Name: Usando fluorescência celular ativado Classificando a Examine-Cell-tipo específico Expressão Gênica em Tissue cérebro de um rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a isolar tipos celulares neurais específicos de tecido cerebral usando FACS. Este método permite analisar expressão gênica, proteica e modificações epigenéticas de forma específica por tipo celular em neurociência.

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Os autores gostariam de agradecer a Lynn Opdenaker, do Centro de Pesquisa Translacional da Universidade de Delaware, do Centro de Câncer Helen F. Graham, pela assistência técnica, bem como a Nancy Martin, do Recurso Compartilhado de Citometria de Fluxo do Instituto do Câncer da Universidade Duke, e à Dra. Susan H. Smith, pela orientação em métodos e coleta de dados.

1. Preparação para Coleta de Tecidos (15 – 30 min)
<ol>
	<li>Polir três conjuntos de pipetas Pasteur de vidro em diâmetros decrescentes e numerá-los "1" = aproximadamente 1 mm de diâmetro, "2" = aproximadamente 0,75 mm de diâmetro e "3" = aproximadamente 0,50 mm de diâmetro.</li>
	<li>Ressuspenda a enzima A liofilizada com todo o tampão A de acordo com o protocolo fornecido com o Kit de Dissociação Neural (consulte a Tabela de Materiais). Não vórtice. Alíquota da solução em alíquotas de 50 μl e conservar a -20 ºC para utilização posterior.</li>
	<li>Faça 1 L de tampão de remoção de mielina e filtro a vácuo para esterilização [tampão de remoção de mielina = 1.000 ml de solução salina tamponada com fosfato 0,1 M (PBS), 2 ml de ácido etilenodiaminotetracético 500 mM (EDTA) e 10 g de albumina de soro bovino (BSA)].</li>
	<li>Corte a folha de malha de náilon em pequenos quadrados de 1 x 1 polegada (2,5 x 2,5 cm) que serão usados para filtrar detritos celulares e autoclave em um pequeno béquer coberto com papel alumínio.</li>
	<li>Prepare 1 L de tampão de lavagem [tampão de lavagem = 1.000 ml de 0,1 M PBS, 2 ml de 500 mM EDTA e 10 g de BSA].</li>
</ol>
2. Coleta de tecidos
<ol>
	<li>Ligue o banho-maria a 37 ºC.</li>
	<li>Prepare o tampão X do kit de dissociação neural adicionando beta-mercaptoetanol ao tampão X até uma concentração final de 0,067 mM (para 4 amostras, adicione 13,5 μl de beta-mercaptoetanol 50 mM a 10 ml de tampão X).</li>
	<li>Prepare a mistura enzimática 1 misturando 50 μl de enzima P com 1.900 μl de tampão X para cada amostra, conforme descrito no protocolo do kit de dissociação neural Por exemplo, para 4 amostras, misture 200 μl de enzima P com 7.600 μl de tampão X.</li>
	<li>Colocar o tampão X no banho-maria a 37 ºC.</li>
	<li>Coloque 2 ml de solução salina tamponada de Hank fria (HBSS) (sem Ca++ e Mg++) em um poço de uma placa de cultura estéril de 6 poços para cada amostra que será coletada e mantenha no gelo para dissecção do tecido.</li>
</ol>
3. Dissecção de tecido (45 min – 1 h)
<ol>
	<li>Injete o animal com o volume apropriado de solução de eutanásia (solução comercial de barbitúrico, por exemplo, Euthasol), de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC), e perfunda todo o sangue com solução salina fria a 0,9%.
	<ol>
		<li>Administre ratos com uma overdose de solução de eutanásia.</li>
		<li>Monitore a anestesia por meio da respiração e da pinça do dedo do pé. Quando o animal está suficientemente anestesiado (sem resposta ao beliscão do dedo do pé e respiração profunda e lenta), o rato pode ser perfundido.</li>
		<li>Para perfundir o rato, abra a cavidade torácica com uma tesoura resistente. Corte o diafragma para permitir o acesso até o coração. Corte as costelas ao longo de ambos os lados até o topo do peito, para permitir o acesso total ao coração. Nesse ponto, a caixa torácica pode ser mantida para o lado usando um par de hemostáticos.</li>
		<li>Realize a perfusão cardíaca inserindo uma agulha 18 G (para ratos adultos) conectada a uma bomba elétrica no ventrículo esquerdo do coração. A bomba está extraindo solução salina fria a 0,9%.</li>
		<li>Em seguida, abra o átrio direito com uma pequena tesoura para permitir que o sangue e o líquido perfusado sejam drenados do corpo.</li>
		<li>Perfundir ratos com aproximadamente 10 ml (para ratos adultos) de solução salina a 0,9% para remover todas as células e fatores imunológicos periféricos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dissecar a parte desejada da região do cérebro usando lâminas de barbear estéreis e dissecção apropriada, depois colocar os pedaços de tecido no HBSS frio sem Ca2+ e Mg2+. 
	NOTA: O protocolo requer HBSS sem Ca2+ e Mg2+ nas etapas iniciais do protocolo, pois esses íons podem interferir nas enzimas necessárias para a dissociação neural.</li>
	<li>Depois que todas as amostras de tecido forem coletadas, retorne à bancada limpa ou à capa de cultura estéril para processamento de tecidos.</li>
</ol>
4. Dissociação Neural (1 hora)
<ol>
	<li>Corte cada amostra de tecido em pedaços pequenos usando lâminas de barbear estéreis na tampa da placa de cultura de 6 poços. Este protocolo tem sido usado para amostras de tecido de aproximadamente 30 a 100 mg, mas é aprovado para amostras de tecido de até 400 mg. Para amostras de tecido maiores que 400 mg, os volumes de reagente devem ser aumentados adequadamente.</li>
	<li>Utilizar 1 ml de HBSS fresco sem Ca2+ e Mg2+ para transferir os pedaços de tecido em cubos com uma pipeta para um tubo de centrifugação estéril de 2 ml. Repita as etapas 4.1 e 4.2 para todas as amostras até que todas as amostras tenham sido transferidas para um tubo de centrífuga de 2 ml.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 300 x g durante 2 min a RT e aspirar o sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 1.900 μl de Mistura de Enzimas 1 quente, conforme preparado nas Etapas 2.2 e 2.3, a cada amostra e feche os tubos.</li>
	<li>Incubar as amostras por 15 min em banho-maria a 37 ºC, invertendo os tubos várias vezes a cada 5 min para ressuspender os pedaços de tecido sedimentados.</li>
	<li>Enquanto isso, prepare a mistura de enzimas 2 misturando 20 μl de tampão Y com 10 μl de enzima A descongelada (para 4 amostras, misture 80 μl de tampão Y com 40 μl de enzima A descongelada).</li>
	<li>Adicione 30 μl de Enzyme Mix 2 a cada amostra e inverta suavemente. Não vórtice.</li>
	<li>Dissocie cada amostra de tecido com a pipeta Pasteur "1", triturando para cima e para baixo 30 vezes.</li>
	<li>Incubar as amostras durante 15 min em banho-maria a 37 ºC; inverter os tubos várias vezes de 5 em 5 min para ressuspender os pedaços de tecido sedimentados.</li>
	<li>Dissocie cada amostra de tecido com a pipeta Pasteur "2", triturando para cima e para baixo 30 vezes. Evite gerar bolhas.</li>
	<li>Dissocie cada amostra de tecido com a pipeta Pasteur "3", triturando para cima e para baixo 30 vezes. Evite gerar bolhas.</li>
	<li>Incubar as amostras durante 10 min em banho-maria a 37 ºC; inverter os tubos várias vezes de 5 em 5 min para ressuspender as células sedimentadas.</li>
	<li>Aplique a suspensão de célula única a uma cepa de célula de 80 mícrons colocada em cima de um tubo de falcão de 15 ml para remover quaisquer pedaços grandes de detritos e lave o filtro e as células com 10 ml de HBSS (com Ca2+ e Mg2+) para interromper as reações enzimáticas. Repita até que cada amostra seja transferida para um tubo de falcão limpo de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 300 x g durante 10 min em RT e aspirar o sobrenadante.</li>
</ol>
5. Depleção de Mielina (45 min)
<ol>
	<li>Ressuspenda completamente o pellet de células com 400 μl de tampão de remoção de mielina.</li>
	<li>Adicione a quantidade especificada de grânulos de remoção de mielina e pipete para cima e para baixo para misturar bem. 
	NOTA: O volume de grânulos de remoção de mielina usados dependerá do tamanho do tecido, da idade do animal e da quantidade de mielina esperada nessa região específica do cérebro. por exemplo, para uma amostra de hipocampo de rato adulto (aproximadamente 300 mg), incube a amostra com 100 μl de esferas de remoção de mielina.
	
</li>
	<li>Incubar durante 15 min no frigorífico a 4 ºC.</li>
	<li>Lave cada amostra com 5 ml de tampão de remoção de mielina.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 300 x g durante 10 min a RT.</li>
	<li>Enquanto centrifuga as amostras, coloque 1 coluna para cada amostra no campo magnético do classificador magnético e coloque um filtro limpo de 80 mícrons no topo de cada coluna.</li>
	<li>Preparar as colunas e filtrar enxaguando cada coluna com 1 ml de tampão de remoção de mielina, 3 vezes (3 ml no total). Colete todo o fluxo em um recipiente de resíduos, como o fundo de uma caixa de basculação vazia.</li>
	<li>Posicionar o tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 ml directamente por baixo de cada coluna na preparação da colheita da amostra.</li>
	<li>Quando as células terminarem a centrifugação, aspire o sobrenadante e ressuspenda completamente em 500 μl de tampão de remoção de mielina. Aplique imediatamente a suspensão celular na coluna e colete as células no tubo abaixo.</li>
	<li>Lave o filtro e a coluna com 1 ml de tampão de remoção de mielina, 4 vezes (4 ml no total).</li>
	<li>Centrifugar a recolha de células a 300 x g durante 10 min à RT.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante e as células estão prontas para a coloração.</li>
</ol>
6. Coloração de células vivas para FACS (1 hora para coloração)
<ol>
	<li>Agite brevemente (2 seg) as células para separar o pellet e adicione imediatamente 5 μl de bloco Fc (anti-clusters de diferenciação 32, CD32), vórtice novamente e incube na geladeira a 4 ºC por 5 min.</li>
	<li>Enquanto isso, prepare a mistura de anticorpos primários adicionando os três anticorpos primários no tampão de lavagem da seguinte forma: 0,125 μl de anticorpo CD11b conjugado com aloficocianina (APC) (1:800), 1 μl de anticorpo anti-GLT1 (1:100) e 0,4 μl de isotiocianato de fluoresceína (FITC) – anticorpo Thy1 conjugado (1:250) para cada 100 μl de tampão de lavagem. Cada amostra receberá 100 μl de mistura de anticorpos primários para incubação; no entanto, se sua amostra for muito maior que 400 mg de tecido, você pode considerar aumentar o volume de sua mistura de anticorpos primários de acordo</li>
	<li>Prepare os tubos para controles de coloração única removendo apenas 2 μl de células de cada tubo de amostra e adicionando-o a cada tubo de controle de coloração único. Os controles de "coloração única" incluem: apenas APC-CD11b, apenas GLT1, apenas FITC-Thy1, apenas anticorpo secundário PE e o controle "em branco" ou não corado. 
	NOTA: Todas as amostras devem ser representadas em todos os controles de coloração, portanto, 2 μl de células de cada amostra devem ser adicionados a cada tubo de controle de coloração.</li>
	<li>Vortex breve dos tubos (2 segundos) e adicione 100 μl de mistura de anticorpos primários a cada tubo de amostra e 100 μl de anticorpo primário apropriado a cada tubo de controle de coloração, vórtice os tubos novamente, cubra os tubos com papel alumínio para proteger os anticorpos fluorescentes de qualquer luz e incube os tubos na geladeira a 4 ºC por 20 min. As amostras devem ser mantidas frescas (a 4 ºC) durante o resto do procedimento, a fim de manter a integridade das amostras e dos anticorpos.</li>
	<li>Agite brevemente os tubos e adicione 2 ml de tampão de lavagem a cada tubo.</li>
	<li>Tubos de centrífuga a 350 x g durante 5 min a 4 ºC.</li>
	<li>Enquanto isso, prepare a mistura de anticorpos secundários adicionando 0,2 μl de anticorpo secundário anti-coelho conjugado com PE para cada 100 μl de tampão de lavagem. Cada amostra receberá 100 μl de mistura de anticorpos secundários; No entanto, se sua amostra for muito maior que 400 mg de tecido, você pode considerar aumentar o volume de sua mistura de anticorpos primários de acordo.</li>
	<li>Quando a centrifugação estiver concluída, despeje o sobrenadante de cada amostra na pia e seque os tubos de cabeça para baixo em uma toalha de papel.</li>
	<li>Vortex brevemente os tubos e adicione 100 μl de mistura de anticorpos secundários a cada tubo de amostra e o anticorpo secundário apropriado a cada controle de coloração, vórtice os tubos novamente, cubra os tubos com papel alumínio e incube os tubos na geladeira a 4 ºC por 15 min. 
	NOTA: O tubo de controle de coloração somente GLT1 deve receber a mistura de anticorpos secundários.
	
</li>
	<li>Após a incubação, vórtice breve os tubos e adicione 2 ml de tampão de lavagem a cada tubo.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 350 x g durante 5 min a 4 ºC.</li>
	<li>Quando a centrifugação estiver concluída, despeje o sobrenadante de cada amostra na pia e seque os tubos de cabeça para baixo em uma toalha de papel.</li>
	<li>Vortex os tubos e adicione 0,25 ml de PBS estéril a cada tubo. As amostras estão prontas para classificação. 
	NOTA: Mais células podem exigir 0,5 ml de PBS estéril; No entanto, é melhor começar com um volume menor, pois a amostra sempre pode ser diluída se estiver muito concentrada com células. 
	NOTA: Opcionalmente, adicione DNase ao tubo para evitar a aglomeração das células e, portanto, o entupimento do classificador. As amostras também podem ser filtradas usando um filtro estéril de 80 mícrons antes da classificação, a fim de evitar o entupimento do classificador.
	
</li>
	<li>Leve as células para o classificador no gelo. Coletar as populações de células em tubos de centrífuga sem nuclease de 2 ml com 0,5 ml de PBS estéril em cada tubo.</li>
	<li>Após a classificação, gire as células a 300 x g por 2 min a 4 ºC. Aspire a maior parte do PBS e congele rapidamente as células no freezer a -80 ºC até processamento adicional para extração de RNA (consulte 1 para mais detalhes do protocolo), extração de DNA (consulte 2 para mais detalhes do protocolo) ou lise celular para análise de proteínas.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Semelhante a muitos outros tecidos e sistemas, o cérebro é composto por uma população de células heterogêneas que funcionam juntas para impactar o comportamento. A análise da expressão gênica, expressão de proteínas ou modificações epigenéticas de células individuais dentro dessa população heterogênea tem o potencial de revelar informações sobre a função do sistema como um todo, identificar processos celulares que regulam o comportamento normal e os processos de doenças e fornecer alvos específicos do tipo de célula para...

O objetivo do protocolo descrito abaixo é isolar tipos de células individuais de uma população heterogênea de tecido neural para a análise subsequente da expressão gênica específica do tipo de célula, expressão de proteínas ou mesmo marcadores epigenéticos. O cérebro é composto por muitos tipos de células derivadas de células progenitoras distintas e que possuem propriedades e funções específicas do tipo de célula. Apesar dessas diferenças, esses tipos distintos de células neurais podem expressar receptores semelhantes e moléculas de sinalização intracelular que dificultam a análise dessas proteínas mais onipresentes de medir ou interpretar de maneira específica do tipo de célula usando métodos convencionais. Os neurocientistas devem identificar a função e a ativação desses tipos distintos de células no cérebro e como elas podem afetar individualmente o comportamento, pois esse será o primeiro passo para identificar medicamentos e alvos terapêuticos mais específicos para doenças neurológicas e neuropsiquiátricas. Apesar desse objetivo abrangente da pesquisa em neurociência, pode ser difícil isolar tipos individuais de células neurais do cérebro para a análise da expressão gênica ou proteica, a ativação de moléculas de sinalização ou a modificação de marcadores epigenéticos no DNA. Das técnicas usadas atualmente, a imuno-histoquímica pode identificar a expressão de proteínas de maneira específica do tipo de célula quando combinada com a coloração adicional de um marcador específico do tipo de célula, embora isso dependa de anticorpos específicos que podem corar adequadamente para as proteínas de interesse e pode ser difícil de quantificar. A hibridização in situ pode identificar a localização específica do ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) em células individuais no cérebro, mas este é um processo trabalhoso que também limita a co-análise de tipos específicos de células e permite apenas a análise de um ou talvez alguns genes de interesse. A microdissecção por captura a laser usa um laser para isolar subpopulações de células que são visualizadas por microscopia; no entanto, a natureza demorada desse processo e o rendimento relativamente baixo podem limitar significativamente a análise subsequente de proteínas ou níveis de mRNA, principalmente se a expressão dessas moléculas for baixa para começar. A classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) é uma técnica relativamente nova no campo da neurociência para isolar tipos de células individuais do cérebro para análise subsequente da expressão gênica1 e / ou alvos epigenéticos2. Esse processo também pode ser usado para classificar tipos específicos de células neurais para análise subsequente da expressão gênica específica do tipo de célula, expressão de proteínas ou marcadores epigenéticos. O FACS tem sido usado em vários campos de pesquisa médica, como câncer e imunologia, há décadas para contar e classificar diferentes células com base em características físicas ou bioquímicas3. Além disso, a citometria de fluxo tem sido classicamente usada para analisar a expressão de proteínas por célula, usando anticorpos específicos. O procedimento descrito abaixo aproveita as técnicas clássicas de citometria de fluxo para isolar tipos de células individuais para análise subsequente de endpoints de biologia molecular. O citômetro de fluxo pode analisar vários milhares de células em um segundo, o que o torna uma alternativa rápida e eficiente às técnicas descritas acima. Além disso, as células podem ser isoladas com base na expressão celular de uma proteína específica (por exemplo, um receptor de neurotransmissor) ou uma combinação de duas ou mais proteínas (colocalização de várias proteínas em um tipo de célula específico). Isso permite que o usuário isole tipos de células neurais muito seletivas com base em suas propriedades moleculares para identificar sua função no cérebro.
Para realizar o FACS, as células neurais são preparadas em uma suspensão de célula única que é passada através de uma célula de fluxo que transporta e alinha as células para que elas passem em fila única por um feixe de luz e lasers para análise. Um computador adquire os dados de cada célula e os plota em um histograma para análise de parâmetros especificados (tamanho, granularidade e fluorescência). Com base nesses parâmetros, as células podem ser imediatamente classificadas em tubos separados para sua coleta e análise subsequente de qualquer ponto final desejado. O protocolo descrito abaixo utiliza três anticorpos para classificar neurônios (usando um antígeno timócito 1, anticorpo Thy1), astrócitos (usando um transportador de glutamato glial, anticorpo GLT1) e microglia (usando um cluster de molécula de diferenciação 11B, anticorpo CD11b). Este protocolo pode ser usado conforme descrito abaixo ou modificado com diferentes anticorpos, dependendo do tipo de célula que se deseja isolar para seus próprios experimentos.
Existem algumas ressalvas a serem consideradas ao determinar se este protocolo é apropriado para experimentos específicos. Uma ressalva importante pode dizer respeito ao tipo específico de célula que se gostaria de isolar. Neste protocolo, os três anticorpos utilizados são anticorpos extracelulares, que permitem ao experimentador manter os tipos de células intactos durante o procedimento de coloração, preservando assim a integridade do RNA, DNA e proteínas em seu interior. É possível que alguém deseje isolar um tipo específico de célula neural usando um anticorpo que identifica uma proteína que é expressa apenas dentro dessa célula específica. Por exemplo, pode-se querer isolar neurônios dopaminérgicos usando um anticorpo para tirosina hidroxilase ou isolar neurônios acetilcolina usando um anticorpo para colina acetiltransferase. Essas proteínas são intracelulares e, portanto, exigiriam fixação e permeabilização da membrana celular para posterior coloração com os anticorpos apropriados. Embora isso tenha sido feito antes de 4,5, esse processo pode diminuir significativamente o rendimento de RNA ou DNA dessas células permeabilizadas. Outra ressalva pode ser que nem todos os anticorpos são apropriados para FACS. Por exemplo, pode-se usar atualmente um anticorpo que funciona muito bem para western blot, uma técnica que requer a desnaturação de proteínas. Este anticorpo pode não ser necessariamente adequado para a identificação desses tipos de células usando FACS, uma vez que as proteínas não são desnaturadas em nenhum ponto deste protocolo e, portanto, o anticorpo pode não ter como se ligar ao seu antígeno inerente. As empresas fornecem folhas de especificações que identificam as aplicações para as quais um anticorpo foi aprovado. Se um anticorpo não foi aprovado para citometria de fluxo, isso não deve desencorajar alguém de tentar este protocolo com um anticorpo específico; no entanto, deve-se estar ciente de que não é garantido que funcione para FACS. Uma terceira ressalva deste protocolo tem a ver com o número de células que se está tentando isolar. O FACS é uma excelente técnica para produzir o maior número possível de células até mesmo de um pequeno pedaço de tecido, mas também é possível que, se alguém quiser isolar uma população relativamente esparsa de células de uma região cerebral relativamente pequena, o rendimento de um animal seja inerentemente baixo. Neste caso, pode ser necessário agrupar o tecido cerebral de alguns animais do mesmo grupo de tratamento, a fim de obter o número de células necessárias para a análise subsequente; no entanto, uma publicação recente usou a pré-amplificação de cDNA direcionada a genes para análise subsequente da expressão gênica de um pequeno número de neurônios ativados (5-6%) de um conjunto maior de neurônios classificados, indicando que é possível analisar a expressão gênica até mesmo de pequenos subconjuntos de células neurais sem agrupar um grande número de animais6Uma ressalva final dessa técnica é que se deve ter acesso a um classificador de células que não esteja muito longe. O classificador de células é uma máquina complicada que requer treinamento significativo para usá-la corretamente. Assim, essas máquinas geralmente são operadas por um técnico qualificado em uma instalação central. Além disso, o objetivo desse procedimento é dissociar o tecido neural, corá-lo para anticorpos específicos e levar imediatamente essas amostras a um classificador em um curto período de tempo (talvez meio dia). Esse período ajudará a aumentar a sobrevivência e o rendimento das células isoladas e a manter a integridade das células para processamento e análise subsequentes. Se todos esses parâmetros descritos acima forem atendidos, o FACS é um excelente método para analisar a expressão específica do tipo celular de genes e proteínas do tecido neural.
Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Delaware e o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

<table><tbody><tr><td>Kit de Dissociação Neural (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>Grânulos de Remoção de Mielina II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-733</td><td></td></tr><tr><td>Colunas LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Separador QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Folha de malha de nylon</td><td>Amazon</td><td>CMN-0074-10YD</td><td>40 polegadas de largura, malha de tamanho de 80 mícrons</td></tr><tr><td>Bloco Fc / anti-CD32</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BDB550270 reatividade para</td></tr><tr><td>anticorpo CD11b conjugado com APC de</td> rato <td>Biolegend</td><td></td><td>201809 reatividade para rato</td></tr><tr><td>Coelho anti-GLT1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-20136</td><td>reatividade para rato ou</td></tr><tr><td>anti-coelho conjugado com PE humano anticorpo secundário</td><td>eBioscience</td><td>1037259</td><td>anticorpo secundário anti-GLT1</td></tr><tr><td>conjugado com FITC anticorpo de camundongo CD90 (Thy1) de camundongo</td><td>Biolegend</td><td></td><td>reatividade 202504 para ratos</td></tr></tbody></table>

usando fluorescência celular ativado classificando a examine-cell-tipo específico expressão gênica em tissue cérebro de um rato

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

O cérebro é composta de quatro tipos de células primárias, incluindo neurónios, astrócitos, microglia e oligodendrócitos. Embora eles não são o tipo celular mais abundante no cérebro, os neurônios são as mais amplamente estudado estes tipos de células, dado o seu papel directo na impactando comportamentos. Outros tipos de células no cérebro também influenciam o comportamento e função neuronal através das moléculas de sinalização que produzem. Os neurocientistas devem entender as interações entre os tipos de células no cérebro para entender melhor como essas interações impactar função neural ea doença. Até à data, o método mais comum de analisar a expressão de proteínas ou genes utiliza a homogeneização de amostras de tecido inteiro, geralmente com sangue, e sem ter em conta para o tipo de célula. Esta abordagem é uma abordagem informativa para examinar mudanças gerais no gene ou expressão de proteínas que podem influenciar a função e comportamento neural; no entanto, este método de análise não se presta a uma maior compreensão da célula-tipo-expressão do gene específico e do efeito da comunicação célula-a-célula em função neural. Análise da epigenética comportamentais tem sido uma área de foco em crescimento, que examina como modificações do ácido desoxirribonucléico (DNA) a expressão do gene longo prazo impacto estrutura e comportamento; No entanto, estas informações só podem ser relevantes se analisado de uma maneira específica do tipo de células-determinado da linhagem diferencial e assim epigenética marcadores que podem estar presentes em determinados genes de tipos de células neuronais individuais. A fluorescência de células activadas (FACS) técnica descrita a seguir proporciona um modo simples e eficaz para isolar células individuais neural para a análise posterior da expressão de genes, a expressão da proteína, ou modificações de ADN epigenética. Esta técnica também pode ser modificada para isolar tipos de células neurais mais específicos no cérebro para análise de células específicas do tipo subsequente.

A Importância da Depleção de Mielina e da Perfusão Tecidual
Figura 1 ilustra a importância da remoção da mielina. A depleção da mielina (Etapas 5.1 a 5.12 do protocolo acima) ocorre quando a suspensão de células únicas é incubada com as microesferas de remoção de mielina, lavada e posteriormente passada pela coluna no separador magnético. O objetivo dessas etapas é reduzir a quantidade de detritos celulares presentes em cada amostra. À medida que os neurônios são dissociados e...

O objetivo deste protocolo é usar a técnica de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) para classificar tipos específicos de células neurais para análise subsequente da expressão gênica específica do tipo de célula, marcadores epigenéticos e/ou expressão de proteínas.

Usando fluorescência celular ativado Classificando a Examine-Cell-tipo específico Expressão Gênica em Tissue cérebro de um rato

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar tipos celulares neurais individuais a partir de tecido cerebral para análises subsequentes. Isso é realizado primeiramente dissociando o tecido neural em uma suspensão de células simples. Na segunda etapa, a mielina é removida da suspensão e, em seguida, as células são marcadas com anticorpos específicos para o tipo celular.No passo final, as populações individuais de células são separadas por citometria de fluxo. Em última análise, este método de isolamento específico por tipo celular permitirá aos usuários analisar alterações na expressão gênica ou proteica ou modificações epigenéticas de maneira específica a cada tipo celular. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da neurociência, como quais tipos celulares expressam certos receptores, quais expressam certas proteínas e quais expressam certas modificações epigenéticas, de modo que possamos compreender melhor os mecanismos específicos a cada tipo celular no cérebro.Inicie a dissociação neural utilizando lâminas de barbear estéreis para cortar cada amostra obtida de tecidos cerebrais adultos em pequenos fragmentos de 30 a 400 miligramas sobre a tampa de uma placa de cultura de seis poços. Em seguida, imerja o tecido em um mililitro de HBSS livre de cálcio e magnésio e use uma pipeta para transferir as amostras para tubos cônico-rotativos estéreis de dois mililitros quando todos os tecidos tiverem sido coletados. Centrifugue as amostras e aspire os sobrenadantes.Adicione 1.900 microlitros da enzima morna. Misture uma vez e incube as amostras por 15 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius, invertendo o tubo várias vezes a cada cinco minutos para ressuspender os fragmentos de tecido sedimentados.Após o término da incubação, adicione 30 microlitros de enzima recém-preparada. Misture dois a cada amostra e inverta suavemente os tubos. Em seguida, utilizando uma pipeta de pistão identificada como um, dissocie cada amostra com 30 movimentos para cima e para baixo.Tendo o cuidado de evitar a formação de bolhas. Incube as amostras por mais 15 minutos a 37 graus Celsius com inversão a cada cinco minutos, seguido pela dissociação das amostras com pipeta de vidro. Número dois, conforme acabou de ser demonstrado.Em seguida, mude para a pipeta número três, repita a dissociação e incube as amostras por mais 10 minutos. No banho-maria, inverta a cada cinco minutos e, ao final da incubação, filtre as suspensões de células isoladas através de filtros celulares de 80 mícrons para tubos Falcon de 15 mililitros. Lave cada filtro com 10 mililitros de HBSS sem cálcio e sem magnésio para interromper as reações enzimáticas após a filtração da última amostra, centrifugue os tubos e remova os sobrenadantes para esgotar a mielina da célula.As suspensões ressuspendem completamente os pellets em 400 microlitros de tampão de remoção de mielina e adicionam a quantidade apropriada de microesferas de remoção de mielina a cada tubo. Pipetar as soluções para cima e para baixo até que as células e microesferas sejam completamente misturadas. Em seguida, incubar a amostra a quatro graus Celsius por 15 minutos.Após a incubação, lave cada amostra com cinco mililitros de tampão de remoção de mielina enquanto as células estão em centrifugação, coloque uma coluna para cada amostra no campo magnético de um separador magnético e posicione um filtro limpo de 80 micrômetros sobre cada coluna. Enxágue cada filtro e coluna três vezes com um mililitro de tampão de remoção de mielina, coletando todo o fluxo passante em um recipiente de resíduos. Após o último enxágue, posicione tubos redondos de poliestireno de cinco mililitros diretamente sob cada coluna para coletar o eluato.Em seguida, aspire o sobrenadante das amostras e reconstitua os pellets em 500 microlitros de tampão de remoção de mielina. Aplique imediatamente as suspensões celulares nas colunas, coletando as células nos tubos abaixo. Em seguida, lave cada filtro e coluna quatro vezes com um mililitro de tampão de remoção de mielina por lavagem.Após a última lavagem, centrifugue as células e aspire os sobrenadantes para corar as células para separação por citometria de fluxo. Vortexe cada amostra por cerca de dois segundos para dissociar os pellets e transfira um microlitro de células de cada tubo para tubos individuais. Para os controles de coloração, adicione imediatamente cinco microlitros de bloqueador FC a cada tubo, incluindo os controles de coloração.Em seguida, agite as amostras novamente e incube-as a quatro graus Celsius. Após cinco minutos, adicione 100 microlitros do coquetel apropriado de anticorpos primários. Cubra os tubos para proteger os anticorpos da luz e incube as células a quatro graus Celsius por 20 minutos.No final da incubação, lave as amostras com dois mililitros de tampão de lavagem, em seguida aspire os sobrenatantes e marque cada amostra com 100 microlitros do anticorpo secundário apropriado. Tampe os tubos e coloque-os a quatro graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, lave as amostras com dois mililitros de tampão de lavagem, centrifugue as amostras e depois aspire o sobrenatante.Supernatantes Resus, suspenda os pellets em 250 microlitros de PBS estéril e separe as células; aqui são mostradas populações representativas de células neurais separadas por citometria de fluxo a partir de um único hipocampo masculino. As células foram selecionadas inicialmente entre todos os eventos possíveis com base em suas propriedades de dispersão para frente e dispersão lateral. Em seguida, as células únicas, ou singletes, foram selecionadas a partir de dupletas ou agregados maiores de células com base em seu tamanho, para permitir o fracionamento preciso dos tipos celulares individuais. As células únicas foram então separadas em populações positivas para CD11B e negativas para CD11B, com separação adicional das células negativas para CD11B em células positivas para GT1 e TH1. O programa de análise foi então utilizado para determinar o número total de eventos em cada população, bem como a porcentagem em relação às populações parentais, a fim de confirmar a pureza das células fracionadas.Neste exemplo específico, a expressão gênica relativa de genes específicos de tipos celulares alternativos foi analisada por PCR em tempo real. Como esperado, esses dados confirmaram a pureza das células classificadas, além de identificar algumas diferenças interessantes entre as regiões cerebrais investigadas. Após a confirmação da purez da separação, a expressão de outros genes de interesse pode ser medida para determinar o tipo celular específico no qual são expressos, ou se sua expressão é alterada após tratamento de maneira específica ao tipo celular.Por exemplo, aqui foi investigada a expressão de cow binding, uma proteína ligadora de cálcio frequentemente utilizada para identificar neurônios no hipocampo e no cerebelo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar tipos celulares neurais específicos de interesse, como a célula neural mostrada aqui, utilizando anticorpos apropriados contra antígenos de superfície celular.

using-fluorescence-activated-cell-sorting-to-examine-cell-type

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra um método para isolar neurônios marcados com fluorescência do cérebro de um camundongo.

Isolando neurônios marcados com fluorescência de um cérebro murino

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar e classificar núcleos de tecido cerebral humano recém-congelado usando classificação de núcleos ativados por fluorescência (FANS), que permite o estudo de diferentes populações de células para várias aplicações neurológicas.

Isolando populações de células do tecido cerebral usando classificação de núcleos ativados por fluorescência

Este vídeo demonstra um protocolo para isolar células do hipocampo de ratos, incluindo neurônios, astrócitos e microglia.

Obtenção de várias populações de células neurais de um hipocampo de rato

Este vídeo demonstra a dissociação do tecido cerebral de rato congelado em uma suspensão unicelular usando digestão enzimática e trituração mecânica. As células preparadas são fixadas e permeabilizadas com etanol para aplicações a jusante, como citometria de fluxo ou análise de expressão gênica.

Obtenção de uma suspensão unicelular de tecido cerebral de rato congelado

Source: Kimmelmann-Shultz, B., et. al. Usando fluorescência de infravermelho próximo e varredura de alta resolução para medir a expressão de proteínas no cérebro de roedores. J. Vis. Exp. (2019) Este vídeo demonstra uma fluorescência de infravermelho próximo e um método de varredura de alta resolução para medir a expressão de proteínas no cérebro do roedor.

Medindo a expressão de proteínas no cérebro de roedores usando fluorescência de infravermelho próximo e varredura de alta resolução 

Gene análise de um subconjunto de células num tecido específico de expressão representa um grande desafio. Este artigo descreve como isolar RNA total de alta qualidade a partir de uma população de células específicas, combinando um método rápido imunomarcação com captura a laser microdissection.

Isolamento de RNA celular subpopulações específicas Utilizando captura de Laser Microdissection combinada com o rápido immunolabeling

Relatamos um método baseado em Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS) para isolar células-tronco neurais (NSCs) e sua progênie da zona subventricular (SVZ) do cérebro de camundongos adultos. Aplicado a camundongos transgênicos Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI), permite o estudo da progressão do ciclo celular por imagens ao vivo.

Seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular Zone e Live-imagem de seus Dynamics com o ciclo celular

Aqui apresentamos um protocolo de fluorescência de células activadas (FACS) para estudar alterações moleculares em Fos-expressando conjuntos neuronais a partir de tecido cerebral fresco e congelado. O uso de tecido congelado permite o isolamento FACS de muitas áreas do cérebro mais várias sessões para maximizar o uso de indivíduos animais valiosos.

Fluorescência de células activadas (FACS) e Gene Análise da expressão de Fos-expressando neurônios de fresco e congelado cérebro de um rato Tissue

Aqui, nós apresentamos um protocolo que use tinturas near-infrared conjuntamente com a exploração immunohistochemistry e de alta resolução às proteínas do ensaio em regiões do cérebro.

Usando a fluorescência near-infrared e a exploração de alta resolução para medir a expressão da proteína no cérebro do roedor

Fluorescência-Ativada Célula-Radioliging tecido tratado (FACS-RTT) é uma ferramenta poderosa para estudar o papel da proteína translocador de 18 kDa ou expressão de receptor de serotonina 5HT2A na doença de Alzheimer em escala celular. Este protocolo descreve a aplicação ex-vivo do FACS-RTT no modelo de rato TgF344-AD.

Fluorescência-Ativada Célula Desarmamento-Radiolige Tecido Tratado (FACS-RTT) para determinar a origem celular do sinal radioativo

Apresentado aqui é um método para sequenciar núcleos únicos isolados do giro dentado do rato que exclui a maioria dos neurônios através da classificação de núcleos ativados por fluorescência (FAN). Essa abordagem gera perfis de expressão de alta qualidade e facilita o estudo da maioria dos outros tipos de células representadas no nicho, incluindo populações escassas, como células-tronco neurais.

Classificação negativa de neurônios por núcleos ativados por fluorescência combinada com sequenciamento de RNA de núcleos únicos para estudar o nicho neurogênico do hipocampo

Aprenda a isolar tipos celulares neurais específicos de tecido cerebral usando FACS. Este método permite analisar expressão gênica, proteica e modificações epigenéticas de forma específica por tipo celular em neurociência.

Usando fluorescência celular ativado Classificando a Examine-Cell-tipo específico Expressão Gênica em Tissue cérebro de um rato

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