Usando fluorescência celular ativado Classificando a Examine-Cell-tipo específico Expressão Gênica em Tissue cérebro de um rato

O objetivo geral deste procedimento é isolar tipos individuais de células neurais do tecido cerebral para análise subsequente. Isso é feito primeiro dissociando o tecido neural em uma única suspensão celular. Na segunda etapa, a mielina é removida da suspensão e, em seguida, as células são coradas para anticorpos específicos do tipo de célula.

Na etapa final, as populações de células individuais são classificadas por citometria de fluxo. Em última análise, este método de isolamento específico do tipo de célula permitirá que os usuários testem mudanças na expressão gênica ou proteica ou modificações epigenéticas de maneira específica do tipo de célula. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como quais tipos de células expressam certos receptores, quais expressam certas proteínas e quais expressam certas modificações epigenéticas para que possamos entender melhor os mecanismos específicos do tipo de célula no cérebro.

Comece a dissociação neural usando lâminas de barbear estéreis para cortar cada amostra colhida de tecidos cerebrais adultos em pequenos pedaços de 30 a 400 miligramas na tampa de uma placa de cultura de seis poços. Em seguida, mergulhe o tecido em um mililitro de HBSS livre de cálcio e magnésio e use uma pipeta para transferir as amostras para tubos de centrífuga estéreis de dois mililitros quando todos os tecidos tiverem sido coletados. Centrifugar as amostras e aspirar os sobrenadantes.

Adicione 1.900 microlitros de enzima quente. Misture um e incube as amostras por 15 minutos. Em banho-maria a 37 graus Celsius, invertendo o tubo várias vezes a cada cinco minutos para ressuspender os pedaços de tecido assentados.

No final da incubação, adicione 30 microlitros de enzima recém-preparada. Misture dois em cada amostra e inverta suavemente os tubos. Em seguida, usando uma pipeta de pragas rotulada como uma, dissocie cada amostra com 30 iterações para cima e para baixo.

Tomando cuidado para evitar a geração de bolhas. Incubar as amostras por mais 15 minutos a 37 graus Celsius com inversão a cada cinco minutos, seguida de dissociação das amostras com pipeta de pragas. Número dois, como acabamos de demonstrar.

Em seguida, mude para a pipeta número três, repita a dissociação e incube as amostras por mais 10 minutos. No banho-maria com inversão a cada cinco minutos no final da incubação, filtre as suspensões unicelulares através de filtros de células de 80 mícrons em tubos Falcon de 15 mililitros. Lavando cada filtro com 10 mililitros de HBSS livre de cálcio e magnésio para interromper as reações enzimáticas quando a última amostra foi filtrada, gire os tubos e aspire os sobrenadantes para esgotar a mielina da célula.

As suspensões ressuspendem completamente os pellets em 400 microlitros de tampão de remoção de mielina e adicionam a quantidade apropriada de grânulos de remoção de mielina a cada tubo. Pipete as soluções para cima e para baixo até que as células e os grânulos estejam bem misturados. Em seguida, incubar a amostra a quatro graus Celsius por 15 minutos.

Após a incubação, lave cada amostra em cinco mililitros de tampão de remoção de mielina enquanto as células estão girando, coloque uma coluna para cada amostra no campo magnético de um classificador magnético e coloque um filtro limpo de 80 mícrons no topo de cada coluna. Enxágue cada filtro e coluna com um mililitro de tampão de remoção de mielina três vezes, coletando todo o fluxo em um recipiente de resíduos. Após o enxágue final, coloque cinco tubos de fundo redondos de poliestireno de mililitro diretamente abaixo de cada coluna para coletar o eluído.

Em seguida, aspire o super nomeado das amostras e ressuspenda os pellets em 500 microlitros de tampão de remoção de mielina. Aplique imediatamente as suspensões de células nas colunas, coletando as células nos tubos abaixo. Em seguida, enxágue cada filtro e coluna quatro vezes com um mililitro de remoção de mielina, tampão por lavagem.

Após a última lavagem, girar as células e aspirar os sobrenadantes para corá-las para classificação por citometria de fluxo. Vortex cada amostra por cerca de dois segundos para dissociar os pellets e transferir um microlitro de células de cada tubo para tubos individuais. Para os controles de coloração, adicione imediatamente cinco microlitros de bloco FC a cada tubo, incluindo os controles de coloração.

Em seguida, vortex as amostras novamente e incube-as a quatro graus Celsius. Após cinco minutos, adicione 100 microlitros do coquetel de anticorpos primários apropriado. Cubra os tubos para proteger os anticorpos da luz e incube as células a quatro graus Celsius por 20 minutos.

No final da incubação, lave as amostras em dois mililitros de tampão de lavagem, aspire os sobrenadantes e rotule cada amostra com 100 microlitros do anticorpo secundário apropriado. Cubra os tubos e coloque-os a quatro graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, lave as amostras em dois mililitros de tampão de lavagem, centrifugue as amostras e aspire.

Sobrenadantes Resus, suspenda os pellets em 250 microlitros de PBS estéril e classifique as células aqui populações classificadas por fluxo representativo de células neurais de um único hipocampo masculino são mostradas as células foram fechadas primeiro de todos os eventos possíveis com base em suas propriedades de dispersão para frente e para o lado. Em seguida, as células individuais ou singlets foram fechadas a partir de quaisquer dupletos ou aglomerados maiores de células com base em seu tamanho para permitir a classificação precisa dos tipos de células individuais, as células individuais foram então classificadas em populações de células CD 11, B positivas e CD 11 B negativas com classificação adicional das células CD 11 B negativas em células GT um e TH um positivo. O programa de análise foi então usado para determinar o número total de eventos em cada população, bem como a porcentagem das populações parentais para confirmar a pureza das células classificadas.

Neste exemplo específico, a expressão gênica relativa de genes específicos de tipos de células alternativas foi analisada por PCR em tempo real. Como esperado, esses dados confirmaram a pureza das células classificadas, bem como identificaram algumas diferenças interessantes entre as regiões cerebrais investigadas. Após a confirmação da pureza do tipo, a expressão de outros genes de interesse pode ser medida para determinar o tipo específico de célula em que são expressos ou se sua expressão é alterada após o tratamento de maneira específica do tipo de célula.

Por exemplo, aqui a expressão da ligação de vaca, uma proteína de ligação ao cálcio frequentemente usada para identificar neurônios no hipocampo e no cerebelo, foi investigada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar tipos específicos de células neurais de interesse, como a célula neural mostrada aqui usando anticorpos de superfície celular apropriados.