Name: Th17 Inflamação Modelo de orofaringe Candidíase em imunodeficientes Mice (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprenda a desenvolver um modelo de inflamação oral mediada por células Th17 em camundongos imunodeficientes infectados por Candida albicans. Este método permite estudar imunopatologia e avaliar terapias orais.

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Agradecemos à Dra. Helene Bernstein por nos fornecer acesso ao seu citômetro de fluxo. Também agradecemos à instalação de citometria de fluxo do CFAR pelos serviços de citometria de fluxo. Este projeto foi em parte apoiado pelo financiamento de utilização do núcleo do CTSC e pela concessão da corporação STERIS / Divisão de Hospitais Universitários de Doenças Infecciosas para PP.

NOTA: Os experimentos com ratos foram realizados de acordo com o animal institucional comitê de bem-estar (IACUC) orientações. 1. Reconstituição da Rag-1 - / - Os ratos com células I n Vitro Cultivadas Th17 (três dias antes da infecção) <ol><li> Para o estabelecimento de células Th17, cultura de células CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25- células T ingénuas (3 x 104) de fundo em U em placas de 96 poços, sozinho ou co-cultura eles, juntamente com 3 x 104 células T CD4 + CD25 + Foxp3 + Tregs na presença de solúvel α-CD3 (1 ug / ml), α-CD28 (2 ng / ml) de anticorpos e células apresentadoras de antigénio, sob condições Th17 (polarizadas usando IL-6 (25 ng / mL), TGF-β (2 ng / ml) , α-IFN-γ (2 ug / ml) e α -IL-4 (2 ng / ml)) durante três a quatro dias. NOTA: células ingênuo e regs T foram classificados usando fluorescência de células activadas (FACS) umad procedimentos de isolamento de células magnético e cultivadas como descrito anteriormente 19-22. </li><li> No dia 4, depois de re-suspender as células Th17, utilizando a pipeta, recolher-los a partir de culturas, e centrifugar-las em condições estéreis. <ol><li> Tomar uma pequena alíquota destas células para examinar a sua viabilidade e para fenotipagem. Ressuspender-los em 500 ul de meio RPMI, adicionar iodeto de propídio (200 ng / ml) e avaliar a sua viabilidade imediatamente por citometria de fluxo. Execute fenotipagem por citometria de fluxo avaliação da produção de IL-17A após restimulação (ver secção 6.3). </li></ol></li><li> Centrifugar e lavar o grosso das células em PBS estéril a 480 xg durante 6 minutos a 4 ° C em todas as etapas, a menos que especificado de outra forma. </li><li> Use essas células para transferência adotiva em 6-8 semanas de idade CD45.2 RAG1 - / - ratos imunodeficientes. <ol><li> Ressuspender as células a 1 x 10 7 células / ml de densidade celular utilizando PBS estéril frio. </li><li> Injectar 100 ul de células por intraperitoneal injecção, utilizando agulhas 25 G em seringas de 1 ml de tuberculina, de tal modo que um ratinho receber 1 x 10 6 células. Alguns ratos receberão células Th17 PBS ou somente, e outros ratos receberão células Th17 que foram co-cultivados com células Treg. Observação: executar todos os passos de forma asséptica. </li></ol></li></ol> 2. Crescer C. albicans para a infecção (um dia antes da infecção) <ol><li> Antes da inoculação, dispersar cinco colônias do CAF2-1 C. albicans estirpe laboratorial em 100 ul de suspensão de PBS estéril e adicionar a suspensão ao caldo estéril. </li><li> Inocular 5 colônias de C. albicans em 50 ml de base de azoto de levedura (YNB sem aminoácidos) / peptona / meio de caldo de dextrose e incubar numa incubadora com agitação a 30 ° C durante 15-18 horas a 130 rpm. </li><li> Monitorar o caldo para a opacidade, uma vez que é uma indicação para o crescimento do fungo. </li></ol> 3. CandidaColheita e Counting Procedimento (No dia da infecção) <ol><li> Recolha de 10 ml de caldo de Candida em tubos de 15 ml. Para volumes maiores, coletar Candida em tubos de 50 ml. </li><li> Centrifugar os blastosporos a 1900 xg durante 5 min à temperatura ambiente em todas as etapas, a menos que especificado de outra forma. Agregar as blastosporos por centrifugação, seguida pela remoção do sobrenadante. </li><li> Se houver mais do que um tubo, reunir os blastosporos Candida a partir de múltiplos tubos, adicionando PBS estéril para os peletes e ressuspender-los em 10 ml de PBS para contagem. </li><li> Tomar 20 ul de blastosporos em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar 20 uL de paraformaldeído a 2X e incubar à temperatura ambiente durante 15-20 min. Contagem blastosporos fixos usando o hemocitômetro sob o microscópio. NOTA: O paraformaldeído é cancerígeno. Abrir a solução não diluída apenas na hotte. </li><li> No entretanto, repetir a lavagem dos blastosporos pelo menos duas vezes, por centrifugação them em PBS, e peletização blastosporos. Manter os peletes em tubos de 15 ml à temperatura ambiente, na capa ABSL1, prontos para a infecção. </li><li> Deixar alguns PBS estéril à temperatura ambiente durante ressuspensão dos blastosporos para a infecção. </li><li> Após a contagem, adicionar PBS estéril para o sedimento blastosporo para ajustar o número de células de levedura blastosporo a 2 x10 8 de levedura células / ml. Esta é a suspensão blastosporo que será utilizado para infectar os ratinhos. Observação: executar todos os passos de forma asséptica. </li></ol> 4. Ratos Infection (3-5 dias após a transferência celular) NOTA: O procedimento básico infecção é realizada como descrito anteriormente 19,23-25. <ol><li> Pesar o Rag-1 - / - ratos que receberam PBS ou as células três dias antes. </li><li> Calcula-se a dose de agentes anestésicos, utilizando o seu peso corporal. Anestesiar os ratos por administração de cetamina / xilazina mistura (16,1 mg / ml e 1,6 mg / ml), utilizando agulhas 25 G em seringas de 1 ml de tuberculina, por intrinjeção aperitoneal. <ol><li> Administrar 50 ul por 10 gramas de peso corporal. (Ou seja, 0,8 mg de cetamina e 0,08 mg de xilazina / 10 g de peso corporal ou 80 mg de cetamina e de xilazina 8 mg por kg de peso corporal, respectivamente). Observar o desenvolvimento de resposta toe pitada a cada 15 minutos após a anestesia. NOTA: Esta dosagem irá induzir 60-90 min da anestesia, o que é suficiente para o procedimento de infecção. </li><li> Aplicar a pomada lubrificante oftálmico aos olhos dos ratinhos para evitar que as córneas de secar. Como o lubrificante ocular pode secar, repita lubrificação oftálmica a cada 45 min. </li></ol></li><li> Injectar 1 mL de solução salina (NaCl a 0,9%) por via subcutânea no lado de trás do membro anterior, para ajudar a re-hidratação dos ratos durante a anestesia. </li><li> Obter uma nova gaiola, limpo. Siga o procedimento de uma infecção do mouse em um momento, colocando cada rato na gaiola nova, uma vez infectado. Realize a infecção PBS / sham em primeiro lugar, e depois prosseguir para as gro infecção por Candidaups. </li><li> Pegue o rato anestesiado e abra a boca para revelar a base da língua. <ol><li> Coloque uma bola de algodão 3 mm de diâmetro saturado com 50 ul de PBS ou blastosporo suspensão, sublingualmente na cavidade oral durante 90 min. Virar os ratos a cada 15 minutos frente e de trás para evitar congestão pulmonar, garantindo que as bolas de algodão não se movem. </li></ol></li><li> Configurar um temporizador para cada rato para garantir 90 min de Sham ou Candida inoculação na cavidade oral. </li><li> Mantê-los em uma gaiola sob a lâmpada de calor (4 metros de distância), e cada mouse sobre almofadas de gel de calor. </li><li> Certifique-se de que a língua é retirado dentro e longe dos dentes, para evitar dentes dilacerante da língua. </li><li> No final de 90 minutos, retire a bola de algodão da boca do mouse. Preste atenção para qualquer rato que pode recuperar da anestesia mais cedo do que 75 minutos. Em tal caso, anestesiar-los novamente com cetamina (40 mg / kg) apenas. </li></ol> 5. Publicar Procedure Monitoramento (durante a anestesia 90 min) <ol><li> Use almofadas de gel de calor durante a anestesia 90 min. <ol><li> Para manter a temperatura do corpo e para evitar sufocamento, não permitem que os ratos se recuperar no mouse cama sabugo de milho regular. </li></ol></li><li> Após a recuperação da anestesia, administrar um adicional de 1 ml de NaCl a 0,9% esterilizado subcutaneamente em dois locais no dorso. </li><li> Mantenha-se cinco PBS (sham) camundongos inoculados por gaiola. Casa apenas 1-2 camundongos infectados por gaiola. </li><li> Preencha o cartão de procedimento com as iniciais todos os dias após o procedimento para anotar as mudanças no peso corporal, higiene hábitos e saúde em geral. </li></ol> 6. Avaliação da Inflamação 6.1) A perda de peso <ol><li> Pesar os ratinhos todos os dias durante a infecção, começando no dia anterior ao processo de infecção. NOTA: Normalmente, os ratos imunodeficientes injetados com células Th17 e sem regs T sucumbir a 20-30% De perda de peso devido ao aumento da carga fúngica 19 e exacerbado inflamação. </li></ol> 6.2) pontuação Histologia da língua <ol><li> Sacrifício dos ratinhos por asfixia com CO 2, seguida por deslocação cervical. </li><li> Abra as mandíbulas e dissecar a língua com tesouras e pinças. Use uma pinça rombo para manter a língua, e usando a tesoura chegar à parte de trás da boca para entalhar a extremidade traseira da língua. </li><li> Para hematoxilina immunocytochemical e eosina (H &amp; E) a coloração dos tecidos da língua, lavar os tecidos língua com PBS gelado. Adicionar 5 ml de formol a 10% por 2-3 línguas e corrigi-los O / N em tubos de 15 ml. <ol><li> No dia seguinte, remover a formalina e mergulhar os tecidos em 5 ml de etanol a 70% para evitar a hiper-fixação. Enviá-los para o serviço comercial para continuar com parafina, corte e coloração de cortes de parafina. NOTA: serviço histologia comercial é usado para executar estes passos. </li&gt; </ol></li><li> Uma vez que as lâminas estão de volta a partir do serviço histologia comercial, grau de inflamação, observando as secções de tecido sob um microscópio de luz. <ol><li> Pontuação de 0 a 5, sendo 0 sem inflamação, e 5 sendo o mais grave inflamação. Pontuação da inflamação usando Tabela 1. </li></ol></li></ol> 6.3) A produção de citocinas pelas células Th17 NOTA: A produção excessiva de TNF-α é uma das leituras de imunopatologia excessiva. Quando os ratos são transferidos adoptivamente com células Th17 só, faz com que a imunopatologia que está associado com a produção excessiva de TNF-α em células Th17. <ol><li> Coletar uma suspensão de células individuais do baço, linfonodos cervicais, linfonodos axilares, e língua, utilizando métodos previamente descritos 19,26. </li><li> Reestimular as células com miristato acetato de forbol (PMA) (50 ng / ml) e ionomicina (500 ng / ml) durante 4 h com Brefeldina A (10 ug / ml) adicionada no last 2 h. Lavam-se as células com PBS e corrigi-los utilizando um kit de fixação / permeabilização comercial de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Realização da coloração de citocinas celular intra utilizando o anti-TNF-α conjugado com fluorocromo, anti-IL-17A e anticorpos ROR-γt como anteriormente descrito 19. </li><li> Resumidamente, ressuspender as células em tampão de permeabilização 1X com o cocktail de anticorpos anti-TNF-α, anti-IL-17A e anticorpos ROR-γt, cada anticorpo a 2-3 ug / ml de concentração final. </li><li> Incubam-se as células durante 1 h à TA. </li><li> Após a incubação, lavar as células com tampão de permeabilização 1X. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de PBS com 0,5% de albumina de soro bovino para análise de citometria de fluxo. </li></ol>

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<li>Ramirez-Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+and+cancer%3A+Can+this+yeast+induce+cancer+development+or+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+In+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida albicans and cancer: Can this yeast induce cancer development or progression.</a> Critical Reviews In Microbiology. , 1-13 (2014).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este modelo é baseado na indução C. bucal infecção albicans dependente inflamação Th17. Devido à ausência de regs T, a inflamação induzida por células Th17 desprendido e leva a imunopatologia mal resolvidas. In vitro derivados de células T CD4 + naive polarizadas como células Th17 foram utilizados para a transferência adoptiva. 40 - 50% das células CD4 + cultivadas células mostram detectável expressão de IL-17A por volta do dia 3 (células Th17), e por isso foram utilizadas para a in...

Infecções orais e inflamação têm sido relacionadas ao câncer e doenças cardiovasculares e têm um impacto dramático na saúde humana geral2,3. Infecções oportunistas e inflamações causadas por C. albicans estão associadas a imunodeficiências primárias (DIP)4,5, distúrbios inflamatórios como periodontite 6,7, síndrome de Sjögren e doença das glândulas salivares8,9, bem como carcinoma epidermóide oral 10-12. C. albicans é um fungo comensal dimórfico que coloniza a boca de 60% dos humanos saudáveis de forma assintomática, mas é o patógeno fúngico mais comum que causa infecções quando a defesa do hospedeiro está enfraquecida13-15. Causa infecções e inflamações recorrentes e crônicas em pacientes com AIDS e DIP, e também em outros indivíduos imunocomprometidos. Como comensal, sua carga de colonização está associada à mudança na diversidade do microbioma oral geral16. Como patógeno, causa várias formas de candidíase orofaríngea, como pseudomembranosa aguda, atrófica aguda, atrófica crônica, hipertrófica/hiperplásica crônica e queilite angular. 
A proteção contra C. albicans é determinada não apenas pela resistência imune do hospedeiro, mas também pela capacidade de controlar adequadamente a imunopatologia induzida por Candida. Embora comensais como C. albicans contribuam para a modulação e exacerbação de outras condições inflamatórias orais, os mecanismos pelos quais a disbiose ocorre durante infecções oportunistas não são claros. Além do papel conhecido das células Th17 adaptativas na resposta de memória a C. albicans17, seu papel na iniciação e perpetuação da patologia da inflamação durante infecções crônicas permanece obscuro. Além disso, doenças inflamatórias orais, como síndrome de Sjögren e periodontite, estão associadas à patologia mediada por Th17. Curiosamente, essas doenças também estão fortemente associadas à OPC frequente. No entanto, as interações entre células Th17, imunopatologia oral de OPC e outras doenças inflamatórias orais não são estudadas. 
Embora modelos de camundongos de infecção primária e secundária de candidíase oral estejam disponíveis, um modelo de camundongo para estudar a inflamação Th17 associada à infecção por Candida, especialmente no contexto de imunodeficiência, não está disponível. Este estudo apresenta um método para estabelecer a inflamação oral Th17 associada à infecção oral por Candida em camundongos. A infecção por Candida em camundongos é caracterizada por lesões fúngicas, inflamação na língua, diminuição da ingestão de alimentos, perda de peso e, eventualmente, um estado moribundo. A patologia oral se assemelha a lesões crônicas de infecção por cândida, bem como displasia epitelial em modelos de câncer oral em camundongos12,18.

<table><tbody><tr><td>CAF-2</td><td>Universidade de Pittsburgh (Sarah Gaffen)</td><td>-</td><td>Candida cultura</td></tr><tr><td>U-bottom 96 placas de poços&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>055588</td><td>Usado para cultura de células</td></tr><tr><td>a-CD3&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-0031-85</td><td>Polarização de células para condições Th17</td></tr><tr><td>a-CD28&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td>Polarização de células para condições Th17</td></tr><tr><td>m-IL-6</td><td>Bio Basic</td><td>RC232</td><td>Polarização de células para condições Th17</td></tr><tr><td>h-TGF-b&nbsp;</td><td>R& D</td><td>240-B</td><td>Polarização de células para condições Th17</td></tr><tr><td>a-IFN-g&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-7311-85</td><td>Polarização de células para condições Th17</td></tr><tr><td>a-IL-4&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-7041-85</td><td>Polarização de células para condições Th17</td></tr><tr><td>&alpha;-IL17A ef660</td><td>eBiosciences</td><td>50-7177-82</td><td>Usado para cultura de células - 1:50</td></tr><tr><td>&alpha;-TNFa-PE-Cy7</td><td>eBiosciences</td><td>25-7423-41</td><td>Usado para cultura de células - 1:100</td></tr><tr><td>&alpha;-RORgt PE&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>12-6981-82</td><td>Usado para cultura de células - 1:50</td></tr><tr><td>YNB sem aminoácidos)/Peptona/Meio de caldo de dextrose&nbsp;</td><td>Bio Básico</td><td>S507. TAMANHO</td><td>Mediium para crescimento de candida</td></tr><tr><td>Incubadora Shaker&nbsp;</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4300</td><td>Crescimento de incubação para tubos de</td></tr><tr><td>candida de 15 ml</td><td>Bio Basic</td><td>BT888-SY</td><td>Usado para cultura de células e crescimento de cândida</td></tr><tr><td>Tubos de 50 ml</td><td>Bio Basic</td><td>CT 788-YS</td><td>Usado para cultura de células e crescimento de cândida</td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa</td><td>VWR International LLC</td><td>82017-654</td><td>Para peletização de cândida -900 g</td></tr><tr><td>Centrífuga</td> <td>AllegraBeckman Coulter</td><td>392302</td><td>Cultura de células - 480 g</td></tr><tr><td>Tubos eppendorf de 1,5 ml</td><td>Bio Basic</td><td>BT620-NS</td><td>Preparação da concentração final de candida</td></tr><tr><td>2x paraformaldeído</td><td>Microscopia eletrônica Sciences</td><td>15710</td><td>Fixação de candida para contagem</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>VWR International LLC</td><td>15170-172</td><td>Contagem de células</td></tr><tr><td>PBS - Phosphate Buffered Saline</td><td>Bio Basic</td><td>PD8117</td><td>Preparação de tampões</td></tr><tr><td>Cetamina/xilazina&nbsp;</td><td>Case Western Reserve University - Animal Resource</td> <td>Center-Obtido</td> <td>do protocolo aprovado pela ARC para anestesia</td></tr><tr><td>Pomada lubrificante oftálmica&nbsp;</td><td>Pomada</td> <td>Allergan-Eye</td> <td>para animais para prevenir o ressecamento</td></tr><tr><td>Solução salina (0,9% NaCl)</td><td>G Biosciences</td><td>786-561</td><td>Administrado a animais para prevenir a desidratação</td></tr><tr><td>Bola de algodão de 3 mm de diâmetro&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>BP7603</td><td>Bolas de 3 mm para infecção por candida</td></tr><tr><td>Almofadas de gel de calor</td><td>Case Western Reserve University - Animal Resource</td> <td>Center-para</td> <td>manter a temperatura corporal e recuperação rápida</td></tr><tr><td>Coloração de hematoxilina e eosina</td><td>Histoserv - MD-Histologia</td><td></td> <td>de tecidos</td></tr><tr><td>10% formalina&nbsp;</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>JC1111/MC</td><td>Histologia de tecidos</td></tr><tr><td>70% etanol&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>97064-490</td><td>Finalidade de esterilização</td></tr><tr><td>PMA - Phorbol 12-miristato 13-acetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>Reestimulação de células</td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Life Technologies</td><td>124222 1mg</td><td>Reestimulação de células</td></tr><tr><td>Kit de permeabilização de fixação</td><td>eBiosciences</td><td>E16913-106</td><td>Células de fixação para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Seringas de tuberculina</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td>Injeção de camundongos</td></tr><tr><td>25 G x 3/8 agulhas</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>Injeção de camundongos</td></tr><tr><td>Rag1 -/- camundongos</td><td>Jackson laboratories</td><td>Nº de estoque: 002216</td><td>Camundongos receptores</td></tr><tr><td>CD45.1 camundongos congênicos</td><td>Laboratórios Jackson</td><td>Nº de estoque:002014&nbsp;</td><td>Células Th17 do doador</td></tr><tr><td>Camundongos CB17-SCID Jackson</td><td>laboratories</td><td>Nº de estoque: 001303</td><td>Camundongos receptores</td></tr><tr><td>Camundongos Balb/c Laboratórios</td><td>Jackson</td><td>Nº de estoque: 000651</td><td>Células Th17 do doador</td></tr></tbody></table>

th17 inflamação modelo de orofaringe candidíase em imunodeficientes mice

Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

A doença da candidíase orofaríngea (OPC) é causada não apenas devido à falta de resistência imunológica do hospedeiro, mas também à ausência de regulação adequada da imunopatologia induzida por infecção. Embora as células Th17 estejam implicadas na defesa antifúngica, seu papel na imunopatologia não é claro. Este estudo apresenta um método para estabelecer a imunopatologia oral Th17 associada à infecção oral por cândida em camundongos imunodeficientes. O método é baseado na reconstituição de camundongos linfopenicos com células Th17 cultivadas in vitro, seguida de infecção oral por Candida albicans (C. albicans). Os resultados mostram que as células Th17 irrestritas resultam em inflamação e patologia e estão associadas a várias leituras mensuráveis, incluindo perda de peso, produção de citocinas pró-inflamatórias, histopatologia da língua e mortalidade, mostrando que este modelo pode ser valioso no estudo da imunopatologia OPC. A transferência adotiva de células reguladoras (Tregs) controla e reduz a resposta inflamatória, mostrando que este modelo pode ser usado para testar novas estratégias para neutralizar a inflamação oral. Este modelo também pode ser aplicável no estudo da imunopatologia oral Th17 em geral no contexto de outras doenças bucais.

Neste modelo, tanto os camundongos infectados por Candida e camundongos não infectados em Rag-1 - / - fundo imunodeficientes foram adotivamente transferidos com células Th17 3-5 dias antes da infecção. Um total de 10-12 ratinhos foram utilizadas para as experiências, com dois ratos em cada Sham grupos infectados e 5/4 em cada um dos grupos infectados Candida. Células naive foram derivadas de Thy1.1 ou CD45.1 ratinhos congénicos, de modo que as células Th17 injectados foram rastreados in ...

Embora os modelos de infecção por Candida estejam disponíveis para estudar a resistência imunológica do hospedeiro, um modelo para estudar a imunopatologia mediada por células T no contexto da infecção por Candida está ausente. Aqui descrevemos um método para estabelecer a imunopatologia Th17 associada à infecção oral por Candida em camundongos imunodeficientes.

Th17 Inflamação Modelo de orofaringe Candidíase em imunodeficientes Mice

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of ...

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver um modelo de inflamação oral dependente de infecção mediada por células TH17 patológicas. Isso é realizado primeiramente injetando células TH17 em camundongos imunodeficientes. O próximo passo é cultivar o fungo Candida albicans, coletar os blastósporos e prepará-los em PBS.O passo final consiste em injetar oralmente os camundongos com esporos de blasto para promover a proliferação das células TH17 injetadas e induzir inflamação oral. Os resultados mostram que os camundongos injetados com TH17 apresentam perda de peso e inflamação da língua, conforme análise por citometria de fluxo e imuno-histoquímica da língua. Assim, as implicações dessa técnica estendem-se à imunoterapia oral, considerando este modelo murino.O modelo de inflamação TH17 também pode ser utilizado para estudar a inflamação TH17 no contexto de outras doenças orais, demonstrando que o procedimento será conduzido por mim e por Nitrogen Vascular, e um pesquisador pós-doutorando no meu laboratório. Este procedimento requer células T naïve previamente separadas e, opcionalmente, células Treg para estabelecer culturas de células TH17 positivas para CD4, CD44 baixo, CD62L alto, CD25 negativo em placas de 96 poços com 30.000 células por poço, em condições TH17, por três a quatro dias. Como controle, as células T naïve podem ser cultivadas juntamente com 30.000 células Treg positivas para CD4, CD25 e FOX P3 nas mesmas condições de cultura para gerar células TH17. Após quatro dias de cultivo, colete as células TH17 utilizando uma pipeta.Reserve uma pequena alíquota para examinar sua viabilidade. Suspenda essas células em meio mililitro de RPMI e adicione 100 nanogramas de iodeto de propídio. Para análise por fax, a maior parte das células é coletada e preparada para injeção celular.A maior parte das células deve ser lavada em PBS e centrifugada, e então preparada para injeção nos camundongos. À razão de 10 milhões de células por mililitro em PBS frio, injete os camundongos com 100 microlitros da suspensão celular por via intraperitoneal, utilizando uma agulha de 25 gauge. Outros camundongos devem receber injeção de PBS ou de células controle TH17/Treg co-cultivadas. Planeje infectar os camundongos com C. albicans em três a cinco dias, no dia anterior.Infectando os camundongos com C albicans, dispersar cinco colônias da linhagem laboratorial CAF dois traço um em 100 microlitros de PBS estéril e adicionar a suspensão a 20 mililitros de caldo estéril. Deixar o meio inoculado crescer durante a noite a 30 graus Celsius com agitação de 130 RPM. No dia seguinte, coletar 10 mililitros da cultura em um tubo de 15 mililitros, em seguida centrifugar o Eloqua a 1900 G por cinco minutos.À temperatura ambiente, o pellet contém os esporos blasto e o sedimento deve ser descartado. Reúna todos os esporos blasto coletados em 10 mililitros de PBS estéril e transfira 20 microlitros de Eloqua para um tubo microfuga. Adicione 20 microlitros de dois XPFA ao Eloqua e, após 15 a 20 minutos de fixação, conte os esporos blasto utilizando um hemocitômetro durante o período de fixação.Lave a maior parte dos esporos blasto com PBS pelo menos mais duas vezes. Armazene os pellets de esporos blasto em uma cabine AB SL à temperatura ambiente até que a contagem seja conhecida. Em seguida, ressuspenda os esporos blasto em PBS à temperatura ambiente a 200 milhões de células por mililitro.Mantenha as células prontas para infectar os camundongos. Este método já foi revisado anteriormente, mas será abordado brevemente nesta seção. Primeiro, anestesie os camundongos, confirme o estado anestesiado e aplique pomada oftálmica.A aplicação deve ser repetida após 45 minutos. A seguir, subcutaneamente. Injete um mililitro de solução salina para hidratação, trabalhando com um camundongo por vez.Primeiro, infecte o grupo controle e, em seguida, o grupo candida. Prepare uma bola de algodão com três milímetros de diâmetro, saturando-a com 50 microlitros de PBS ou suspensão de blastoconídios. Em seguida, acesse a base da língua e coloque a bola de algodão nesse local.Certifique-se de que a língua esteja recolhida para dentro e afastada dos dentes para que não seja lacerada. Em seguida, transfira o camundongo para sua própria gaiola de recuperação sobre uma almofada aquecida. A cama de aparas de milho não deve ser usada na gaiola, pois a almofada térmica não transferirá calor suficiente; posicione uma lâmpada de aquecimento a quatro pés acima da posição da gaiola de recuperação.A bola de algodão deve permanecer no lugar durante 90 minutos. Cada camundongo deve ter seu próprio temporizador regressivo de 90 minutos. Durante esse período, cada camundongo deve ser virado de lado a lado a cada 15 minutos para evitar congestão pulmonar.Portanto, a etapa única mais crítica em todo o procedimento é garantir que a bola de algodão permaneça no lugar durante todo o período de inoculação. Se um camundongo começar a se recuperar da anestesia prematuramente, reanestesie-o utilizando apenas cetamina. Após 90 minutos, remova a bola e observe a recuperação do animal.Após a recuperação, administre um mililitro adicional de soro fisiológico em dois locais nas costas para maior hidratação. Após o procedimento, até cinco camundongos submetidos a inoculação simulada podem compartilhar uma gaiola, utilizando linfócitos T ingênuos derivados de camundongos thigh 1.1 ou CD 45.1. O procedimento descrito foi seguido e os linfócitos T injetados foram rastreados por meio de seus marcadores respectivos.As Treg de co-transferência foram derivadas de camundongos CD 45,2 e também foram rastreadas apenas por esse marcador. Os camundongos infectados por Candida exibiram recrutamento e expansão das células TH 17 injetadas. Após a infecção, a perda de peso foi monitorada.Os camundongos injetados apenas com células TH17 perderam peso progressivamente e alguns precisaram ser eutanasiados. Enquanto isso, a perda de peso nos outros grupos eventualmente cessou. Os camundongos que foram injetados com a co-cultura de Tregs apresentaram muito menos células produtoras de TNF alfa quatro dias após a infecção.A presença prolongada de células produtoras de TNF Alfa mostra que os camundongos injetados apenas com TH 17 apresentaram infecções e inflamação não resolvidas. As línguas dos camundongos injetados com tregs também mostraram infiltrados inflamatórios muito menores e menor crescimento fúngico. No mesmo ponto temporal, a presença prolongada de infiltrados inflamatórios indica que os camundongos injetados apenas com TH 17 tinham infecções e inflamação não resolvidas. Uma vez dominada, esta técnica de infecção pode ser realizada em três horas para quatro camundongos, mais 15 minutos adicionais para cada camundongo a ser infectado.

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Aprenda a desenvolver um modelo de inflamação oral mediada por células Th17 em camundongos imunodeficientes infectados por Candida albicans. Este método permite estudar imunopatologia e avaliar terapias orais.

Th17 Inflamação Modelo de orofaringe Candidíase em imunodeficientes Mice

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