Name: A quitosana / RNA de interferência Nanoparticle Mediated silenciamento gênico na Doença Vector Mosquito Larvas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Aprenda a silenciar genes em larvas de mosquitos vetores usando nanopartículas de quitosana/RNA de interferência. Este método permite estudar funções gênicas em entomologia e biologia molecular.

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O financiamento da Estação Experimental Agrícola do Kansas e do Centro de Genômica de Artrópodes do Estado K para KYZ apoiou o desenvolvimento original do silenciamento de genes mediado por quitosana / dsRNA em A. gambiae19. O trabalho de A. gambiae descrito aqui foi apoiado em parte pelo R01-AI095842 do NIH / NIAID para KM. O desenvolvimento do silenciamento de genes mediado por quitosana / siRNA em A. aegypti20,21 foi apoiado pelo Prêmio NIH / NIAID R01-AI081795 para MDS. O conteúdo deste estudo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do NIH.

1. Mosquito Espécies e Empinar <ol><li> Manter A. gambiae G3 e A. estirpes aegypti Liverpool IB12 (utilizadas nos estudos representativos abaixo) ou outras estirpes de interesse de acordo com a prática padrão do laboratório ou como descrito anteriormente 23,24. </li></ol> 2. dsRNA e siRNA Design e Produção <ol><li> Iniciadores de design para a construção de modelos de ARNcd longos específicos para o gene de interesse. Use a ferramenta E-RNAi 25. Produzir ARNcd de acordo com o método de escolha ou como previamente descrito 19. <ol><li> Para um controlo negativo, sintetizar dsRNA 19 que corresponde à sequência de proteína fluorescente verde (GFP), β-galactosidase (β-gal), ou algum outro gene não expresso em mosquitos. Se assim for desejado, o dsRNA 19 utilizados para gerar os resultados representativos resumidos abaixo pode ser utilizada como um controlo positivo. Loja dsRNA dissolvido em água livre de RNAse a -80 °; C até ser necessário. </li></ol></li><li> Alternativamente, siRNA específico do gene de criação de acordo com a prática padrão do laboratório ou como previamente descrito 10. Codificar a sequência de um siRNA knockdown para conceber siRNA controlo negativo que não corresponde a qualquer gene de mosquito. Compre os siRNAs personalizados, que estão disponíveis através de um número de fornecedores de confiança. <ol><li> Se assim for desejado, os siRNAs 20,21 utilizado para obter os resultados representativos resumidos abaixo podem ser utilizados como controlos positivos. Loja siRNA dissolvido em água isenta de RNase à temperatura de -80 ° C até ser necessário. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de quitosano / ARN interferente Nanopartículas <ol><li> Reunir RT sulfato de sódio pré-fabricados 100 mM (100 mM de Na 2 SO 4 em H2O desionizada) e acetato de sódio 0,1 M (0,1 M de NaC 2 H 3 O 2 -0,1 M de ácido acético, pH 4,5 em água desionizada H2O) tampões. </li><li> Dissolver quitosana (≥75%desacetilada) em tampão de acetato de sódio 0,1 M para tornar a 0,02% (w / v) de solução de trabalho e manter a solução à temperatura ambiente antes da sua utilização. </li><li> Dissolve-se ou siRNA dsRNA em 50 ul de H2O desionizada e adicioná-lo ao tampão de sulfato de sódio 100 mM a fazer uma solução de 100 ul de 32 mg de dsRNA / siRNA por 100 ul de sulfato de sódio 50 mM. </li><li> Adicionar 100 ul de solução de quitosano à solução de dsRNA / siRNA e, em seguida, aquecer a mistura num banho de água a 55 ° C durante 1 min. Defina-se um controlo por adição de 100 ul de sulfato de sódio 50 mM a 100 ul de solução de quitosano e seguem o mesmo procedimento. </li><li> Misturar as soluções imediatamente durante 30 seg por vórtice de alta velocidade à TA para facilitar a formação de nanopartículas. </li><li> Centrifuga-se a mistura a 13.000 xg durante 10 min à temperatura ambiente, tempo após o qual uma pastilha deve ser visível. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml. Secar o pellet para ≈10 min à temperatura ambiente antes de usá-lo para preparar a comida mosquito. </li><li> Medir a concentração de ARNcd / siARN no sobrenadante, utilizando o sobrenadante de controlo (ver 3.5), um espaço em branco para calcular a quantidade total de dsRNA / siRNA que permaneceu no sobrenadante. Use a diferença entre os valores de partida de dsRNA / siRNA e valores remanescentes nos sobrenadantes para calcular a porcentagem de dsRNA / siRNA aprisionado nas nanopartículas. Esta eficiência de carga é normalmente superior a 90%. </li><li> Repita o mesmo procedimento se são necessários mais nanopartículas. Use as nanopartículas secas imediatamente. O impacto do armazenamento a frio de partículas antes do uso não foi avaliado. </li></ol> 4. Preparando Mosquito Alimentos que contém quitosana / interferência RNA Nanopartículas <ol><li> Preparar 1 mL de uma solução de agarose a 2% (w / v) em água desionizada, derreter a agarose, e manter a solução de agarose fundida em um banho de água 55 C antes da utilização. </li><li> Misture os flocos de comida de peixe (proteína bruta de 47%, min. Gordura bruta de 10%, no máximo. Fibra bruta 3%) e levedura seca em umproporção de 2: 1 (w / w). Moer a mistura de pequenas partículas com um almofariz e pilão (passável através No. 50 EUA peneiro standard). Use a comida solo, que deve ser de cor acastanhada, imediatamente ou armazená-lo em um recipiente fechado a 4 ° C durante várias semanas. </li><li> Em um tubo de 1,5 mL, 6 mg de misturar alimentos chão com as nanopartículas secas a partir da Secção 3.7 com um palito. </li><li> Adicionar 30 ul de solução de gel de agarose a 2% pré-fundido para a mistura de alimentos-nanopartícula; agitar imediata e cuidadosamente usando um palito ou pipeta de ponta. </li><li> Use o gel contendo alimentos e nanopartículas para alimentar as larvas do mosquito imediatamente. Alternativamente, uma vez que o gel é solidificado completamente à TA, armazenar o gel a 4 ° C e usar no dia seguinte, ou a -80 ° C para uso posterior. </li></ol> 5. Alimentação larvas do mosquito com alimentos que contenham Quitosana / interferência RNA Nanopartículas <ol><li> Alimentação A. gambiae larvas de mosquito: <ol><li> Retirar a sipellet gel ngle do tubo de 1,5 ml usando um palito e corte-o em 6 fatias iguais, usando uma lâmina de barbear limpa ou palito de dentes. </li><li> Transferência de 20 larvas de terceiro instar de um prato Petri de 500 ml contendo 100 ml de água desionizada. </li><li> Alimentar as larvas do mosquito, adicionando uma fatia do pellet gel (finamente picado em pedaços menores) por placa de Petri, uma vez por dia durante quatro dias. Certifique-se de observar a alimentação das larvas no sedimento, que deve ser significativamente reduzida ou completamente ausente no dia seguinte. Depois de um tempo, os mosquitos irá desenvolver em larvas de quarto instar tarde. </li><li> Registre quaisquer alterações fenotípicas visíveis durante o experimento. Examinar os níveis de transcrição e outras alterações fenotípicas como discutido na secção 6, no final do período de quatro dias. </li></ol></li><li> Alimentação A. aegypti larvas de mosquito: <ol><li> Corte o pellet gel em 6 fatias iguais usando uma lâmina de barbear limpa ou palito. </li><li> Coloque 50 sincronizado-idade de 24 horas após a eclosão do ovo filarvas primeiro numa placa de petri em ≈40 mL de água desionizada. </li><li> As larvas alimentam uma fatia por placa de Petri, durante 4 h / dia, em seguida, transferir as larvas de volta para a dieta larval regular de 2: 1 Terra peixes flocos de alimentos e de fermento seco para o resto do dia. Repita o procedimento diariamente ao longo dos quatro estágios larvais. </li><li> Examinar os níveis de transcrição e outras alterações fenotípicas como discutido na seção 6 aos desejados pontos de tempo de desenvolvimento. </li></ol></li></ol> 6. Confirmação de Gene Knockdown <ol><li> Relativa quantificação transcrição por qRT-PCR em A. aegypti e A. larvas gambiae. <ol><li> Executar e analisar os ensaios de qRT-PCR com três repetições biológicos em, pelo menos, 10 vs. controlo pool larvas experimental tal como descrito 11,19,20, ou de acordo com procedimento padrão do laboratório. Os resultados representativos estão incluídas a seguir. </li><li> Para a análise de uma determinada parte do tipo de tecido / body (ie., Cérebro ou antena), perform qRT-PCR como descrito em 6.1.1 seguinte dissecção para recuperar o tecido de interesse (por exemplo, ver Mysore et ai. 21). </li></ol></li><li> Confirmação de knockdown por hibridação in situ <ol><li> Sintetizar antisense marcado com digoxigenina e sentir riboprobes de controle de acordo com a prática do laboratório padrão ou como descrito 26. </li><li> Executar a hibridação in situ por o protocolo Haugen et al. 27, para confirmação de knockdown como descrito anteriormente e 11,20 discutido na secção de resultados representativos abaixo. </li></ol></li><li> Confirmação de knockdown por imuno-histoquímica <ol><li> Se os anticorpos contra o produto de proteína do gene alvo estão disponíveis, realizar imunohistoquímica tal como anteriormente descrito 28, o que facilita a identificação de indivíduos com os níveis mais elevados de knockdown para análise de fenótipo 20, como exemplificado no representative seção de resultados abaixo. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Malaria. , World Health Organization. 
 
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O quitosano / interferindo metodologia de nanopartículas ARN aqui descrita tem sido usada para identificar eficazmente genes durante o desenvolvimento das larvas em A. gambiae (Figuras 2, 3) e A. aegypti (Figuras 4, 5, 6, Tabelas 1, 2). Nanopartículas de quitosano podem ser preparadas com ou longo siRNA dsRNA ou, ambos os quais têm sido utilizados com sucesso em mosquitos como evidenciado pelos resultados representativos aqui descritos. Síntese de dsRNA é menos caro do...

Mosquitos sanguíneos que alimentam vetor dos gêneros de anofelinos e aedine transmitir agentes causadores de doenças responsáveis ​​por vários dos piores flagelos da humanidade. Estima-se que 3,4 bilhões de pessoas estão em risco de contrair a malária, que é responsável por mais de meio milhão de mortes por ano em todo o mundo. Resultados da malária de infecção por Plasmodium sp., Que parasita, que são transmitidos às pessoas através da picada de mosquitos infectados do gênero Anopheles, incluindo o principal vector Africano Anopheles gambiae ( <a href="http://www.who.int/topics/malaria/en/">http://www.who.int/topics/malaria/en/</a> , 2014) 1. Aedes aegypti é o mosquito vector primário para o vírus da dengue, o que provoca a febre de dengue, uma doença febril não específica que é a doença mais comum e arbovírus significativa no mundo. O vírus da dengue é, actualmente, uma ameaça para a&gt; 2,5 bilhões de pessoas nos trópicos, com uma inciden anualce de cerca de 50 milhões de casos, resultando em ~ 24 mil mortes por ano ( <a href="http://www.cdc.gov/dengue/">http://www.cdc.gov/dengue/</a> , 2014) 2. Apesar do impacto mundial devastador de doenças transmitidas por mosquitos na saúde humana, meio eficaz de prevenir e tratar essas doenças estão faltando. Controle do mosquito é atualmente o melhor método de prevenção da doença. O potencial para o controle de doenças transmitidas por artrópodes pela manipulação genética de insetos vetores tem sido reconhecida por mais de quatro décadas 3. Estirpes transgénicas de A. aegypti projetado para ter um específico feminino repressible flightless fenótipo fizeram recentemente o potencial para o uso de estratégias de controle de vetores transgênicos uma realidade 4-6. Estes avanços têm desafiado os pesquisadores a identificar alvos genéticos novos para controle do vetor e meios adicionais de manipular a função do gene em mosquitos vetores. A alteração da expressão gênica durante desenvolvimento, como foi o caso em mosquitos fêmeas flightless-4, pode promover a elucidação de novas estratégias de controle do vetor. No entanto, em grande parte devido a dificuldades técnicas, as funções de muito poucos genes foram caracterizadas durante o desenvolvimento de A. gambiae, A. aegypti, ou outras espécies de mosquitos. Desde a sua descoberta em C. elegans 7, a interferência de RNA (RNAi), que é conservado em animais, plantas e microrganismos, tem sido amplamente utilizada para estudos genéticos funcionais em uma ampla variedade de organismos, incluindo insectos 8,9. A via de RNAi é iniciada por Dicer, que cliva o ARNcd longos em curtos siRNAs de 20-25 nucleótidos de comprimento, que funcionam como ARN de interferência específica da sequência. silenciar genes siRNAs que são complementares em sequência através da promoção de mudança de transcritos, segmentação, e rompimento de tradução 9. Longas moléculas de dsRNA (tipicamente 300-600 pb) ou siRNAs segmentação personalizada uma particulasequência r pode ser utilizado no laboratório de pesquisa para silenciar qualquer gene de interesse. Ao gerir quando interferência RNA é entregue, os pesquisadores podem controlar o tempo no qual gene silenciar iniciados. Esta vantagem é útil como ele pode ser usado para superar desafios como a letalidade de desenvolvimento ou esterilidade, que pode dificultar a produção e manutenção de cepas de rolamento mutações hereditárias, um processo caro e trabalhoso, que ainda não está disponível em todas as espécies de insetos. Embora o grau de silenciamento de genes por RNAi pode variar de gene para gene, tecido para tecido e animal para animal, RNAi é amplamente utilizado para a análise funcional de genes em mosquitos e outros insectos 8,9. Três estratégias que interferem entrega ARN têm sido usados ​​em mosquitos: microinjecção, aplicação de imersão / tópica, e ingestão. Para uma história detalhada e comparação da utilização destas três técnicas de insectos, por favor, referir-se a Yu et al 8. We foram utilizados com sucesso microinjecção 10 como um meio de entrega de siRNAs para alvejar genes de desenvolvimento em A. embriões aegypti, larvas, pupas e 11-14. No entanto, esta estratégia de entrega de trabalho intensivo requer tanto uma configuração de microinjeção e uma mão hábil. Além disso, a microinjeção é estressante para o organismo, um fator de confusão, especialmente quando fenótipos comportamentais serão avaliados. Por fim, a entrega microinjeção não pode ser estendida para o campo para o controle de vetores. Como alternativa, a imersão do organismo em interferir solução RNA também tornou-se um meio popular de induzir o silenciamento de genes, como é conveniente e requer pouco equipamento ou de trabalho. De imersão tem sido principalmente aplicado na linha celular de insecto estuda 8, mas num estudo recente, foi conseguida em knockdown A. aegypti imerso numa solução de ARNcd de 15, o que os animais pareceram ser ingestão. No entanto, para os estudos que envolvem a análise de múltiplos experimentagrupos l ou fenótipos, imersão é bastante dispendioso. Lopez-Martinez et al., 16 descrito reidratação impulsionada RNAi, uma nova abordagem para entrega de RNA interferente que envolve a desidratação em solução salina e de re-hidratação com uma única gota de água contendo ARN interferente. Esta abordagem não reduzir os custos associados com a imersão dos animais todo, mas é mais caro do que a microinjecção e pode ser limitado na sua aplicação a espécies que podem tolerar elevadas pressões osmóticas. Além disso, é difícil imaginar como a imersão ou desidratação / reidratação metodologia de imersão poderia ser adaptado para o controle do vetor no campo. Por estas razões, para estudos de pós-embrionárias, a entrega de RNA de interferência com os alimentos ingeridos é uma estratégia alternativa viável. Embora estratégias baseadas ingestão não funcionam em todas as espécies de insetos, talvez mais notavelmente Drosophila melanogaster, a administração oral de RNA de interferência misturado com alimentos promoveu si genelencing em uma variedade de insectos 8,17, incluindo A. adultos aegypti 18. Descrevemos quitosano mediada por ARNi de nanopartículas em A. larvas gambiae 19 e têm aplicado com sucesso esta abordagem para a redução da expressão do gene em A. aegypti 20,21. Aqui, a metodologia para este processo de RNAi, que envolve o aprisionamento de ARN interferente por o polímero de quitosano, é detalhado. Quitosano / ARN interferentes nanopartículas são formadas por auto-montagem de policatiões com ARN interferente através das forças electrostáticas entre cargas positivas dos grupos amino na quitosana e as cargas negativas transportadas por os grupos fosfato na espinha dorsal de ARN de interferência 19. O procedimento descrito é compatível com ambas as moléculas de dsRNA longos (a seguir denominados dsRNA) ou dupla siRNA (doravante referida como siRNA). Após a síntese, o quitosano / interferentes nanopartículas de ARN são misturados com comida de larvas e entregue aolarvas através da ingestão oral. Esta metodologia é relativamente barato, requer pouco equipamento e mão de obra 19, e facilita a análise de alto rendimento de vários fenótipos, incluindo a análise de comportamentos 20,21. Esta metodologia, que pode ser adaptado para estudos de silenciamento de genes em outros insectos, incluindo outros vectores de doenças e pragas de insectos agrícolas, poderia potencialmente ser usada para o silenciamento do gene numa variedade de outras espécies animais. Além disso, o quitosano, um polímero barato, não-tóxica e biodegradável 22, poderia potencialmente ser utilizada no campo de controlo de mosquitos específica da espécie.

<table><tbody><tr><td>Pipetador de 0,02 ml</td><td>Rainin</td><td>PR20</td><td>para ressuspensão de RNA interferente</td></tr><tr><td>Pipetador de 0,2 ml Rainin</td><td></td><td>PR200</td><td>para ressuspensão de RNA interferente e preparação de RNA interferente/nanopartículas</td></tr><tr><td>Tubo graduado de 0,5 ml&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-408-120</td><td>para aliquotação de RNA interferente ressuspenso</td></tr><tr><td>1 ml pipeteiro</td><td>Rainin</td><td>PR1000</td><td>para ressuspensão de RNA interferente e preparação de RNA interferente/nanopartículas</td></tr> tubo <tr><td>graduado de 1,5 ml&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-408-046</td><td>para preparação de RNA interferente / nanopartículas</td></tr><tr><td>1M Acetato de Sódio, pH 4,5</td><td>TEKnova</td><td>S0299</td><td>para preparar tampão de acetato de sódio</td></tr><tr><td>Ácido Acético, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grau</td><td>BDH</td><td>VWR BDH3092-500MLP</td><td>para preparar tampão de acetato de sódio</td></tr><tr><td>Agarose Genetic Technology Grade</td><td>MP Biomedicals LLC.</td><td>800668</td><td>para revestir RNA/nanopartículas interferentes preparadas</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf AG</td><td>5415D</td><td>para granular RNA/nanopartículas interferentes</td></tr><tr><td>Quitosana, de cascas de camarão</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3646-25G</td><td>para combinar com RNA interferente para preparação de RNA/nanopartículas</td></tr><tr><td>interferentes Levedura Seca</td><td>Universal Food Corp</td><td>NA</td><td>para preparar alimentos larvais de mosquitos com RNA/ nanopartículas</td></tr><tr><td>E-RNAi ferramenta</td><td>Centro Alemão de Pesquisa do Câncer</td><td>NA</td><td>para design de dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//</td></tr> <tr><td>ração para peixinho dourado</td><td>Wardley</td><td>Goldfish FLAKE FOOD</td><td>para preparar comida larval de mosquito com RNA/nanopartículas interferentes</td></tr><tr><td>Banho-maria aquecido</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221048</td><td>para aquecer o RNA/nanopartículas interferentes a 55oC</td></tr><tr><td>Gelo</td><td>não aplicável</td><td>não aplicável</td><td>para descongelamento de RNA interferente e preparação de RNA/nanopartículas</td></tr><tr> interferentes<td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Balde de gelo</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-591-44</td><td>para armazenamento de gelo usado durante o procedimento</td></tr><tr><td>pó de fígado</td><td>MP Biomedicals LLC.</td><td>900396</td><td>alimentar larvas de mosquito após o tratamento de RNA/nanopartículas interferentes</td></tr><tr><td>Forno de microondas</td><td>Uma variedade de fornecedores</td><td>não aplicável</td><td>para preparar solução de agarose a 2%</td></tr><tr><td>de petride (100 x 15 mm)</td><td>Fischer Scientific</td><td>875713</td><td>câmara de alimentação de RNA/nanopartículas interferentes para larvas</td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Mettler Toledo</td><td>S220</td><td>para preparação de tampões</td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-640</td><td>para dividir o pellet de RNA/nanopartícula interferente para alimentação de</td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Thermo Scientific/Dharmacon</td><td>custom</td><td>para preparação de siRNA/nanopartículas</td></tr><tr><td>Sulfato de sódio, anidro (Na2SO4)</td><td>BDH/distribuído pela VWR</td><td>VWR BDH0302-500G</td><td>para preparar solução de sulfato de sódio de 50 mM na qual o RNA interferente será </td></tr><tr><td>Termómetro</td><td>VWR</td><td>61066-046</td><td>para medir a temperatura do banho-maria</td></tr><tr><td>Palitos de dente</td><td>VWR</td><td>470146-908</td><td>para mexer durante a preparação de alimentos de RNA/nanopartículas interferentes e cortar pellets de gel</td></tr><tr><td>Congelador ultrabaixo</td><td>Uma variedade de fornecedores</td><td>não aplicável</td><td>para armazenamento de alíquotas de RNA interferentes e RNA/nanopartículas interferentes a -80oC</td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-216-108</td><td>para preparação de quitosana/RNA interferente</td></tr><tr><td>Papel de peso</td><td>Fischer Scientific</td><td>NC9798735</td><td>para dividir o pellet de RNA/nanopartícula interferente para alimentação</td></tr></tbody></table>

a quitosana / rna de interferência nanoparticle mediated silenciamento gênico na doença vector mosquito larvas

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Mosquitos vetores infligir sofrimento mais humano do que qualquer outro organismo - e matar mais de um milhão de pessoas a cada ano. Os projetos mosquito genoma facilitou a pesquisa em novas facetas da biologia do mosquito, incluindo estudos genéticos funcionais no principal vetor Africano malária Anopheles gambiae eo dengue e amarelo vetor da febre Aedes aegypti. ARN de interferência (RNAi-) silenciamento de genes mediado foi usado para genes alvo de interesse em ambas as espécies de mosquito vector doença. Aqui, descrevemos um procedimento para a preparação de quitosana / interferindo nanopartículas de RNA que são combinados com alimentos e ingeridos pelas larvas. Este, de alto rendimento tecnicamente simples, relativamente barato e metodologia, que é compatível com o RNA de cadeia dupla de comprimento (dsRNA) ou pequenos ARN interferentes (siRNA) moléculas, tem sido utilizado para o knockdown bem sucedida de um número de diferentes genes em A. gambiae e A. aegyptilarvas. Após as mamadas larvais, knockdown, o que é verificado através de qRT-PCR ou hibridação in situ, podem persistir pelo menos até a fase de pupa tarde. Esta metodologia pode ser aplicada a uma grande variedade de espécies de mosquitos e outros insectos, incluindo pragas agrícolas, bem como outros organismos não-modelo. Para além da sua utilidade no laboratório de investigação, no futuro, o quitosano, um polímero barato, não-tóxicos e biodegradáveis, podem ser potencialmente utilizados no campo.

<html> A. gambiae: Nanopartículas de quitosano / dsRNA são formados devido à interacção electrostática entre os grupos amino de quitosano e os grupos fosfato de ARNdc. A eficiência de incorporação em nanopartículas ARNcd é geralmente superior a 90% tal como medido pela depleção de ARNcd a partir da solução. Atomic imagens de microscopia de força mostra que as médias de tamanhos de partículas de quitosano-dsRNA de 140 nm de diâmetro, que varia 100-200 nm (Figu...

Aqui, descrevemos um processo para a inibição da função do gene em vectores mosquitos doença através do uso de quitosano / interferindo nanopartículas de RNA que são ingeridos pelas larvas.

A quitosana / RNA de interferência Nanoparticle Mediated silenciamento gênico na Doença Vector Mosquito Larvas

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

O objetivo geral deste procedimento é projetar e utilizar nanopartículas de RNA interferente tussin para estudos de silenciamento gênico em larvas de mosquito. Isso é realizado primeiramente preparando nanopartículas de RNA interferente tussin pela combinação de quitina e RNA interferente, seguida por aquecimento, vortexamento e centrifugação. O próximo objetivo é misturar as nanopartículas com alimento para larvas e aros para preparar pelotas em gel contendo alimento e nanopartículas.O alimento na forma de nanopartículas é fornecido às larvas de mosquito, e a alimentação das larvas com o comprimido é observada, culminando na verificação do silenciamento gênico por meio de reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real. Ou em ensaios de hibridização dois-híbridos. Os fenótipos de perda de função podem ser examinados.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa de mosquitos vetores. Por exemplo, utilizamos este método para estudar as funções de genes durante o desenvolvimento do sistema olfativo, cérebro, intestino médio e outros tecidos de importância vetorial. As principais vantagens desta técnica são sua alta produtividade, custo relativamente baixo e menor estresse para o organismo em comparação com a entrega de RNA interferente por microinjeção, que exige um nível maior de habilidade e não pode ser implementada em campo.Juntamente com a pesquisadora pós-doutoranda Ava Maur, a técnica Ping Lee demonstrará o procedimento. Para começar, dissolva a tussina em tampão de acetato de sódio 0,1 molar para obter uma solução de trabalho a 0,02%. Mantenha a solução em temperatura ambiente antes do uso. Em seguida, dissolva o RNA de fita dupla ou o RNA interferente pequeno, ambos doravante referidos como RNA interferente, em 50 microlitros de água desionizada.Prepare uma solução de 100 microlitros contendo 32 microgramas de ácido nucleico por 100 microlitros de sulfato de sódio 50 milimolar. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de tussin à solução de RNA interferente. Aqueça a mistura em banho-maria a 55 graus Celsius por um minuto.Prepare um controle adicionando 100 microlitros de sulfato de sódio 50 milimolar a 100 microlitros da solução de Tustin e siga o mesmo procedimento após o aquecimento. Misture imediatamente as soluções por 30 segundos em vórtex de alta velocidade à temperatura ambiente para facilitar a formação de nanopartículas. Centrifugue a mistura a 13.000 ×g por 10 minutos à temperatura ambiente, após o que o pellet deverá ser visível. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro e seque o pellet ao ar por aproximadamente 10 minutos à temperatura ambiente antes de utilizá-lo.Para preparar alimento para mosquitos utilizando espectrofotometria UV, meça a concentração de RNA interferente no SNAT utilizando o sobrenadante S do controle como branco para calcular a quantidade total de RNA interferente que permanece no snat. Utilize a diferença entre as quantidades iniciais de RNA interferente e as quantidades remanescentes nos sobrenadantes para calcular a porcentagem de RNA interferente retido nas nanopartículas. Essa eficiência de carregamento é normalmente superior a 90%. Repita o mesmo procedimento caso sejam necessárias mais nanopartículas.Utilize imediatamente as nanopartículas secas, pois o impacto do armazenamento sob refrigeração das partículas antes do uso ainda não foi avaliado. Para formular o alimento para mosquitos, prepare primeiro uma solução de 2% de agar em água deionizada e derreta o agar. Mantenha a solução de agar derretida em banho-maria a 55 graus Celsius antes do uso.Em seguida, misture flocos de ração para peixes e levedura seca na proporção de um para dois. Triture a mistura em partículas pequenas com pilão e almofariz. O alimento moído é acastanhado.Em um tubo de 1,5 mililitro, misture seis miligramas de alimento moído com as nanopartículas secas usando um palito. Em seguida, adicione 30 microlitros de solução de gel de agarose 2% previamente derretida à mistura de alimento e nanopartículas. Agite imediatamente e completamente usando um palito ou a ponteira de uma pipeta.O gel contendo alimento e nanopartículas está agora pronto para alimentar as larvas de mosquito Anopheles gambiae. Retire um único pellet de gel do tubo de 1,5 mililitro usando um palito e corte-o em quatro fatias iguais usando uma lâmina de barbear limpa ou um palito. Em seguida, transfira 23 larvas estrela para uma placa de Petri contendo 100 mililitros de água deionizada.Alimente as larvas de mosquito adicionando uma fatia do pellet em gel, finalmente cortado em pequenos pedaços por placa de Petri. Durante quatro dias, observe diariamente as larvas se alimentando do pellet, que deverá estar significativamente reduzido em tamanho ou completamente ausente no dia seguinte.Os mosquitos desenvolverão até o quarto estágio larval avançado. Registre quaisquer alterações fenotípicas visíveis durante o experimento. Examine os níveis de transcritos e outras alterações fenotípicas conforme discutido no protocolo textual ao final do período de quatro dias para alimentar larvas de mosquitos GTI oitenta.Corte o pellet de gel em quatro fatias iguais usando uma lâmina de barbear limpa ou palito de dente, como antes. Em seguida, coloque 50 h sincronizadas 24 horas após a eclosão dos ovos. Primeiro, coloque larvas em estrela em uma placa de Petri.Em aproximadamente 40 mililitros de água deionizada. Alimente as larvas com uma fatia por placa de Petri durante quatro horas por dia. Novamente, a fatia deve ser finamente picada em pedaços menores.Em seguida, transfira as larvas de volta à dieta larval comum de duas partes de flocos de alimento para peixes moídos e uma parte de levedura seca pelo restante do dia. Repita o procedimento diariamente ao longo dos quatro estágios larvais. Analise os níveis de transcritos e outras alterações fenotípicas conforme discutido no protocolo do texto no tempo de desenvolvimento desejado.Os pontos mostrados aqui são de larvas de quarto estágio de Anis gambi alimentadas com controle, apresentando aparência normal, como esperado. No entanto, a matriz paratraqueal atrófica está desorganizada em larvas alimentadas com RNA interferente de quitina, direcionado à quitina sintase 1, conforme evidenciado pela fuga de azul de dextrina para dentro da chave gástrica. A expressão normal de Orco, o coreceptor obrigatório de odorantes, é observada nas antenas de larvas de Aedes aegypti de quarto estágio alimentadas com controle.Em contraste, a expressão de Orco está ausente em animais alimentados com RNA interferente de tussin, direcionado ao gene single-minded, em comparação com animais alimentados com controle. Animais com supressão do gene single-minded apresentam comportamento defeituoso de rastreamento de odorantes. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar nanopartículas de RNA interferente Keon para silenciar genes durante o desenvolvimento de mosquitos vetores.Essa técnica, que potencialmente poderia ser estendida ao estudo de mosquitos adultos ou outros organismos modelo emergentes, abriu caminho para que pesquisadores explorem as funções de genes identificados em projetos genômicos de mosquitos, vetores de doenças.

chitosaninterfering-rna-nanoparticle-mediated-gene-silencing-disease

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Reversa abordagens genéticas têm-se revelado extremamente útil para determinar quais genes de resistência a patógenos underly vetor em mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra um método utilizado pelo laboratório Dimopoulos para injetar dsRNA em mosquitos Anopheles gambiae, que abrigam o parasita da malária. A técnica de manipular a configuração da injeção e injetar dsRNA no tórax é ilustrado.

Protocolo para Ensaios RNAi em mosquitos adultos (A. gambiae)

Neste protocolo combinamos RNAi mediada silenciamento de genes com...

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A interferência de RNA (RNAi) é uma ferramenta extremamente valiosa para descobrir a função do gene. No entanto, a capacidade de direcionar genes usando RNAi durante os estágios pré-adultos é limitada no principal vetor da malária humana, Anopheles gambiae. Descrevemos um protocolo de RNAi para reduzir a função do gene por meio de injeção direta durante o desenvolvimento da pupa.

RNAi gatilho para o interior<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; As pupas

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Reprodutível dsRNA Microinjection e Bioassay de oviposição em mosquitos e moscas domésticas

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Apresentado aqui é um protocolo para entrega de nanopartículas de quitosana/dsRNA em larvas de Bombyx mori de bicho-da-seda para induzir o silenciamento de genes por ingestão.

Interferência de RNA Larval no Bicho-da-Seda Bombyx mori por meio da Entrega de Nanopartículas de Quitosana/dsRNA

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