A quitosana / RNA de interferência Nanoparticle Mediated silenciamento gênico na Doença Vector Mosquito Larvas

O objetivo geral deste procedimento é projetar e usar nanopartículas de RNA interferentes em tussin para estudos de silenciamento de genes e larvas de mosquitos. Isso é feito primeiro preparando nanopartículas de RNA interferentes pela combinação de quitina e RNA interferente, seguido por vórtice de aquecimento e centrifugação. O próximo objetivo é misturar as nanopartículas com alimentos de larvas e aros para preparar alimentos e nanopartículas contendo pellets de gel.

O alimento de nanopartículas é fornecido às larvas do mosquito e as larvas que se alimentam do pellet são observadas após a verificação do silenciamento do gene por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real. Ou em C dois ensaios de hibridização. Os fenótipos de perda de função podem ser examinados.

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de pesquisa de mosquitos vetores. Por exemplo, nós o usamos para estudar as funções dos genes durante o desenvolvimento do sistema olfativo, intestino médio do cérebro e outros tecidos de importância vetorial. As principais vantagens dessa técnica são que ela é de alto rendimento, relativamente barata e menos estressante para o organismo do que a entrega de RNA interferente por meio de microinjeção, o que requer um maior nível de habilidade e não pode ser implementado no campo.

Junto com a colega de pós-doutorado Ava Maur, o técnico Ping Lee demonstrará o procedimento para começar a dissolver o tussin em tampão de acetato de sódio 0,1 molar para fazer uma solução de trabalho de 0,02%. Mantenha a solução à temperatura ambiente antes de usar. Em seguida, RNA de fita dupla dissolvido ou pequeno RNA interferente, ambos doravante referidos como RNA interferente em 50 microlitros de água deionizada.

Faça uma solução de 100 microlitros de 32 microgramas de ácido nucléico por 100 microlitros de sulfato de sódio 50 milimolar. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de tussin à solução de RNA interferente. Aqueça a mistura em banho-maria a 55 graus Celsius por um minuto.

Configure um controle adicionando 100 microlitros de sulfato de sódio 50 milimolar a 100 microlitros de solução de Tustin e siga o mesmo procedimento após o aquecimento. Misture as soluções imediatamente por 30 segundos por vórtice de alta velocidade à temperatura ambiente para facilitar a formação de centrífuga de nanopartículas, a mistura a 13.000 G por 10 minutos à temperatura ambiente, após o que o pellet de aplicação deve ser visível. Transfira o supinato para um novo tubo de 1,5 mililitro, seque o pellet por aproximadamente 10 minutos em temperatura ambiente antes de usá-lo.

Para preparar alimentos para mosquitos usando fotometria de espectros UV, meça a concentração de RNA interferente no SNAT usando o sobrenadante S do controle como um branco para calcular a quantidade total de RNA interferente que permanece no snat. Use a diferença entre as quantidades iniciais de RNA interferente e as quantidades restantes nos sobrenadantes para calcular a porcentagem de RNA interferente e aprisionado nas nanopartículas. Esta eficiência de carregamento é normalmente superior a 90%Repita o mesmo procedimento se forem necessárias mais nanopartículas.

Utilizar as nanopartículas secas imediatamente, uma vez que o impacto do armazenamento refrigerado das partículas antes da utilização não foi avaliado. Para formular primeiro o alimento para mosquitos, prepare uma solução 2% agro em água deionizada e derreta o aros. Mantenha a solução agro derretida em banho-maria a 55 graus Celsius antes de usar.

Em seguida, misture os flocos de comida de peixe e o fermento seco na proporção de um para dois. Moa a mistura em pequenas partículas com um almofariz e pilão. A comida moída é de cor acastanhada.

Em um tubo de 1,5 mililitro, faça seis miligramas de comida moída com as nanopartículas secas usando um palito de dente. Em seguida, adicione 30 microlitros de solução de gel agros derretido a 2% à mistura de nanopartículas de alimentos. Mexa imediatamente e completamente usando um palito ou ponta de pipeta.

O gel contendo alimentos e nanopartículas está agora pronto para alimentar as larvas do mosquito para alimentar as larvas do mosquito anomalias gambi. Remova uma única pastilha de gel do tubo de 1,5 mililitro usando um palito de dente e corte-a em quatro fatias iguais usando uma lâmina de barbear ou palito limpo. Em seguida, transfira as larvas da 23ª estrela para uma placa de Petri contendo 100 mililitros de água deionizada.

Alimente as larvas do mosquito adicionando uma fatia do pellet de gel. Finalmente cortado em pedaços pequenos por placa de Petri. Uma vez por dia, durante quatro dias, certifique-se de observar as larvas se alimentando do pellet, que deve ser significativamente reduzido em tamanho ou completamente ausente no dia seguinte.

Os mosquitos se desenvolverão no final do quarto larva. Registar quaisquer alterações fenotípicas visíveis durante a experiência. Examine os níveis de transcrição e outras alterações fenotípicas, conforme discutido no protocolo de texto no final do período de quatro dias para alimentar larvas de mosquitos GTI dos anos oitenta.

Corte o pellet de gel em quatro fatias iguais usando uma lâmina de barbear limpa ou um palito de dente como antes. Em seguida, coloque 50 h sincronizado 24 horas após a eclosão dos ovos. Primeiro em larvas de estrelas em uma placa de Petri.

Em aproximadamente 40 mililitros de água deionizada. Alimente as larvas com uma fatia por placa de Petri por quatro horas por dia. Novamente, a fatia deve ser cortada em pedaços menores.

Em seguida, transfira as larvas de volta para a dieta larval regular de dois a um em flocos de comida de peixe moídos e fermento seco pelo resto do dia. Repita o procedimento diariamente em todos os quatro ínstares larvais. Examine os níveis de transcrição e outras alterações fenotípicas, conforme discutido no protocolo de texto no momento de desenvolvimento desejado.

Os pontos mostrados aqui são larvas de anis gambi alimentadas com controle de quarto ínstar parecendo normais conforme o esperado. No entanto, a matriz paraatrófica é interrompida em larvas, alimentadas com quitina interferindo, RNA, visando a quitina sintase uma como evidência pelo azul de dextrina, que vazou para a expressão normal da chave C gástrica de orco. O co-receptor odorante obrigatório é observado nas antenas de controle alimentadas com larvas de quarto ínstar oitenta aegypti.

Em contraste, a expressão de Orco está ausente em animais alimentados com RNA que interfere na tussin, visando o gene single-minded em comparação com animais alimentados com controle. Animais knockdown obstinados têm comportamento de rastreamento de odor defeituoso. Depois de assistir a este vídeo, ele deve ter uma boa compreensão de como usar nanopartículas de RNA interferentes de Keon para silenciar genes durante o desenvolvimento de mosquitos vetores.

Essa técnica, que poderia ser estendida ao estudo de mosquitos adultos ou outros organismos modelo emergentes, abriu caminho para os pesquisadores explorarem as funções dos genes identificados em vetores de doenças, projetos de genoma de mosquitos.