Um chip microfluídico para ICPMS Amostra Introdução

O objetivo geral deste procedimento é gerar e analisar quantitativamente a composição elementar de microgotículas monodispersas contendo células únicas ou soluções aquosas por I-C-P-M-S. Isso é feito primeiro fabricando um chip microfluídico usando moldagem de réplica com PDMS. O segundo passo é conectar as bombas de seringa ao chip microfluídico.

As bombas fornecerão a amostra aquosa e o PFH de fase transportadora altamente volátil e admissível ou orgânica. Quando a bomba de seringa é ligada, o chip microfluídico gera gotículas monodispersas da solução aquosa da amostra ou uma suspensão celular por fluxo, concentrando-se com PFH e ejeta essas gotículas com PFH adicional do chip como um jato de líquido. A etapa final é inserir o chip em um conjunto de transporte que consiste em um aquecedor de cartucho que evapora as gotículas e um recuperador de membrana que remove os solventes antes da ionização e detecção do conteúdo de gotículas por um I-C-P-M-S.

Em última análise, os sinais registrados e uma medição de calibração com uma solução padrão são usados para determinar a composição elementar da solução de amostra ou das células na suspensão. As principais vantagens de nossa técnica microfluídica em relação aos métodos existentes são o tamanho ajustável das gotículas, o baixo consumo de amostras e o baixo risco de nologging ao trabalhar com suspensões celulares ou soluções salinas concentradas. Além disso, o chip microfluídico descartável de baixo custo evita o tempo de limpeza e elimina a contaminação cruzada.

Demonstrando o procedimento estarão todos vin sc, um estudante de doutorado do Laboratório do Professor GTAs e Pascal Fabrica, um aluno de doutorado do meu laboratório. Para iniciar o processo de MICROFABRICAÇÃO, meça 40 gramas de PDMS e quatro gramas de agente de cura PDMS em um prato grande de plástico. Misture as duas partes uniformemente com uma espátula e coloque o prato dentro de um desidratador a vácuo por 20 a 30 minutos para desgaseificar todas as bolhas da mistura.

Durante a desgaseificação. Coloque um molde de fundição em cima de um wafer de silício microestruturado e use a estrutura de orientação ao redor do design para encaixá-lo no lugar em um wafer de silício plano. Coloque outro molde de fundição por cima livremente.

Despeje aproximadamente três a quatro gramas da mistura Degas PDMS em ambos os moldes de fundição. Transfira os dois wafers de silício para uma placa quente. Cure o PDMS a 150 graus Celsius por seis minutos e depois esfrie.

As estruturas PDMS solidificadas na bancada à temperatura ambiente com uma espátula metálica. Separe cuidadosamente os blocos sólidos de PDMS dos moldes. Proteja as superfícies de colagem de ambos os blocos contra contaminação por partículas e impressões digitais.

Ao aplicar uma camada de fita adesiva transparente, as peças PDMS agora podem ser manuseadas e aparadas no tamanho certo com uma tesoura. Após o corte, remova a fita do bloco PDMS microestruturado e use um furador de biópsia para criar as portas de entrada microfluídicas. Isso conclui o processo de fabricação da metade microestruturada do dispositivo e agora está pronto para ser colado e montado com sua contraparte plana.

Para preparar os serviços para a ligação PDMS para PDMS, comece revestindo uma camada de agente de cura PDMS em um wafer de silício em branco a 6.000 RPM por 30 segundos enquanto o agente de cura ainda está úmido, coloque a interface de ligação do bloco PDMS microestruturado em contato com o wafer e aplique pressão suavemente no topo do PDMS para formar uma vedação perfeita sem bolhas. Em uma etapa separada, remova a fita protetora da contraparte plana. Em seguida, separe lentamente o PDMS microestruturado do wafer de silício.

Alinhe cuidadosamente as duas peças PDMS e coloque as duas interfaces de ligação em contato. Aperte suavemente os dois blocos para remover quaisquer bolhas interfaciais e cure o chip PDMS montado por 24 horas Em temperatura ambiente usando um estilete e um dispositivo de alinhamento, faça um corte ao longo da linha indicadora ortogonal ao bico de saída. Inspecione o chip sob um microscópio quanto a defeitos de corte e contaminação por partículas adjacentes ao bico de saída exposto.

Após avaliar a qualidade da fabricação, as superfícies internas do microcanal PDMS estão prontas para serem siloizadas. Em uma capa química, conecte uma extremidade de uma garrafa de lobo a uma fonte de nitrogênio seco e conecte a outra extremidade da garrafa às entradas do chip PDMS. Usando vários tubos conectados a um coletor central, pipete 50 microlitros da selina na garrafa de lobo e feche a tampa superior.

Ligue o fluxo transportador de nitrogênio e lave os microcanais com uma solução salina contendo vapor por 20 minutos a uma taxa de fluxo de aproximadamente um mililitro por segundo. Por fim, desconecte os tubos de entrada da garrafa de lobo. Os chips PDMS revestidos estão prontos para experimentos de espectrometria de massa para medições de espectrometria de massa de célula única.

Primeiro, dilua a amostra de entrada com um tampão apropriado, de modo que a concentração celular efetiva seja inferior a 10 milhões de células por mililitro Na preparação para a espectrometria de massa, comece conectando o tubo às seringas de amostra. Carregar duas seringas de cinco mililitros com o PFH e carregar a amostra de entrada numa seringa separada de um mililitro. Remova todas as bolhas presas nas seringas e tubos e coloque as duas seringas em uma bomba de seringa.

Certifique-se de que o tubo de transporte esteja alinhado corretamente e que todos os tubos de gás estejam conectados. Em seguida, conecte os tubos da seringa às portas de entrada do chip PDMS e ative a bomba da seringa por três a cinco minutos. Durante este processo de estabilização do fluxo, remova qualquer excesso de líquido da porta de saída com um lenço de papel.

Se o fluido sair, o chip não forma um jato reto. Após cinco minutos, tente limpar quaisquer obstruções potenciais na saída do chip com um lenço de papel limpo. Se não for bem-sucedido, descarte o chip existente e substitua a conexão por um novo chip.

Remova o plugue do adaptador do pulverizador ciclônico e insira cuidadosamente o chip PDMS estabilizado por fluxo no adaptador. Altere a taxa de fluxo de acordo com as configurações recomendadas e reestabilize o fluxo por dois a cinco minutos. Ao mesmo tempo, ajustar os caudais de todos os gases até atingir a intensidade máxima do sinal da substância a analisar.

Além disso, ajuste a potência do plasma e a tensão da lente de foco no espectrômetro de massa para aumentar ainda mais a intensidade do sinal na otimização do sinal. Defina o espectrômetro de massa para um tempo de permanência de 10 milissegundos e inicie a aquisição de dados. Após as medições, transfira os dados brutos para um programa de análise de dados.

Em uma rotina típica de análise de dados, todas as medições são primeiro separadas em compartimentos de dados com cada compartimento representando o número de contagens por 10 milissegundos de tempo de permanência e, em seguida, um gráfico de histograma é gerado para todos os compartimentos e ajustado com a função de distribuição gaussiana. A média e a dispersão dos ajustes individuais representam a intensidade média do sinal e o desvio padrão em uma determinada relação massa/carga. Para iniciar o processo de calibração, primeiro meça uma solução padrão na mesma vazão da amostra.

Usando o chip PDMS para geração de gotículas, configure duas seringas de cinco mililitros para PFH e uma seringa de um mililitro para a solução padrão. Em seguida, usando uma placa de Petri como suporte de amostra de microscópio, coloque o chip PDMS na placa de Petri e coloque o chip em foco sob baixa ampliação, espelhando as etapas anteriores do protocolo. Estabilize a geração de gotículas dentro do microcanal PDMS por três a cinco minutos com uma câmera de alta velocidade.

Comece a gravar imagens de gotículas aquosas no chip na junção secundária para obter o diâmetro médio das gotículas das gravações. Use um software de análise de imagem com um conjunto dedicado de morph de gotículas, optometria e simetria de velo. Supondo que cada gota possa ser modelada como um objeto esférico, o volume médio de gotículas pode ser estimado usando o diâmetro médio da gota obtido pelo software.

Em seguida, divida a concentração conhecida do analito da amostra pelo volume médio da gota para obter a massa do analito contida em uma gota. Em seguida, converta a massa resultante no número de átomos. Finalmente, calcule a eficiência geral de detecção dividindo o número de íons medidos por gotícula pelo resultado anterior.

Essa eficiência de detecção agora pode ser usada como uma quantidade de calibração para determinar o número de átomos em uma amostra desconhecida. Usando um gerador de gotículas microfluídicas, células únicas podem ser encapsuladas em gotículas aquosas monodispersas com um diâmetro médio inferior a 50 mícrons e analisadas por ICPMS. A bainha orgânica de PFH ao redor da gota aquosa pode ser facilmente removida antes que a amostra chegue ao detector I-C-P-M-S.

Ao medir soluções, a alta dispersão de gotículas pode ser observada como baixas variâncias entre grupos de sinais provenientes de uma única contagem de gotículas duplas ou triplas dentro de um determinado tempo de permanência. Após calibração adequada, o teor de ferro de um conjunto de glóbulos vermelhos bovinos únicos, cada um suspenso em gotículas únicas, pode ser verificado. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar e usar esses chips microfluídicos para análise elementar quantitativa de volumes de amostra muito pequenos ou partículas e células únicas.

A fabricação desses chips requer menos de 15 minutos, tempo prático por chip se for bem executado. Além disso, os chips fáceis de modificar permitem a integração de outros módulos microfluídicos para pré-tratamento avançado de amostras e introdução simultânea de amostras e padrões para melhorar a eficiência e o rendimento das amostras.