Name: Snapshot Genome-wide de Reguladores da cromatina e Estados em Xenopus Os embriões por Chip-Seq (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprenda o método ChIP-Seq para mapear reguladores da cromatina em embriões de Xenopus. Esta técnica permite analisar interações proteína-DNA e estados cromatínicos durante o desenvolvimento embrionário.

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Agradecemos a Chris Benner por implementar o genoma de X. tropicalis (xenTro2, xenTro2r) no HOMER e ao laboratório Gilchrist por discussões sobre análise pós-sequenciamento. I.P. auxiliou a análise de termos GO. G.E.G. e J.C.S. foram apoiados pelo Wellcome Trust e agora são apoiados pelo Conselho de Pesquisa Médica (programa número U117597140).

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nosso protocolo descreve como fazer e analisar os perfis de cromatina do genoma a partir de embriões de Xenopus. Ele abrange todas as etapas a partir de proteínas de ligação cruzada para loci endógena in vivo para o processamento de milhões de lê representando locais genômicas enriquecidas em silico. Desde um número crescente de projectos de genoma estão disponíveis, este protocolo deve ser aplicável a outros modelos e não-modelo organismos. A seção experimental mais importante, o que diferencia este protocolo para além de trabalhos anteriores 8,31,33,34, é o procedimento pós-fixação para extrair núcleos cruzada. Ele facilita a solubilização cromatina eficiente e de corte e fácil upscaling. Juntamente com as eficiências melhoradas de preparação da biblioteca este protocolo permite a construção de bibliotecas de ChIP-SEQ de alta complexidade da metade a dois milhões de células que expressam o epítopo associado cromatina de interesse. Para as experiências de ChIP-qPCR, alguns dez mil destas células são normalmente suficientepara verificar se há enriquecimento DNA em talvez seis loci genômicos distintas. Estes números são estimativas conservadoras, mas podem variar dependendo do nível de expressão da proteína, a qualidade do anticorpo, eficiência, e acessibilidade epitopo de ligação cruzada. Como um guia, um único embrião de Xenopus contém cerca de 4000 células na fase mid-blástula (8.5, depois de Nieuwkoop e Faber 29), 40.000 células na fase de gástrula tardia (12) e 100.000 células na fase tailbud precoce (20). O tempo de fixação exata para immunoprecipitation eficiente precisa ser determinada empiricamente por Chip-qPCR (seção 10). Em geral, os tempos de fixação mais longos são necessários se o experimento envolve X. laevis embriões, primeiros estágios de desenvolvimento, e fracos (ou indiretas) propriedades de ligação de DNA. No entanto, não é recomendável que fixa embriões Xenopus mais de 40 min, ou o processamento de mais embriões do que o indicado (seção 3), com cromatina de corte torna-se menos eficiente. É importante nãopara usar qualquer glicina após a fixação como essa etapa comum para matar formaldeído pode fazer extração nuclear a partir de embriões de gema-rico muito difíceis. Actualmente, a razão para isto não é conhecido. É concebível que o aducto de formaldeído-glicina reage ainda com N-terminal de amino ou grupos de resíduos de arginina 35. O anticorpo é a chave para qualquer experimento chip e controles suficientes precisam ser realizados para mostrar sua especificidade para o epitopo de interesse (ver orientações por Landt et al. 36). Se nenhum anticorpo ChIP grau está disponível, a introdução das proteínas de fusão marcadas com epítopo correspondente pode ser uma alternativa legítima como estas proteínas endógenas podem ocupar locais de ligação 37. Neste caso, os embriões não injectados são melhores para utilizar como controlo negativo, em vez de um chip com soro não-específico. Esta estratégia pode também ser aplicado se a proteína de interesse é expressa em níveis baixos, resultando em fraca recuperação de enriDNA Ched. Como para fazer bibliotecas ChIP-Seq, devido à baixa quantidade de ADN a ser utilizado, é recomendável optar por procedimentos que reduzam o número de etapas de limpeza e de combinar reacções de manter qualquer perda de ADN a um mínimo. Os adaptadores e os iniciadores têm de ser compatíveis com a sequenciação múltipla e a plataforma NGS (ver Tabela específico de Materiais / Equipamento). Se utilizando Y-adaptadores (contendo braços longos de cadeia simples), é crítico para pré-amplificar a biblioteca de três a cinco rondas de PCR antes das inserções de ADN-seleccionando tamanho (ex., De 100 a 300 pb) por electroforese em gel. Extremidades de cadeia simples causar fragmentos de DNA para migrar de forma heterogênea. Ensaio executado com diversas quantidades de ADN de entrada (por exemplo, 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 e 20 ng) são recomendados para determinar o número total de ciclos de PCR (inferior ou igual a 18 ciclos) necessária para fazer um tamanho -Selecionadas biblioteca de 100 a 200 ng. A redução do número de ciclos de PCR torna a sequenciação de redundant lê menos provável. Fase sólida contas de imobilização reversíveis são bons limpeza reagentes para se recuperar de forma eficiente o DNA de interesse e de forma confiável remova todas as placas livres e dímeros de ligação e reações de PCR. Em termos de número, tipo e comprimento de leituras, em torno 20-30000000 single-end lê de 36 bp é suficiente para a maioria dos experimentos chip-Seq para cobrir todo o genoma Xenopus com profundidade suficiente. As máquinas NGS mais prevalentes são rotineiramente capaz de atender a esses critérios. No entanto, ela pode ser benéfica para aumentar o número de leituras, se uma ampla distribuição de leituras é esperado, conforme observado com modificações de histonas, em vez de picos agudos. Para muitas experiências ChIP-Seq, 4-5 bibliotecas diferente indexados podem ser combinadas e sequenciadas, um fluxo de pista de células utilizando uma máquina de NGS de alto desempenho. Algumas vezes também é conveniente para aumentar o comprimento e a sequência de leitura ambas as extremidades do molde de ADN (emparelhado-final) para aumentar mappability when análise cromatina dentro de regiões genômicas repetitivas. Este protocolo foi aplicado com sucesso a uma grande variedade de características de cromatina, tais como factores de transcrição, mediadores de sinalização e histonas modificações pós-traducionais. No entanto, os embriões adquirir um crescente grau de heterogeneidade celular como elas se desenvolvem e perfis de cromatina se tornam mais difíceis de interpretar. Passos promissores têm sido feitos em Arabidopsis e Drosophila a paisagens cromatina tecidos especificamente perfil por meio da extração de tipo específico de células de núcleos 38,39. Nosso protocolo inclui uma etapa de extração nuclear, o que poderia abrir caminho para tecido-específicas ChIP-Seq em outros embriões.

As primeiras tentativas de caracterizar as interações proteína-DNA in vivo foram relatadas há cerca de 30 anos em um esforço para entender a transcrição gênica mediada pela RNA polimerase em bactérias e na mosca da fruta1,2. Desde então, o uso de imunoprecipitação para enriquecer características distintas da cromatina (ChIP) tem sido amplamente adotado para capturar eventos de ligação e estados de cromatina com alta eficiência3. Posteriormente, com o surgimento de poderosas tecnologias de microarray, esse método levou à caracterização de paisagens de cromatina em todo o genoma4. Mais recentemente, o perfil da cromatina tornou-se ainda mais abrangente e de alta resolução, porque milhões de modelos de DNA co-imunoprecipitados agora podem ser sequenciados em paralelo e mapeados para o genoma (ChIP-Seq) 5. À medida que um número crescente de montagens de genoma está disponível, o ChIP-Seq é uma abordagem atraente para aprender mais sobre a regulação do genoma subjacente aos processos biológicos. 
Aqui fornecemos um protocolo para realizar ChIP-Seq em embriões ricos em gema, como os da rã Xenopus. Rascunhos dos genomas de ambas as espécies de Xenopus amplamente utilizadas - X. tropicalis e X. laevis - foram divulgados pelo International Xenopus Genome Consortium6. Os embriões das espécies de Xenopus compartilham muitas características desejáveis que facilitam e permitem a interpretação de estudos de cromatina em todo o genoma, incluindo a produção de um grande número de embriões de alta qualidade, o grande tamanho dos próprios embriões e seu desenvolvimento externo. Além disso, os embriões são passíveis de manipulações clássicas e novas, como rastreamento de linhagem celular, hibridização in situ de montagem inteira, superexpressão de RNA e tecnologia de nocaute mediada por TALEN / CRISPR.
O protocolo a seguir baseia-se no trabalho de Lee et al., Blythe et al. e Gentsch et al. 7-9. Resumidamente, os embriões de Xenopus são fixados em formaldeído no estágio de desenvolvimento de interesse para ligar covalentemente (reticulação) proteínas ao seu DNA genômico associado. Após a extração nuclear, a cromatina reticulada é fragmentada para focar o sequenciamento subsequente em locais específicos de ligação ou modificação genômica e para minimizar as contribuições das sequências de DNA flanqueadoras. Posteriormente, os fragmentos de cromatina são imunoprecipitados com um anticorpo de grau ChIP para enriquecer aqueles que contêm a proteína de interesse. O DNA co-imunoprecipitado é retirado da proteína e purificado antes de criar uma biblioteca indexada (extremidade emparelhada) para sequenciamento de próxima geração (NGS). No final, linhas de comando simples são oferecidas para a análise pós-sequenciamento dos dados ChIP-Seq.

<table><tbody><tr><td>Microtip cônico de 1/16 de polegada</td><td>Qsonica</td><td>4417</td><td>Este microtip é compatível com Sonicator 3000 da Misonix e Q500/700 da Qsonica.</td></tr><tr><td>Frasco de amostra de vidro de 8 ml com tampa</td><td>Wheaton</td><td>224884</td><td>frascos de amostra de vidro transparente de 8 ml para amostras aquosas com tampas de rosca revestidas de borracha fenólica de tamanho 15-425.</td></tr><tr><td>Adaptador</td><td>, por exemplo, adaptador universal IDT ou Sigma</td><td>NA</td><td>TruSeq, 
AATGATACGGCGACCACCGAG 
ATCTACACTCTTTCCCTACAC 
GACGCTCTTCCGATC*T. Adaptador indexado TruSeq, 
P-GATCGGAAGAGCACACGTC 
TGAACTCCAGTCAC &#8208; NNNNNN&#8208; 
ATCTCGTATGCCGTCT TCTGCTT*G. *, grupo fosforotioato de fosforfato em 5' fim. NNNNNN, índice (consulte o Guia de preparação de amostras TruSeq ChIP para sequência de DNA). Encomende adaptadores HPLC purificados. Os adaptadores podem ser preparados combinando quantidades equimolares (cada 100 &#181; M) do adaptador universal e indexado e resfriá-los lentamente de 95 &#176; C à temperatura ambiente. Use 1,5 pmol por ng de DNA de entrada. Armazene a -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>b2g4pipe (software)</td><td>Blast2GO</td><td>não comercial</td><td>http://www.blast2go.com/data/blast2go/b2g4pipe_v2.5.zip</td></tr><tr><td>BLAST+ (software)</td><td>Camacho et al.</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastDocs&amp não comercial</td><td>; DOC_TYPE=Download</td></tr><tr><td>Bowtie (software)</td><td>Langmead et al.</td><td>não comercial</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml</td></tr><tr><td>cisFinder (software)</td><td>Sharov et al.</td><td>chip http://lgsun.grc.nia.nih.gov/CisFinder/ não comercial</td><td></td></tr> <tr><td>para eletroforese capilar</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td>Carregue este chip com 1 &micro; l DNA para controle de qualidade da biblioteca. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Sistema de eletroforese capilar baseado em chip</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td>O Agilent 2100 BioAnalyzer é usado para verificar a qualidade das bibliotecas ChIP-Seq. Manter os reagentes a 4 °C.</td></tr><tr><td>Kit de preparação da biblioteca ChIP-Seq (KAPA Hyper Prep Kit)</td>O kit <td>KK8504</td> da <td>Kapa Biosystems</td><td>contém reparo final KAPA e mistura de enzimas de cauda A, reparo final e tampão de cauda A, DNA ligase, tampão de ligação, KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) e mistura de primer de amplificação de biblioteca KAPA (10X) (ver também primers de PCR). Adaptadores não estão incluídos. Armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Kit de preparação de biblioteca ChIP-Seq (alternativa, ThruPLEX-FD Prep Kit)</td>O Kit <td>R40048</td> da <td>Rubicon Genomics</td><td>usa seus próprios adaptadores e primers de alça de haste. Este kit elimina etapas intermediárias de purificação e é tão sensível quanto o KAPA Hyper Prep Kit. Armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Cluster3 (software)</td><td>de Hoon et al.</td><td>http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster não comercial</td><td></td></tr><tr><td>FastQC (software)</td><td>Simon Andrews</td><td>http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc não comercial</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer</td><td>life technologies</td><td>Q32866</td><td>Qubit 2.0</td></tr><tr><td>Fluorômetro reagentes</td><td>life technologies</td><td>Q32851</td><td>O kit fornece reagente de ensaio concentrado, tampão de diluição e padrões de DNA pré-diluídos para o fluorômetro Qubit. Armazene os padrões de DNA em 4 &deg; C, tampão e corante à temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Sigma</td><td>F8775-4X25ML</td><td>Solução de formaldeído, para biologia molecular, 36,5-38% em H2O, estabilizada com 10-15% de metanol. Armazene em temperatura ambiente. CUIDADO: O formaldeído é corrosivo e altamente tóxico.</td></tr><tr><td>Gel (E-Gel EX agarose, 2%)</td><td>life technologies</td><td>G4010</td><td>Gel pré-moldado com 11 poços, formato que pode ser aberto. Deixe uma faixa entre a escada e a biblioteca vazia para evitar contaminação cruzada. Armazene os géis em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Tecnologias de vida útil</td> <td>do sistema de eletroforese em gel</td><td>G6465</td><td>E-Gel iBase e E-Gel Safe Imager kit combinado para bibliotecas ChIP-Seq de seleção de tamanho.</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>Armazene todos os reagentes em temperatura ambiente. Use 500 &micro; l de tampão QG por 100 mg de fatia de gel de agarose a 2% para extrair DNA. Use colunas MinElute (do kit de purificação MinElute PCR) para eluir o DNA duas vezes.</td></tr><tr><td>HOMER (software)</td><td>Chris Benner</td><td>não comercial</td><td>http://homer.salk.edu/homer/index.html</td></tr><tr><td>Forno de hibridização</td><td>Techne</td><td>FHB1D</td><td>Hybridizer HB-1D</td></tr><tr><td>IGV (software)</td><td>Robinson et al.</td><td>http://www.broadinstitute.org/igv/home não comercial</td><td></td></tr><tr><td>Illumina CASAVA-1.8 filtro de qualidade (software)</td><td>Assaf Gordon</td><td>http://cancan.cshl.edu/labmembers/gordon/fastq_illumina_filter</td>não <td>comercial</td></tr><tr><td>Java TreeView (software)</td><td>Alok Saldanha</td><td>não comercial</td><td>http://jtreeview.sourceforge.net</td></tr><tr><td>Laboratory jack</td><td>Edu-Lab</td><td>CH0642</td><td>Este conector é usado para elevar a amostra no gabinete de som para sonicação.</td></tr><tr><td>Escada, 100 pb</td><td>New England BioLabs</td><td>N3231</td><td>Mantenha 1x solução à temperatura ambiente. Armazene o estoque a -20 °C.</td></tr><tr><td>Escada, 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232</td><td>Mantenha 1x solução em temperatura ambiente. Armazene o estoque a -20 °C.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de baixa retenção de 1,5 ml</td><td>life technologies</td><td>AM12450</td><td>tubos de microcentrífugas antiaderentes e livres de RNase, 1,5 ml</td></tr><tr><td>MACS2 (software)</td><td>Tao Liu</td><td>não comercial</td><td>https://github.com/taoliu/MACS</td></tr><tr><td>Magnetic beads</td><td>life technologies</td><td>11201D</td><td>Estes Dynabeads são grânulos superparamagnéticos com IgG anti-rato de ovelha policlonal purificada por afinidade ligada covalentemente à superfície do grânulo. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Tecnologias de vida de contas magnéticas</td><td></td><td>11203D</td><td>Estas Dynabeads são contas superparamagnéticas com IgG anti-coelho de ovelha policlonal purificada por afinidade covalentemente ligadas à superfície do grânulo. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Magnetic beads</td><td>life technologies</td><td>10001D</td><td>Estes Dynabeads são grânulos superparamagnéticos com proteína recombinante A covalentemente ligada à superfície do grânulo. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Magnetic beads</td><td>life technologies</td><td>10003D</td><td>Estes Dynabeads são grânulos superparamagnéticos com proteína G recombinante ligada covalentemente à superfície do grânulo. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Tecnologias de vida útil do rack magnético</td><td></td><td>12321D</td><td>DynaMag-2 ímã</td></tr><tr><td>MEME</td><td>Bailey et al.</td><td>não comercial</td><td>http://meme.nbcr.net/meme/</td></tr> <tr><td>Na3VO4</td><td>New England BioLabs</td><td>P0758</td><td>O ortovanadato de sódio (100 mM) é um inibidor geral comumente usado para proteínas fosfotirosil fosfatases. Armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>NaF</td><td>New England BioLabs</td><td>P0759</td><td>O fluoreto de sódio (500 mM) é comumente usado como inibidor geral de fosfosseril e fosfotreonil fosfatases. Armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Máquina NGS</td><td>Illumina</td><td>SY-301-1301</td><td>Analisador de Genoma IIx</td></tr><tr><td>Máquina NGS (alto desempenho)</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td>HiSeq</td></tr><tr><td>Soro normal (controle de anticorpos)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2028</td><td>Use como controle para anticorpos IgG policlonais de cabra em experimentos ChIP-qPCR. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Soro normal (controle de anticorpos)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td>Use como controle para anticorpos IgG policlonais de camundongo em experimentos de ChIP-qPCR. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Soro normal (controle de anticorpos)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2027</td><td>Uso como controle para anticorpos IgG policlonais de coelho em experimentos de ChIP-qPCR. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Solução de coloração de ácido nucleico</td><td>iNtRON</td><td>21141</td><td>Use a solução de coloração de ácido nucleico RedSafe a 1:50.000. Armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Laranja G</td><td>Sigma</td><td>O3756-25G</td><td>1-fenilazo-2-naftol-6,8-ácido dissulfônico sal dissódico. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Primers de PCR</td><td>, por exemplo, IDT ou Sigma</td><td></td><td>Primers para enriquecer fragmentos de DNA ligados a adaptadores por PCR: AATGATACGGCGACCACCGA*G e CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G, ligação fosforotioato. Primers desenhados por Ethan Ford. Combine primers em 5 &micro; M cada. Use 5 &micro; l em um 50 &micro; l reação de PCR. Armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Kit de purificação de PCR MinElute&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td>para purificação de amostras de teste de ChIP-qPCR e cisalhamento. Armazene as colunas de rotação MinElute a 4 graus; C, todos os outros tampões e tubos de coleta à temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1, pH 7,9)</td> <td>tecnologias de vida</td><td>AM9730</td><td>Fenol: Clorofórmio: IAA (25: 24: 1) é pré-misturado e fornecido em pH 6,6. Use o tampão alcalino Tris fornecido para aumentar o pH para 7,9. Armazene a 4 graus C. CUIDADO: fenol: clorofórmio: álcool isoamílico é corrosivo, altamente tóxico e combustível.</td></tr><tr><td>Primer3 (software)</td><td>Steve Rozen & Helen Skaletsky</td><td>comprimidos inibidores de</td><td>protease de http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi</td>não comerciais</tr><tr><td></td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>completos, Mini, sem EDTA. Use 1 comprimido por 10 ml. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Os comprimidos inibidores de protease</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>completos, sem EDTA. Use 1 comprimido por 50 ml. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>life technologies</td><td>AM2548</td><td>solução de proteinase K (20 &micro; g/&micro; l). Armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>life technologies</td><td>12091-039</td><td>RNase A (20 &micro; g/&micro; l). Armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td>Rotator SB3</td></tr><tr><td>SAMtools (software)</td><td>Li et al.</td><td>http://samtools.sourceforge.neta não comercial</td><td></td></tr><tr><td>Esferas de imobilização reversíveis em fase sólida</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>As contas Agencourt AMPure XP são usadas para minimizar a contaminação do dímero do adaptador nas bibliotecas ChIP-Seq. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Sonicator 3000</td><td>Misonix/Qsonica</td><td></td><td>Modelos mais recentes já estão disponíveis. Q125, Q500 ou Q700 são todos adequados para cisalhamento de cromatina reticulada.</td></tr><tr><td>Caixa de som</td><td>Misonix/Qsonica</td><td></td><td>opcional: siga a recomendação do fabricante para obter a caixa de som correta.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>eppendorf</td><td>22670000</td><td>Thermomixer para 24 tubos de 1,5 mL. Controle preciso de temperatura de 4 > C acima da temperatura ambiente a 99 °C.</td></tr></tbody></table>

snapshot genome-wide de reguladores da cromatina e estados em<em&gt; xenopus</em&gt; os embriões por chip-seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

O recrutamento de reguladores da cromatina e a atribuição de estados de cromatina a loci genômicos específicos são fundamentais para as decisões de destino celular e formação de tecidos e órgãos durante o desenvolvimento. Determinar as localizações e níveis de tais características da cromatina in vivo fornecerá informações valiosas sobre a regulação espaço-temporal dos elementos genômicos e apoiará as aspirações de imitar o desenvolvimento do tecido embrionário in vitro. O método mais comumente usado para perfis de todo o genoma e de alta resolução é a imunoprecipitação da cromatina seguida de sequenciamento de próxima geração (ChIP-Seq). Este protocolo descreve como embriões ricos em gema, como os da rã Xenopus, podem ser processados para experimentos ChIP-Seq e oferece linhas de comando simples para análise pós-sequenciamento. Devido à alta eficiência com que o protocolo extrai núcleos do tecido fixado em formaldeído, o método permite fácil upscaling para obter material ChIP suficiente para o perfil de todo o genoma. Nosso protocolo tem sido usado com sucesso para mapear várias proteínas de ligação ao DNA, como fatores de transcrição, mediadores de sinalização, componentes da maquinaria de transcrição, modificadores de cromatina e modificações de histonas pós-traducionais, e para que isso seja feito em vários estágios da embriogênese. Por fim, este protocolo deve ser amplamente aplicável a outros organismos modelo e não modelo à medida que mais e mais montagens de genoma se tornam disponíveis.

Resultados equivalentes aos resultados aqui apresentados são esperados se o protocolo é bem executado e o anticorpo em uso é de qualidade ChIP-grade (ver discussão). Este protocolo permite a extracção de núcleos a partir de embriões de Xenopus fixado em formol e o corte eficiente de cromatina por ultra-sons (Figura 1A-C). Cromatina cortados mostra uma distribuição assimétrica dos fragmentos de DNA que variam normalmente de 100 a 1000 pb e com um pico entre 300 e 500 pb (Figura 1C). A 50 pg mínima de DNA imunoprecipitado é necessário para fazer com sucesso uma biblioteca ChIP-Seq emparelhado-end indexado com inserções de DNA de tamanho similar (Figura 2A). A biblioteca deve ser desprovido de dímeros do adaptador, que pode ser visto no electroferograma em aproximadamente 120 pb. Após a sequenciação por síntese, pré-processado lê são mapeados para o genoma (Figura 2B, C). Em uma experiência bem-sucedida com <em&gt; X. embriões tropicalis, normalmente 50 a 70% de um único final lê de 40 pb podem ser mapeados exclusivamente para a montagem do genoma de v7.1 maximamente com dois desemparelhamentos. Enquanto entrada lê alinhar bastante uniforme em todo o genoma, o alinhamento dos ChIP lê resultados em enriquecimentos específico de cadeia que ladeiam o recurso de cromatina de interesse. Isto porque todos os fragmentos são sequenciados a partir da extremidade 5 &#39;(Figura 2C) 25. Estendendo o alinhamento na direcção de leitura para um tamanho médio de fragmento produz perfis precisos para os dispositivos individuais de cromatina, tais como os eventos de ligação de factor de transcrição. Estas ocupações de ADN aparecem como picos quando visualizados em IGV ou qualquer outro navegador genoma compatível. Chamadores de pico como MACS são usados ​​para determinar a localização destes picos (Figura 3A). Desta forma, dezenas de milhares de locais de ligação foram determinadas no X. tropicalis genoma para T-box fatores de transcrição como Vegt 26. ChIP-qPCR experimentos deve confirmar o enriquecimento local encontrou por Chip-Seq (Figura 3B). Experimentos chip-Seq permitem explorar as características do genoma de recursos de cromatina. Por exemplo, o cálculo da distribuição de leitura sobre os elementos genômicos, como início da transcrição e locais de terminação pode destacar as preferências de ligação espaciais ao redor de genes (Figura 3C). Da mesma forma, um mapa de calor de distribuições de leitura em locais de pico é utilizado para comparar diferentes características de cromatina numa escala de todo o genoma (Figura 3D). Certos fatores de transcrição ligam DNA sequence-especificamente. De novo motivo análise do DNA genômico picos subjacentes pode recuperar esse tipo de informação, incluindo motivos co-enriquecido de potenciais co-fatores (Figura 3E). A grande maioria dos genes-alvo mostram ocupação DNA em um menor, em vez de nível superior (Figura 3F). Este recurso livre de escala parece ser bastante comum entre os trfatores anscription e sugere que apenas uma pequena fração dos genes-alvo são diretamente regulados com relevância biológica 27,28. A análise dos termos GO enriquecidos ou outros atributos, tais como a expressão diferencial de genes alvo pode revelar mais insights sobre a função biológica da característica da cromatina no embrião de Xenopus (Figura 3G). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52535/52535fig1highres.jpg" /> Figura 1. Chromatin procedimento immunoprecipitation para embriões de Xenopus. (A) Os embriões estão no estágio de desenvolvimento de interesse para ligar covalentemente (cross-link) quaisquer proteínas associadas com DNA genômico fixo-formaldeído. Após a extração nuclear (B), a cromatina reticulada é fragmentada para diminuir DNA genômico de ligação ou locais de modificação da cromatina, minimizando o DN flanqueandoUma sequência (C). Subsequentemente, os fragmentos de cromatina são imunoprecipitadas com um anticorpo ChIP grau de enriquecimento daqueles contendo o epitopo de interesse (D). O DNA co-imunoprecipitou é retirada da proteína e purificado (E) antes de criar a biblioteca de fragmentos de chip para NGS (Figura 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52535/52535fig2highres.jpg" /> Figura 2. ChIP-Seq preparação biblioteca, sequenciamento-by-síntese, mapeamento e pico de chamada. (A) O electroferograma exibe uma biblioteca boa ChIP Seq com moldes de DNA de 250 a 450 pb. Estes modelos implica a inserção de ADN de interesse ladeado pelo universal (58 pb) e o (63 pb) do adaptador indexado. (B) </strong&gt; Milhões de grupos, com cada grupo contendo modelos idênticos, são base seqüenciado por base, na presença de todos os quatro nucleotídeos que possuem reversível, fluorophore distinta e propriedades de terminação idênticos. As imagens fluorescentes são processados ​​em tempo real, para ligar as bases correspondentes, os quais, em última análise são reunidos em lê. (C) Apenas lê que o mapa de forma única para o genoma de Xenopus são mantidos. Como todos os fragmentos são sequenciados a partir da extremidade 5 &#39;, o mapeamento de ChIP lê resulta em picos específica de cadeia simples que flanqueiam o recurso de cromatina de interesse. Desse modo, os chamadores de pico detectar o enriquecimento que se origina de imunoprecipitação e estender a lê para um comprimento médio fragmento de localizar com precisão características de cromatina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52535 / 52535fig3highres.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Um exemplo de análise pós-sequenciamento e visualização de dados por meio do fator T-box zygotic transcrição Vegt (zVegT). Todas as lidas contagens mostradas aqui são normalizados para 10 milhões exclusivamente mapeados e não redundante lê. (A) Trecho do perfil de todo o genoma de zVegT obrigatório em X. tropicalis gastrula embriões (estágio 11-12,5 após Nieuwkoop e Faber 29). Cada pico, um engavetamento de prorrogado lê, representa um local de ligação. Estes picos são denominadas por MACS2 com uma taxa de detecção de falsas (FDR) de menos do que 1%. Cada gene MESP mostra zVegT muito proximal ea montante obrigatório, mas apenas Mespa e mespb são expressos por esse estágio (dados de RNA-Seq 30). (B) os níveis de ocupação DNA de zVegT conforme determinado pelo chip-qPCR em vários loci (incluindo um não -bound região 0,5 kb a montante do β -actina) confirm o enriquecimento específico encontrado por Chip-Seq. Comparar resultados para Mespa com pico chamado (barra vermelha) em (A). O nível de ocupação de ADN é visualizado como uma percentagem de entrada para ambos, o chip com o anticorpo Vegt (policlonal de coelho do isotipo IgG) e o chip com o anticorpo de controlo (IgG de coelho normal). As barras de erro reflectem o desvio padrão de duas réplicas biológicas. (C) METAGENE análise mostra ligação preferencial zVegT (tags binned mais de 25 pb) do promotor em relação a qualquer outra região genómica em torno e dentro dos corpos de genes. (D) mostra Heatmap k-significativo agrupadas níveis (k = 5) de ocupação DNA (tags finalmente resolvido mais de 25 pb) de zVegT e Smad2 / Smad3 (dados do chip-Seq 31) em relação a todas as regiões zVegT-bound em fase de gástrula. O heatmap é log 2 base e centrado em 5 tags por bp. (E) De novo a análise descobre o motivo canônica fator de transcrição T-box motivo de ligação em 38% dos zVegT-regiões com destino se a pontuação motivo subjacente é normalizado para uma taxa de detecção de 5% em sequências de fundo. O mapa de densidade mostra maior enriquecimento para o motivo T-box no centro de locais de ligação zVegT, ao passo que o motivo de ligação de Smad2 / Smad3 canónica é dificilmente enriquecido. (F) histograma mostra os níveis de ocupação de ADN zVegT, que são calculados para cada gene alvo de todos os picos (+/- 200 pb) entre 5 kb a montante [-]. e 1 kb a jusante [+] de sítios de início da transcrição correspondente (G) Top 300 genes com os maiores níveis de ocupação DNA dentro -5 kb e um kb são enriquecido para os processos biológicos de desenvolvimento embrionário precoce. Estes vão termos estão em linha com a função putativa de zVegT. A FDR é baseado em um teste exato de duas caudas de Fisher e corrigida para testes múltiplos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

A questão de como os reguladores e os estados de cromatina cromatina afetar o genoma in vivo é essencial para a nossa compreensão de como o diagnóstico precoce decisões destino celular são feitas no embrião em desenvolvimento. Abordagem mais popular para investigar características de cromatina em um nível-se global definida aqui para embriões de Xenopus o chip-Seq-.

Snapshot Genome-wide de Reguladores da cromatina e Estados em<em&gt; Xenopus</em&gt; Os embriões por Chip-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

O objetivo deste procedimento, comumente conhecido como ChIP-seq, abreviação de imunoprecipitação da cromatina, seguido de sequenciamento de próxima geração, é determinar a localização em todo o genoma dos reguladores da cromatina e estados da cromatina no embrião opus. Isso é feito primeiro fixando embriões zap e, assim, ligando covalentemente as proteínas associadas ao DNA ao genoma. Em seguida, os núcleos são extraídos e sua cromatina é solubilizada e compartilhada por sonicação.Neste ponto, a proteína ligada ao DNA de interesse é purificada por imunoprecipitação e lavagem extensiva. A etapa final é criar uma biblioteca ChIP-seq indexada a partir dos fragmentos de DNA purificados. Em última análise, milhões de cinco homens primos desses fragmentos de DNA, os chamados res, são sequenciados em paralelo, alinhados ao genoma e estendidos ao comprimento médio do fragmento.O enriquecimento local dos chamados picos res é determinado para identificar todas as ocupações de DNA específicas do local da proteína de interesse e, assim, expandir o estudo de suas características em todo o genoma. Portanto, este protocolo pode fornecer informações detalhadas sobre a arquitetura da cromatina em todo o genoma dos embriões emas. Também pode ser aplicado a outros organismos com genomas sequenciados.Comece com os embriões de escritura. Os detalhes até este ponto são fornecidos no protocolo de texto. Transfira-os em um frasco de vidro de oito mililitros e lave-os com 0,01 XMMR.Após a lavagem, fixe os embriões com 1% de paraformaldeído e 0,01 XMMR. Deixe a correção durar pelo menos 15 a não mais de 40 minutos em temperatura ambiente. Termine a correção lavando os embriões três vezes com 0,01 XMMR frio.Evite que os embriões toquem a superfície da solução, pois a tensão superficial levará à ruptura. Depois de lavar o fixador, fazer alíquotas de 250 embriões em microtubos de lixo. Em seguida, hipo pesar o máximo possível de 0,01 XMMR e prossiga com a extração da cromatina para pausar.Aqui igualam os embriões em 250 microlitros de tampão HEG frio. Uma vez instalados no tampão, os embriões podem ser congelados em nitrogênio líquido e armazenados a 80 graus Celsius negativos. Comece homogeneizando os embriões fixos em E um tampão.Detalhes sobre upscaling e preparação de buffer são fornecidos no protocolo de texto. Próxima centrífuga. Os homogeneizados a quatro graus Celsius aspiram e descartam o estado e ressuspendem os pellets em E um.Novamente, mantenha a amostra no gelo por 10 minutos. Repita a centrifugação e desta vez Reese, suspenda a paleta em E dois. Aguarde 10 minutos enquanto o homogeneizado esfria no gelo.Em seguida, repita a centrifugação novamente e Reese suspenda o pellet em E três. Desta vez, após esfriar por mais 10 minutos, a suspensão deve parecer bastante transparente porque, a essa altura, o detergente onic torna a maioria das plaquetas de gema restantes solúveis. Agora, repita a centrifugação. Andre.Suspenda os pellets em um a três mililitros de E três. Se necessário, use a última etapa de centrifugação para separar todos os pellets dos núcleos reticulados desejados. Esta suspensão também contém grânulos de pigmento e algumas plaquetas vitelinas residuais.Esses grânulos e plaquetas vitelinosas serão separados da cromatina após sonicação por centrifugação. Agora mantenha a amostra no gelo e prossiga com a fragmentação da cromatina. Como alternativa, congele a amostra para armazenamento temporário.Comece transferindo a amostra em E três para um tubo de poliestireno personalizado. Para o sonicate, conecte o tubo a um copo de 800 mililitros com água gelada usando um termômetro curto clamp para que ele permaneça chamado durante a sonicação. Coloque o béquer em um conector e ajuste o conector de modo que a ponta do sônico mergulhe cerca de dois terços do caminho na amostra.A ponta sonicada não deve tocar a parede do tubo. Otimize a sonicação, começando com os parâmetros recomendados pelo fabricante do meu Sonic Sonicate 3000 equipado com um micro sonicado de microponta cônica de 16 polegadas sete minutos no total. 30 segundos de cada vez entre a sonicação.Deixe a amostra descansar por um minuto. Inicie cada sonicação com uma potência de um e aumente-a gradualmente para entre dois e quatro. Se a amostra começar a espumar, reposicione o tubo e deixe a espuma se dissipar antes de continuar Após a sonicação, a cromatina é solubilizada e cisalhada.Transfira para pré-resfriamento de 1,5 mililitro para micro tubos de lixo e centrifugue em velocidade máxima. Durante cinco minutos a quatro graus Celsius, recolher o SNA e transferi-lo para tubos de pré-resfriamento. Descarte o pellet.Use 50 microlitros de SUP Comece transferindo de 10 a 30 microlitros de SUP de cromatina para um novo tubo para servir como amostra de entrada. Em seguida, adicione anticorpo de grau de chip em cerca de um micrograma por milhão de células à cromatina restante.Incubar a amostra de anticorpo de cromatina durante a noite, também a quatro graus Celsius, mas com 10 RPM de rotação. No dia seguinte, lave as esferas magnéticas compatíveis com anticorpos em E três por cinco minutos a quatro graus Celsius. Usando a concentração de grânulos sugerida pelo fabricante nos grânulos lavados para anticorpo pré-incubado cromatina Incubar a quatro graus Celsius com rotação por mais quatro horas.Em seguida, usando o buffer de estripador resfriado, lave as contas 10 vezes. Use o ímã por 20 a 30 segundos para separar as contas entre as lavagens. A solução deve ser clara.Siga as lavagens do tampão do ríper com uma lavagem usando o tampão 10 resfriado. Em seguida, transfira as contas em um pequeno volume de 10 tampão para um novo tubo. Separe os grânulos e descarte o tampão residual.Para destacar a cromatina imunoprecipitada. Reese dobrou as esferas em 50 a 100 microlitros de tampão de solução SDS e vortex o tubo com um misturador térmico. Em seguida, centrifugar o tubo à velocidade máxima durante 30 segundos e recolher o snat contendo o eluato de cromatina imunoprecipitado.Repita a solução SDS, passo uma vez e combine todo o eluído. Em seguida, prossiga com a extração de DNA, ChIP-seq, preparação da biblioteca e sequenciamento de próxima geração conforme descrito no protocolo de texto seguindo este protocolo, a cromatina compartilhada mostra uma distribuição assimétrica de fragmentos de DNA, variando principalmente de 100 a 1000 pares de bases e atingindo um pico entre 300 e 500 pares de bases. Um mínimo de 50 picogramas de DNA imunoprecipitado é necessário para fazer com sucesso uma biblioteca N ChIP-seq emparelhada com índices com inserções de DNA de tamanho semelhante.A biblioteca deve ser amplamente desprovida de dímeros adaptadores, que podem ser vistos no eletroferograma em aproximadamente 120 pares de bases. O sequenciamento da biblioteca ChIP-seq reduz milhões de sequências curtas de DNA, as chamadas leituras. Eles são mapeados para o genoma enquanto as leituras de entrada se alinham uniformemente ao longo do genoma.As leituras do chip mostram enriquecimentos específicos da fita que flanqueiam a característica de interesse da cromatina. Estender o alinhamento na direção de leitura para um tamanho médio de fragmento reduz perfis precisos para características de cromatina única, como eventos de ligação do fator de transcrição. Eles aparecem como picos em um navegador de genoma, como mostrado aqui para o chá vegetariano no estágio gastro list dos embriões dos trópicos de Zeno.Os experimentos ChIP-seq permitem explorar as características de todo o genoma das características da cromatina, como motivos de sequência de DNA enriquecidos subjacentes aos picos ou análise de ontologia gênica de alvos genéticos, como mostrado aqui, as interações TDNA de bancada mapeadas após seu desenvolvimento. Este método abre caminho para os pesquisadores explorarem a paisagem da cromatina embrionária, tanto em larga escala do genoma, sob uma resolução muito alta.

genome-wide-snapshot-chromatin-regulators-states-xenopus-embryos-chip

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

A diferenciação do ESC coincide com células tipo mudanças específicas na estrutura e composição da cromatina. A detecção dessas mudanças fornece informações valiosas sobre os mecanismos que definem stemcellness e diferenciação celular. Cromatina imunoprecipitação (CHIP) representa um método valioso para dissecar os mecanismos moleculares subjacentes à diferenciação de células-tronco.

Cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas

Nós demonstramos uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) para identificar as interações fator em tecido-específicos genes durante ou após o início da tecido-específicos de expressão gênica em camundongos tecido embrionário. Este protocolo deve ser amplamente aplicáveis ​​para o estudo do tecido-específicos ativação do gene como ocorre durante o desenvolvimento embrionário normal.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina Genes Tissue-específicos usando embriões em início de carreira do rato

Um regulamento ajuste fino da transcrição do gene subjacente a decisão destino da célula embrionária. Aqui, descrevemos ensaios de imunoprecipitação de cromatina utilizados para investigar regulação epigenética de ambos diferenciação cardíaca de células estaminais e desenvolvimento cardíaco de embriões de camundongos.

Regulação epigenética da Cardiac diferenciação de células estaminais embrionárias e Tecidos

Aqui, descrevemos uma imunoprecipitação da cromatina (ChIP) e protocolo de preparação ChIP-seq biblioteca para gerar perfis de epigenomic global de amostras embrionárias de galinha baixa abundância.

Cromatina (ChIP) imunoprecipitação para baixo-abundância embrionárias amostras

Aqui, descrevemos um protocolo de ChIP-sequenciamento da elevado-produção otimizado e pipeline de análises computacionais para a determinação de padrões de estado todo o genoma da cromatina de tecidos de tumor congelado e linhas celulares.

Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor

Este trabalho descreve um protocolo para a geração de alta resolução em situ Hi-C bibliotecas de encenado firmemente pre-gastrulação Drosophila melanogaster embriões.

Geração de todo o genoma da cromatina conformação captura bibliotecas de firmemente encenado embriões adiantados da drosófila

Aqui, descrevemos os métodos para executar o ChIP-Seq e CARIP-Seq, incluindo preparação de biblioteca para o sequenciamento de última geração, para gerar epigenomic global e cromatina associada RNA mapas em pilhas do ES.

CARIP-Seq e ChIP-Seq: métodos para identificar a cromatina associada RNAs e interações da proteína-ADN em células-tronco embrionárias

Este método é projetado para seguir a formação de domínios de cromatina mediada por PRC2 em linhas celulares, e o método pode ser adaptado para muitos outros sistemas.

Um método para estudar a formação de novo dos domínios da cromatina

A determinação precisa de locais de ligação de proteínas em todo o genoma é importante para entender a regulação genética. Aqui descrevemos um método de mapeamento genômico que trata DNA cromatina-imunoprecipitado com digestão exonuclease (ChIP-exo) seguido de sequenciamento de alta produtividade. Este método detecta interações proteína-DNA com resolução de mapeamento quase par de bases e alta relação sinal-ruído em neurônios mamíferos.

Mapeamento de alta resolução de interações proteína-DNA em neurônios derivados de células-tronco do rato usando Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Este protocolo fornece um pipeline computacional simplificado para quantificar transcritos de intensificadores nascentes. Ao integrar a acessibilidade da cromatina, a característica da cromatina e os dados transcricionais, ele permite a detecção precisa e a análise específica da atividade do intensificador em regiões intragênicas complexas, mantendo-se acessível a pesquisadores sem treinamento extensivo em bioinformática.

Um pipeline computacional para quantificação de RNA intensificador intergênico/intragênico em células-tronco embrionárias de camundongo

Aqui, apresentamos um protocolo ATAC-seq rápido e simples a ser implementado em um verme inteiro de estágio L4 Caenorhabditis elegans usando apenas 30 μL de pellet de verme.

Perfil de Acessibilidade por Cromatina em Larvas Plenas de Caenorhabditis elegans L4

Aprenda o método ChIP-Seq para mapear reguladores da cromatina em embriões de Xenopus. Esta técnica permite analisar interações proteína-DNA e estados cromatínicos durante o desenvolvimento embrionário.

Snapshot Genome-wide de Reguladores da cromatina e Estados em

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