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Aprenda a injetar microbolhas em embriões de camundongos vivos para imagem de ultrassom de alta frequência com contraste. Este método permite estudar marcadores vasculares e parâmetros de perfusão em desenvolvimento.

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Este trabalho foi apoiado pelo Programa Terry Fox do Instituto Nacional do Câncer do Canadá.

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F.S. Foster reconhece seu papel como consultor da VisualSonics Inc.

Agentes de contraste de ultra-som foram injetadas em embriões em estágio final de gestação do mouse e imagens de contraste não-lineares foram adquiridos para medir parâmetros de perfusão e direcionados microbolhas vinculativo. Imagiologia bem sucedida de microbolhas no seio da vasculatura embrionária era dependente de uma série de factores, a primeira sendo a viabilidade do embrião. Todos os equipamentos e aparelhos foram preparados com antecedência, a fim de minimizar o tempo necessário para o isolamento de embriões a ...

Ultra-sonografia com contraste faz uso de agentes de contraste de microbolhas para visualizar e caracterizar o ambiente vascular. Estes agentes permitir a avaliação não invasiva da microcirculação, vascularização e função cardiovascular. Além disso, a modificação da superfície da bolha pode resultar em microbolhas de ligação orientada para biomarcadores endoteliais, como demonstrado em aplicações pré-clínicos de angiogénese, a aterosclerose e a inflamação 1,2 fazendo imagiologia de ultra-sons molecular de eventos vasculares possíveis. Com aumento de contraste de ultra-sons pode, portanto, ser usadas para identificar os ambientes complexos e diversos que influenciam estados vasculares saudáveis ​​e doentes 3-5. No número últimos anos, o interesse pelo utilitário de imagem de microbolhas se estendeu para o modelo do rato embrião versátil. Como um modelo de desenvolvimento de mamíferos, introdução de microbolhas para a vasculatura embrionária aumenta fisiológicoestudo do sistema circulatório em desenvolvimento (por exemplo, o fluxo de sangue, o débito cardíaco) e nos casos de transgénicos e modelos de ratos mutantes alvo de doença cardíaca 6,7, pode produzir insights sobre como os fatores genéticos que alteram a função cardiovascular. De fato, análises 2D quantitativa e qualitativa da vasculatura cerebral embrionária já foram atingidos 8. Além disso, o embrião de rato apresenta-se como um excelente modelo para examinar a ligação de microbolhas orientadas para marcadores vasculares in vivo. Bartelle et al. 9, por exemplo, introduziram microbolhas avidina em embrião ventrículos cardíacas para avaliação alvejado obrigatório em embriões transgênicos BIOTAG-Bira e examinar a anatomia vascular. A geração de modelos de heterozigotos e homozigotos do mouse pode ser também ser utilizado como um substituto para estudos de modelos tumor com o objetivo de definir a natureza quantitativa de ultra-som molecular - uma referência importante na tradução dessa técnica para a clínica. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Microbubbles são mais frequentemente introduzidas para a circulação embrionária através de injeções intra-cardíaco em embriões únicos expostos através de uma laparotomia 8-10. Em injeções útero, no entanto, enfrentam uma série de desafios. Estes incluem orientação injeção, a necessidade de combater o movimento na mãe e embrião exteriorizada, a manutenção da viabilidade hemodinâmico na mãe e embriões exteriorizados, abordando os efeitos a longo prazo da anestesia e complicações devido ao sangramento 11. Portanto, o objetivo da investigação foi desenvolver uma técnica para a injeção de microbolhas em isolado de vida em estágio final de embriões 12. Esta opção oferece mais liberdade em termos de controle de injeção e posicionamento, reprodutibilidade do plano de imagem, sem obstrução, e análise de imagem simplificada e quantificação. No presente estudo, descrevemos um novo procedimento para a injeção de microbolhas em que vivem embriões murinos for o objectivo de estudar o comportamento cinético de microbolhas e de estudar a ligação a marcadores de superfície endoteliais endógenas microbolhas alvejado. Ultra-sonografia específico contraste não-linear é usado para medir de uma série de parâmetros de perfusão básicas, incluindo intensificação de pico (PE), lave-in taxa e tempo de pico (TTP) em embriões E17.5 isoladas. Nós também demonstrar a validade do modelo de embrião para avaliar a natureza quantitativa de ultra-som molecular em uma perda endoglin embrionário de rato modelo função transgênica, onde endoglin é um alvo clinicamente relevante devido à sua elevada expressão em células endoteliais vasculares em locais de angiogênese ativo 13 . A adesão de (MB E), segmentada por endoglin isótipo rato IgG 2 controle (MB C) e não segmentados (MB U) microbolhas é avaliada em endoglin heterozigotos (Eng +/-) e endoglin homozigoto (Eng + / +) expressando embriões. Análise do bindi alvejadong revela que o ultrassom molecular é capaz de diferenciar entre os genótipos endoglina e relacionando densidade do receptor de ultra-som para níveis moleculares quantificáveis.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td colspan="4">Anticorpos (biotinilado, eBioscience) &#8212; A escolha do anticorpo depende do experimento</td></tr><tr><td><ul style="padding:0px; margem:0px"><li>rat isotipo IgG2 controle</li></ul></td><td>eBioscience</td><td>13-4321-85</td><td>Esta combinação de anticorpo/microbolhas é frequentemente necessária como controle experimental&nbsp;</td></tr><tr><td><ul style="preenchimento:0px; margem: 0px "><li>biotina anti-camundongo CD309< / li>< / ul></td><td>eBioscience</td><td>13-5821-85</td><td></td></tr><tr><td>Rato biotinilado MJ 7/18 anticorpo para endoglina</td><td>de camundongo Em hibridoma</td><td></td> interno <td>Anticorpos externos também podem ser apropriados: nós&nbsp; usamos eBioscience (13-1051-85) no passado</td></tr><tr><td>Água</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr> destilada<td colspan="4">Meio embrionário</td></tr><tr><td><ul style="preenchimento:0px; margem:0px"><li>500 ml Dulbecco' s Águia Modificada' s Meio com glicose alta</li></ul></td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td><ul style="padding:0px; margin:0px"><li>50 ml Soro Fetal Bovino</li></ul></td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td>lote # 7592456</td></tr><tr><td><ul style="padding:0px; margem: 0px "><li>Hepes< / li>< / ul></td><td>Gibco</td><td>15630</td><td>5 ml, 1 M</td></tr><tr><td><ul style = "preenchimento: 0px; margem: 0px "><li>Penicilina-estreptomicina< / li>< / ul></td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 ml, 10.000 unidades Pen., 10.000 &# 956; g Etanol estreptocócico</td></tr><tr><td>, 70%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>76240</td><td>4%</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato [1x]&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>1x, sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio</td></tr><tr><td>Camundongo prenhe, CD-1</td><td>Charles River Laboratories Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio a 0,9% (solução salina)</td><td>Hospira</td><td>0409-7984-11</td><td></td></tr><tr><td>Agente de contraste de ultrassom, micromarcador pronto e não direcionado;</td><td> VisualSonics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel de ultrassom (Aquasonic 100, incolor)</td><td>CSP Medical</td><td>133-1009</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Placas de cultura de células (4) :&nbsp; 100&nbsp; x&nbsp; 20&nbsp; mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-22</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Cultura de Células (12) : 60&nbsp; x&nbsp; 15&nbsp; mm</td><td>Sigma</td><td>D8054</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sorvall Legend RT&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos, 50 ml BD Falcon</td><td>VWR</td><td>21008-938</td><td></td></tr><tr><td>Diluente</td><td>Beckman Coulter</td><td>Isoton II Diluente, 8448011</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecção (Wagner)</td><td>Ferramentas de ciências plásticas</td><td>Wagner 14068-12</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps (2), Dumont SS (0,10 x 0,06 mm)</td><td>Ferramentas de ciências fiais</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps, lasca</td><td>VWR</td><td>25601-134</td><td></td></tr><tr><td>Copo de vidro, 2 L (Copo de Grifo)</td><td>VWR</td><td>89000-216</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro, 1 x 90&nbsp; mm GD-1 com filamento</td><td>Narishige</td><td>GD-1</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de agulha de vidro</td><td>Narishige</td><td>PN-30</td><td></td></tr><tr><td>Luvas</td><td>Ansell</td><td>4002</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de anatomia bruta</td><td>Ferramentas de Fine Science</td><td>10088-15</td><td></td></tr><tr><td>Placa quente</td><td>VWR</td><td>89090-994</td><td></td></tr><tr><td>Balde de gelo</td><td>Cole Parmer</td><td>RK 06274-01</td><td></td></tr><tr><td>Imagem Plataforma</td><td>VisualSonics Inc.</td>Sistema <td></td><td>de Trilho Integrado</td></tr><tr><td>Fonte de luz, fibra óptica</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-562-36</td><td>Idealmente tem braços ajustáveis</td></tr><tr><td>Luers (12), polipropileno fêmea farpado &frac14;-28 Rosca UNF</td><td>Cole Parmer</td><td>45500-30</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de micro-ultrassom, alta frequência</td><td>VisualSonics Inc.</td><td>Agulhas Vevo2100</td><td></td></tr><tr><td>, calibre 21 (1")</td><td>VWR</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>Analisador de tamanho de partículas</td><td>Beckman Coulter Multisizer</td><td>3 relha Contador</td><td></td></tr><tr><td>Colher perfurada (Moria)</td><td>Fine Science Tools</td><td>MC 17 10373-17</td><td></td></tr><tr><td>Pinos (6), minúcia anodizada preta 0,15 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>Pipetadores [2-20 &#956; l, 20-200 &#956; l, 100-1.000 &#956; l]</td><td>Eppendorf</td><td>Research Plus&nbsp; 3120000038 ajustável; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 3120000054; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td>3120000062</tr><tr><td>Pontas de pipetador [2-200&nbsp; &#956; l, 50-1.000&nbsp; &#956; l]</td><td>Eppendorf</td><td>epT.I.P.S.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 22491334; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td>022491351</tr><tr><td>Tesoura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de Elastômero de Silicone</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubing, Laboratório Tygon 1/32" x 3/32"</td><td>VWR</td><td>63010-007</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de madeira em bastão (cotonete, cabeça de algodão)</td><td>VWR</td><td>CA89031-270</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio cirúrgico Ampliação de 5-8X</td> Seringas <td>Fisher Scientific</td><td>Steromaster</td><td></td></tr><tr><td>, 1 ml Normject</td><td>Fisher</td><td>14-817-25</td><td></td></tr><tr><td>Seringas (10), 30 ml</td><td>VWR</td><td>CA64000-041</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de infusão de seringas&nbsp;</td><td>Bio-lince&nbsp;</td><td>Termômetro NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>, -20-110&nbsp; &#176; C</td><td>VWR</td><td>89095-598</td><td></td></tr><tr><td>Temporizador</td><td>VWR</td><td>33501-418</td><td></td></tr><tr><td>Tubos, Eppendorf</td><td>VWR</td><td>20170-577</td><td></td></tr><tr><td>Suportes para tubos (3)</td><td>VWR</td><td>82024-462</td><td></td></tr><tr><td>Transdutor de ultrassom, 20 MHz</td><td>VisualSonics Inc.</td><td>MS250</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-Tübingen, inclinado para cima</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>15005-08</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem contraste em embriões de camundongos usando de alta freqüência ultra-som

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

A imagem com contraste de ultrassom pode transmitir informações quantitativas essenciais sobre a vascularização e perfusão tecidual e, em aplicações direcionadas, facilitar a detecção e medição de biomarcadores vasculares em nível molecular. Dentro do embrião de camundongo, essa técnica não invasiva pode ser usada para descobrir mecanismos básicos subjacentes ao desenvolvimento vascular no sistema circulatório inicial do camundongo e em modelos genéticos de doenças cardiovasculares. O embrião de camundongo também se apresenta como um excelente modelo para estudar a adesão de microbolhas a alvos angiogênicos (incluindo o receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2) ou αvβ3) e para avaliar a natureza quantitativa do ultrassom molecular. Portanto, desenvolvemos um método para introduzir agentes de contraste de ultrassom na vasculatura de embriões vivos e isolados. Isso permite liberdade em termos de controle e posicionamento da injeção, reprodutibilidade do plano de imagem sem obstrução e movimento e análise e quantificação simplificadas da imagem. Embriões murinos em estágio gestacional tardio (dia embrionário (E)16.6 e E17.5) foram isolados do útero, suavemente exteriorizados do saco vitelino e agentes de contraste de microbolhas foram injetados em veias acessíveis na superfície coriônica do disco placentário. A imagem de ultrassom de contraste não linear foi então empregada para coletar uma série de parâmetros básicos de perfusão (aumento de pico, taxa de lavagem e tempo para o pico) e quantificar a ligação de microbolhas direcionada em um modelo de camundongo endoglin. Mostramos a circulação bem-sucedida de microbolhas dentro de embriões vivos e a utilidade dessa abordagem na caracterização da vasculatura embrionária e do comportamento das microbolhas.

A injecção de agentes de contraste de ultra-som em embriões de ratinho ex útero é dependente do isolamento de embriões vivos, nas fases finais-gestacionais do útero e manutenção da viabilidade ao longo do curso da injecção e imagiologia de ultra-sons correspondente. Uma vez que o embrião foi exteriorizado e posicionado, como mostrado na Figura 1, a injecção do agente de contraste cuidado na vasculatura embrionária é possível. Uma imagem de ultra-som típico de modo B de um embrião de rato E17.5 ...

Aqui, apresentamos um protocolo para injetar agentes de contraste de microbolhas de ultra-som de estar, isoladas de fim de gestação de embriões palco murino. Este método permite o estudo de parâmetros de perfusão e de marcadores moleculares vasculares dentro do embrião usando de alta freqüência ultra-sonografia com contraste.

Imagem Contraste em embriões de camundongos Usando de alta freqüência ultra-som

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

O objetivo geral deste procedimento é injetar microbolhas em embriões de camundongo vivos isolados, para a obtenção de imagens por ultrassonografia com contraste. Isso é realizado primeiramente colhendo embriões vivos E 16,5 ou E 17,5 de um camundongo grávido.Após o preparo das microbolhas direcionadas, as microbolhas são injetadas no embrião vivo por meio da rede vascular placentária. O passo final consiste em obter imagens das microbolhas utilizando imagem por ultrassom. Em última análise, a imagem por ultrassom com contraste pode ser utilizada para medir parâmetros de perfusão vascular e avaliar a ligação de microbolhas direcionadas em embriões.De modo geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades com o manuseio de embriões e as etapas de injeção do protocolo até adquirirem prática suficiente na aplicação das pressões necessárias com a agulha e a pinça para um experimento bem-sucedido. A demonstração do procedimento será realizada por Brian Nixon, um estudante de estágio cooperativo do nosso laboratório. Para reconstituir os frascos com o alvo pronto, comece diluindo 20 microgramas da solução de anticorpo em um volume final de um mililitro de solução salina. Mantenha o

contrast-imaging-in-mouse-embryos-using-high-frequency-ultrasound

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Cirurgia no útero de sobrevivência em camundongos permite a manipulação molecular de expressão de genes durante o desenvolvimento. Aqui nós descrevemos o uso de alta freqüência ultra-sonografia para guiar a injeção de vetores retrovirais para o cérebro do rato no dia embrionário (E) 9.5.

Ultra-som guiada microinjeção em parte frontal do cérebro do rato In Utero Em E9.5

Morte fetal e perinatal é uma característica comum quando se estuda alterações genéticas que afetam o desenvolvimento cardíaco. De alta freqüência ultra-sonografia tem melhorado 2-D resolução e pode fornecer excelentes informações sobre o desenvolvimento cardíaco precoce e é um método ideal para detectar o impacto sobre a estrutura e função cardíaca antes da morte.

Ecocardiografia Fetal murino

Este vídeo demonstra um procedimento para injetar agentes de contraste de microbolhas em um embrião de camundongo isolado em estágio de gestação tardia. A imagem de ultrassom baseada em agente de contraste de microbolhas ajuda a visualizar e caracterizar o ambiente vascular do embrião.

Injeção de Microbolhas em Embriões de Camundongos Isolados: Uma Técnica para Entregar Agentes de Contraste de Microbolhas na Vasculatura de Embriões Murinos Vivos

Neste vídeo, demonstramos a ultrassonografia de alta frequência para obter imagens de locais de implantação embrionária em um modelo murino prenhe. Esta técnica de imagem detecta com sucesso a gravidez viável e caracteriza os locais de implantação do embrião durante o início da gravidez murina.

Caracterização precoce da gravidez baseada em ultrassonografia de alta frequência: uma técnica para estudar a implantação embrionária e a progressão da gravidez em modelo murino prenhes

Ultra-alta freqüência ultra-som é uma ferramenta de imagem ao vivo poderoso para examinar anormalidades cardíacas em pequenos animais. Sua noninvasiveness permite manter o estado fisiológico de embriões. Aqui, vamos mostrar o uso do M-modo ultra-som para medir os batimentos cardíacos de embriões em E18.5 no útero.

Na medição utero da frequência cardíaca em rato por não invasiva em modo M Ecocardiografia

Os ratos são amplamente utilizados para estudar Biologia gestacional. No entanto, a terminação de gravidez é necessária para tais estudos, que se opõe a investigações longitudinais e exige o uso de um grande número de animais. Portanto, descrevemos uma técnica não-invasiva da ultra-sonografia de alta frequência para a deteção adiantada e monitoramento de eventos após a implantação no mouse grávido.

Um novo uso da ultra-sonografia tridimensional de alta frequência para caracterização de gravidez precoce no Mouse

Imagem de ultra-som de alta frequência do mouse fetal melhorou a resolução de imagem e pode fornecer precisa caracterização não-invasivo do desenvolvimento cardíaco e defeitos estruturais. O protocolo descrito neste documento é projetado para executar em tempo real de ratos fetal ecocardiografia na vivo.

Imagem cardiovascular fetal de camundongo usando um sistema de ultrassom de alta frequência (30/45MHZ)

Aqui descrevemos a técnica de ultra-som de alta frequência para análise na vivo de fetos em camundongos. Esse método permite o acompanhamento de fetos e a análise dos parâmetros da placenta, bem como o fluxo de sangue materno e fetal durante a gravidez.

Ultra-som de alta frequência para a análise do desenvolvimento Fetal e placentário na Vivo

O ultrassom de alta resolução pode ajudar a agilizar experimentos que requerem camundongos com tempo cronometrado, determinando o estado da gravidez, idade gestacional e perdas de gravidez. Apresentado aqui é um protocolo para ilustrar métodos para avaliar a gravidez do rato, bem como potenciais armadilhas (artefatos de imagem) que podem imitar a gravidez.

Meu rato está grávida? Avaliação de ultrassom de alta frequência

Este protocolo descreve três métodos sobre como obter e usar embriões de frango de 5 a 8 dias de idade e sua membrana corioalantóica (CAM) como um modelo in vivo para estudar imagens de ultrassom com contraste e entrega de drogas mediadas por microbolhas.

A preparação de embriões de frango ex ovo e vasos de membrana corioalantóica como modelo in vivo para imagens de ultrassom com contraste e estudos de liberação de drogas mediados por microbolhas

Apresentamos um protocolo detalhado para cultura e imagem de embriões de camundongos que permite imagens 3D + tempo de células progenitoras cardíacas. Este kit de ferramentas de vídeo aborda as principais habilidades necessárias para o sucesso da geração de imagens ao vivo, de outra forma difíceis de adquirir de publicações somente de texto.

Imagem ao vivo de progenitores cardíacos precoces no embrião de camundongo

Aprenda a injetar microbolhas em embriões de camundongos vivos para imagem de ultrassom de alta frequência com contraste. Este método permite estudar marcadores vasculares e parâmetros de perfusão em desenvolvimento.

Imagem Contraste em embriões de camundongos Usando de alta freqüência ultra-som

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