Name: Tensão e cálcio Dual Channel Mapping Optical do Cultivadas HL-1 Atrial miócitos Monolayer (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprenda mapeamento óptico de duplo canal em monocamadas de células atriais HL-1 cultivadas. Este método permite visualizar simultaneamente potenciais de membrana e transientes de cálcio, revelando a propagação de sinais elétricos em cardiomiocitos.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Claycomb para fornecer células HL-1 e protocolo de manutenção detalhado. Gostaríamos também de agradecer Ms. Elena Carrillo e Dr. Seth Robia por sua assistência com a geração de o filme celular e Mr. Pete Caron por sua ajuda com fazer alguns acessórios para o nosso sistema de mapeamento óptico de canal duplo. Este trabalho foi financiado pela American Heart Association (10GRNT3770030 &amp; 12GRNT12050478 para XA), os Institutos Nacionais de Saúde (HL113640 para XA) e Loyola Fundo de Desenvolvimento Research University (a XA).

1. Preparação de Solução <ol><li> Solução Norepinefrina (NP) <ol><li> Dissolver 40 mg de NP em 25 ml de ácido ascórbico 30 mM (0,1475 g de ácido ascórbico em 25 ml de água purificada Milli-Q (MQ). Evite a exposição à luz directa durante esta preparação solução porque norepinefrina (NP) é sensível à luz. </li><li> Filtra-se a solução de NP com um filtro de seringa de 0,22? M. Alíquota da solução em 1 ml microtubos estéreis e armazenar a -20 ° C. Uma vez congelado, NP é estável durante um mês. </li></ol></li><li> Meios suplementados Lave e Final Claycomb <ol><li> Comece com 43,5 ml de meio Claycomb e suplementar com 5 ml de soro fetal bovino (FBS), 0,5 ml de penicilina / estreptomicina, 0,5 ml de NP e de 1: 100 diluído L-glutamina para fazer 50 ml de meio suplementado Claycomb final. Evite a exposição à luz directa durante esta preparação solução porque médio Claycomb é sensível à luz. </li><li> Preparar o meio de lavagem Claycomb usando a mesma receita que a supmédio mentado Claycomb exceto adicionar 5% FBS e omitir o NP e componentes L-glutamina. NOTA: A mídia Final e Wash Claycomb complementado são boas por duas semanas, quando armazenado a 4 ° C, sem exposição à luz direta. </li></ol></li><li> Soja solução inibidora de tripsina <ol><li> Dissolve-se 25 mg de inibidor de tripsina de soja em 100 ml de Ca e Mg livre-livre de soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco (PBS). </li><li> Filtrar a solução através de um filtro de seringa de 0,22? M. NOTA: A solução esterilizada é estável durante vários meses, quando armazenada a 4 ° C. </li></ol></li><li> Solução de gelatina / Fibronectina revestimento prato <ol><li> Dissolve-se 0,1 g de gelatina em 500 ml de água para fazer MQ 0,02% de gelatina. </li><li> Autoclave, então diluir 1 ml de fibronectina em 199 ml de 0,02% de gelatina e misture delicadamente. </li><li> Aliquota 6 ml de solução de gelatina em tubos separados e armazenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> Solução de sal de Hanks <ol><li> Usando um rebuliçoplaca, dissolver os seguintes sais em água MQ (mmol / L), NaCl (136,9), KCl (5.366), KH 2 PO 4 (0,4409), NaH 2 PO 4 (0,4 mil), MgSO 4 (0,8142), D-Glc (5.051), NaHCO 3 (4.162), HEPES (5.042), CaCl 2 (1,261). </li></ol></li><li> Solução corante sensível ao cálcio (Rhod2) <ol><li> Dilui-se 1 mg de pó seco Rhod2 em 400 ul de 20% de Pluronic F-127 em DMSO para fazer uma solução estoque Rhod2 tingir e armazenar a -20 ° C. </li><li> Dilui-se esta solução de reserva de 1: 1000 com uma solução de sal de Hanks para fazer uma solução de trabalho final antes do início da experiência. </li></ol></li><li> Solução de corante sensível Tensão (Rh237) <ol><li> Dilui-se 5 mg de Rh237 com 2 ml de DMSO para fazer uma solução estoque e armazenar a -20 ° C. Dilui-se a solução stock de 1: 1000 com uma solução de sal de Hanks para fazer uma solução de trabalho final antes do início da experiência. </li></ol></li></ol> &amp; #160; NOTA: 1-4 soluções baseiam-se no protocolo de HL-1 de cultura de células Claycomb com pequenas modificações. 2. Passaging e Cultivo HL-1 atriais miócitos em lamelas NOTA: As células HL-1 pode ser obtido a partir de Dr. Claycomb (Louisiana State University). <ol><li> Crescer HL-1 células em frascos T25 e alimentar com 5 ml de suplementado Claycomb Medium diárias. Passagem as células em frascos T25 de cinco em cinco dias de acordo com o protocolo de HL-1 de cultura de células Claycomb (descrito abaixo) 10. </li><li> Coloque as lamelas circulares (20 mm de diâmetro) em 12 placas de cultura de 24 horas antes das células no frasco T25 confluente são totalmente e pronto para ser passado, e então cobrir as lamelas com gelatina / fibronectina durante a noite a 37 ° C. </li><li> No dia seguinte, aspirado e descartar a gelatina / fibronectina a partir das placas de cultura e substitua com 1,5 ml de meio suplementado Claycomb final em cada poço. </li><li> Dividir células de uma cultur T25e após atingir confluência balão cheio no dia 5. Aspirar o meio do frasco T25 contendo a cultura confluente e enxaguar a cultura brevemente com PBS a 37 ° C. </li><li> Aspirar PBS e adicionar 3 ml de 0,05% de tripsina / EDTA a 37 ° C por pipetagem a tripsina / EDTA para o fundo do frasco T25 para evitar o contacto directo com as células. Incubar a 37 ° C durante 1 min. </li><li> Remover tripsina / EDTA por aspiração e adicionar outros 1,3 ml de tripsina / EDTA por frasco T25. Incubar à temperatura ambiente durante 1 min. Examinar ao microscópio e se as células que ainda estão presos ao balão, toque para desalojar completamente as células restantes. </li><li> Adicionar 1,3 ml de inibidor de tripsina de soja para as células e as células de transferência de balão para um tubo de centrífuga de 15 ml. Lavar o balão vazio com 5 ml de meio de lavagem Claycomb. Adicionar a água para as células no tubo de centrifugação de 15 ml. Centrifugar a 500 xg durante 5 min. </li><li> Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento celularem 6 ml de meio suplementado Claycomb final. </li><li> Semente cada poço de uma placa de 12 poços com 0,5 ml de suspensão de células a partir de passagens em células. Alimente as células com meio suplementado final Claycomb fresca diariamente. NOTA: Estreitamente monitorar o crescimento das células, tipicamente as monocamadas de células confluentes atingir o estatuto no dia 4 e as actividades espontâneas permanecem visíveis. Em seguida, a monocamada cultivadas estará pronto para mapeamento óptico no dia 4-5. </li></ol> 3. Carregamento de cálcio e de tensão Corantes sensíveis às células <ol><li> Para os estudos de mapeamento de óptica, remova cuidadosamente a lamela do 12-placa de cultura de células e enxaguar com solução salina de Hanks. </li><li> Para corar as células com o corante sensível ao Ca Rhod2, incubar a monocamada de células na lamela com 3 ml da oxigenado (borbulhar com 5% de CO 2/95% O 2 gás) a solução de trabalho Rhod2 a 37 ° C em banho-maria durante 30 min . </li><li> Para manchar as células com corante sensível V mRh237, imergir o Rhod2 monocamada celular carregado em 3 ml de solução de trabalho de Rh237 oxigenada a 37 ° C num banho de água durante mais 15 min. </li></ol> Mapeamento 4. Dual Channel Optical <ol><li> Coloque a monocamada de células, que é o dobro-coradas com corantes V m e Ca, em uma câmara de circulação de um microscópio de fluorescência invertido. Usar um sistema de circulação aquecido para manter a temperatura da câmara da célula, a 35 ± 1 ° C. Controlar cuidadosamente a temperatura do perfusado, ajustando a velocidade do fluxo que circula através da câmara, para evitar um gradiente de mais do que 0,3 ° C ao longo da câmara. <ol><li> Antes de gravar V m / sinais de Ca, lava-se a monocamada de células com solução de Hanks fresco durante aproximadamente 5 minutos para remover o corante que permanece nos passos anteriores de coloração. </li></ol></li><li> Pace monocamadas de células saudáveis, usando um eletrodo bipolar composta de uma pipeta de vidro preenchido com solução salina de Hanks e um silver fio espiral ao redor da ponta da pipeta, como descrito anteriormente 12,17. </li><li> Pace monocamadas de células saudáveis ​​em um comprimento de ciclo de 200-500 ms e pulso largura de 2 ms, à espera de um limiar de estimulação em aproximadamente 1 mV. NOTA: Para cada lote de monocamadas de cultura, pelo menos, duas monocamadas não tratadas devem ser utilizados para testar o estado do lote de células. As monocamadas de controlo saudáveis ​​deve ser capaz de ser capturada por estimulação eléctrica em comprimentos de ciclo de 200-500 ms. Se as monocamadas de controlo falhar para ser electricamente estimulado, isto sugere que o lote de célula inteira pode não ser adequado para as experiências de mapeamento óptico. </li><li> Para excitar tanto V m e corantes sensíveis Ca, use uma fonte de luz LED (520 nm de comprimento de onda), acoplado com um filtro de excitação (510 nm / 40) e um espelho dicróico (561 nm). <ol><li> Recolha os sinais fluorescentes emitidos pelas células através de uma objetiva de 40X e dividir com um espelho dicróico (594 nm) em um componente V m e um componente Ca.Filtra-se a luz emitida no canal de m V com um filtro de passagem longa (700 nm) e a luz emitida no canal de cálcio, com um filtro de passagem de banda (585/40 nm). </li><li> Coletar a luz fluorescente filtrada usando duas câmeras CCD (80 x 80 pixels, 1.000 fps; RedShirt imagem). </li><li> Para evitar a fotodegradação de corante, para fazer gravações de menos de 2 segundos em cada campo de vista a limitar o tempo de exposição à luz. Aqui, normalmente imagem quatro áreas diferentes para cada monocamada. </li></ol></li></ol> 5. Processamento de Dados do V m ou Ca Recordings <ol><li> Para ambos os sinais Ca V (80 x 80 pixels) e m, calcular a média dos valores de intensidade de vinte e cinco (5 x 5) pixels vizinhos para um valor de intensidade, em diferentes pontos no tempo de gravação para reduzir o ruído de fundo. NOTA: Após a média de dados, cada ponto de um potencial de ação individual ou Ca transitória tempo de gravação gera uma matriz de dados que contém 16 x 16 em média valores de intensidade (médiacanais de dados) com uma resolução espacial de 50 um. </li><li> Definir o tempo de ativação (AT) de sinais de Ca gravado V m or. <ol><li> Para definir um tempo de activação (AT) de um potencial de acção individual ou Ca transiente, determinar o tempo de 50% da amplitude de pico do V, sinais de Ca utilizando um algoritmo baseado no MATLAB feito por encomenda ou m, tal como descrito anteriormente. 12 </li><li> Corrigir manualmente o ATs analisados ​​para eliminar quaisquer erros que possam ocorrer durante a análise do programa. </li><li> Armazenar o definido AT matriz (16 x 16 canais de dados média) de potencial de acção gravado e transiente de cálcio, respectivamente, no software usado. </li></ol></li><li> Calcular potencial de acção ou transientes de cálcio a velocidade de condução (CV) na matriz de vectores AT usando o método de análise do campo de vectores como descrito anteriormente com modificações menores 12,18. <ol><li> Calcula-se o vector de CV de um canal de dados em relação ao seu redor AT pontos de dados (5 ×; 5 vizinha média de canais de dados) para simular uma superfície lisa polinomial dos tempos de ativação (na superfície) usando um algoritmo de mínimos quadrados dentro do programa MATLAB 12,18. </li><li> Calcular condução vector utilizando as fórmulas abaixo Fórmula 1: <img alt="Equação 1" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52542/52542eq1.jpg" /> Fórmula 2: θ = arctan [(dy / dT) / (dx / dT)] NOTA: Ve é um vetor CV projetada em xey eixos; dx / dT é a projeção do vetor CV no eixo-x; dy / dT é a projeção do vetor CV no eixo-y. T é a superfície da AT; x, y referem-se a 2-D coordenadas; T x = ∂t / ∂x é a derivada parcial de T em relação a x; T y = ∂t / ∂y é a derivada parcial de T em relação à y; θ é a direcção final, de um vector de CV. </li><li> Grupo de todos os vetores da matriz AT em 36 vias, cada um dos quais abrange um sector de dez graus na bússola. &lt;/ Li&gt; <li> Seleccione o percurso que contém a maior população de vectores CV entre as 36 vias de condução. Calcule o CV média desta via para representar o CV da monocamada. </li></ol></li></ol> 6. A visualização da propagação da onda frontal <ol><li> Normalizar a intensidade do sinal de um potencial de acção individual ou Ca transiente em diferentes pontos de tempo de gravação em relação ao seu valor de pico utilizando o software MATLAB. </li><li> Armazenar temporariamente os dados de intensidade normalizadas de cada ponto de tempo gravado numa matriz 16 x 16 de intensidade no software Matlab utilizado. </li><li> Construa uma intensidade mapa colorido a partir da matriz de intensidade armazenado de cada ponto de tempo de gravação utilizando a função surf.m. NOTA: No mapa de intensidade, o vermelho representa alta intensidade do V sinais Ca m ou e azul reflete baixa intensidade dos sinais de fluorescência. </li><li> Criar um arquivo .avi usando a função avifile.m. </li><li> Guarde todo o imapas ntensity em momentos diferentes de gravação do potencial de ação ou Ca transiente usando a função addframe.m. NOTA: Neste ponto, dois arquivos AVI separadas de V m e propagação Ca será gerada. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

Este artigo descreve os principais aspectos do mapeamento óptico em um culto HL-1 miócitos atrial monocamada coradas com cálcio e tensão corantes fluorescentes sensíveis. Ele inclui a cultura de um HL-1 monocamada de células ideal, configuração dos equipamentos de mapeamento, o mapeamento de uma monocamada de culto, e análise de dados. Para mapear com sucesso células em cultura, é a chave para preparar uma monocamada de células distribuídas uniformemente. Quando semear as células sobre a as ...

A única cálcio (Ca) e tensão (V m) técnica de mapeamento óptico de canal duplo 1-5 está a emergir como uma ferramenta eficiente para gravar simultaneamente sinais V m e Ca em ambos os corações intactos e monocamadas de células em cultura. Esta técnica torna possível obter informações poderoso sobre a relação entre transientes de cálcio e os potenciais de acção para compreender melhor os mecanismos subjacentes electrofisiológicas de arritmias cardíacas. As monocamadas de células cultivadas têm provado ser um modelo útil para estudar celular electrofisiologia cardíaca e o mecanismo subjacente de arritmias. 4,6-8 células HL-1 são uma linha de cultura dos miócitos atriais bem caracterizado. Células HL-1 também manter um genótipo e fenótipo diferenciado com exclusividade, que inclui morfológica, eletrofisiológico, e as características farmacológicas dos miócitos atriais adultos. Estas células expressam genes e proteínas cardíacas, incluindo important canais iónicos cardíacos (ou seja, L e canais de cálcio do tipo T) 9 e isoformas de proteínas maduras contrácteis sarcoméricas normalmente encontrado nos miócitos atriais adultos como os outros e que têm relatado anteriormente. 10-13 Além disso, as células HL-1 pode ser cultivadas para formar uma 2-dimensional (2-D) monocamada de miócitos. Assim, as vantagens de usar cultivadas monocamadas de HL-1 incluem: 1) custo relativamente mais baixo e mais fácil de manter uma linha de cultura de miócitos de isolar e cultivar os miócitos neonatais primários; 2) uma monocamada confluente de células reduz as complexidades estruturais que resultam da estrutura 3-D do coração; 3) uma monocamada de células pode eliminar a interferência de fibrose intersticial que ocorre no coração intacto. Isto pode ser utilizado para dissecar funções específicas electrofisiológicas de um grupo de miócitos, sem interferência de fibroblastos e da matriz intersticial; 4) avaliação das consequências funcionais a partir de manipulação farmacológica ou genética na culmonocamadas de células Tured pode ser efetivamente alcançado. Portanto, HL-1 células tornaram-se um modelo celular amplamente utilizado para estudar diversos aspectos da fisiologia dos miócitos, bem como atividades elétricas anormais induzida por estimulação. 13-16 No entanto, manuseio e cuidados especiais são necessários para a cultura monocamadas de células saudáveis ​​que respondem a externo A estimulação eléctrica para estudos de mapeamento óptico. Além disso, o processo de coloração do corante fluorescente dupla pode facilmente danificar a integridade de monocamadas confluentes de células cultivadas. Assim, a realização V m / CA dual channel mapeamento óptico no cultivadas HL-1 monocamadas tem sido um grande desafio. O objetivo deste método é fornecer os principais passos para a realização com êxito mapeamento óptico de canal duplo em cultivadas HL-1 monocamadas. Aqui nós fornecemos detalhes abrangentes sobre um protocolo otimizado para preparação monocamada HL-1 celular, mapeamento óptico de canal duplo de uma monocamada de células cultivadas, e processamento de dados de mapeamento.

<table><tbody><tr><td>Rhod2 pó seco</td><td>AAT Bioquest</td><td>21062</td><td></td></tr><tr><td>pluronic</td><td>AAT Bioquest</td><td>20050</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Rh237</td><td>Invitrogen</td><td>S-1109</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr></tbody></table>

tensão e cálcio dual channel mapping optical do cultivadas hl-1 atrial miócitos monolayer

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Mapeamento Optical tem provado ser uma técnica valiosa para detectar a atividade elétrica cardíaca em ambos intacta ex vivo corações e em monocamadas miócitos em cultura. Células HL-1 têm sido amplamente utilizados como um modelo celular de 2-dimensional para o estudo de diversos aspectos da fisiologia cardíaca. No entanto, tem sido um grande desafio para o mapa opticamente cálcio (Ca) transientes e potenciais de ação simultaneamente a partir do mesmo campo de visão em um HL-1 monocamada de células cultivadas atrial. Isto porque manuseio e cuidado especial é necessário para preparar as células saudáveis ​​que podem ser eletricamente capturados e opticamente mapeadas. Por conseguinte, foi desenvolvido um protocolo de trabalho óptima para o mapeamento óptico de canal duplo. Neste manuscrito, temos descrito em detalhes como realizar o experimento mapeamento óptico de canal duplo. Este protocolo é uma ferramenta útil para melhorar a compreensão da propagação do potencial de ação e cinética de Ca no desenvolvimento de arritmia.

A monocamada confluente cultura apresenta um ritmo intrínseco regular como demonstrado no filme 1. Nós, então, realizada V m / Ca mapeamento óptico de dois canais em um totalmente confluente HL-1 monocamada. A Figura 1A mostra exemplo vestígios de V sinais Ca m e a partir de um único gravado bater. Mapas isócronos representativos de sinais de Ca utilizando o sistema de mapeamento óptico de duplo canal uniformemente propagadas V m e estão apresentados nas...

Este artigo descreve a técnica usada para realizar o mapeamento óptico de canal duplo em monocamadas de células atriais HL-1 cultivadas. Este protocolo exclusivo permite a visualização simultânea da atividade de cálcio (Ca) e voltagem (Vm) na mesma área para a detecção e análise detalhadas das propriedades eletrofisiológicas das monocamadas de cultura.

Tensão e cálcio Dual Channel Mapping Optical do Cultivadas HL-1 Atrial miócitos Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

O objetivo geral deste procedimento é mapear simultaneamente os potenciais transmembranares e os transientes de cálcio em monocamadas atriais HL-1 carregadas com corantes de cálcio e voltagem. Isso é realizado primeiramente cultivando as células HL-1 sobre uma lamínula até atingirem uma densidade confluente adequada. O segundo passo é carregar os corantes sensíveis ao cálcio e à voltagem nas células.Em seguida, a monocamada de HL é estimulada com um eletrodo bipolar. O passo final é registrar os potenciais de ação e os sinais transitórios de cálcio por microscopia de fluorescência. Em última análise, os traçados do potencial de ação e do transiente de cálcio podem ser compilados para mostrar a propagação dos sinais através da monocamada confluente ao longo do tempo.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da eletrofisiologia cardíaca, como a relação entre cálcio, transientes e potenciais de ação. Nas propriedades eletrofisiológicas de células HL-1 cultivadas submetidas a diversos tratamentos farmacológicos, embora este método possa fornecer informações sobre os padrões de atividade, propagação do potencial de ação e dos transientes de cálcio em nível microscópico, ele também pode ser aplicado a sistemas biológicos, como corações humanos remodelados patologicamente e modelos animais arritmogênicos.De modo geral, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades porque as células HL-1, que mantêm fenótipos cardíacos de camundongo, são difíceis de cultivar e exigem otimização cuidadosa. O protocolo necessário envolve a passagem das culturas e a manutenção da monocamada. Para começar, prepare todas as soluções estoque para o experimento conforme indicado no protocolo descrito no texto, cultive as células HL-1 em frascos T-25 e substitua o meio diariamente por cinco mililitros de meio Claycomb suplementado fresco.As células devem estar prontas para passagem no dia 5, 24 horas antes de as células HL-1 atingirem confluência. Coloque lamínulas redondas de 20 milímetros nas cavidades de uma placa de cultura de 12 poços. Adicione um mililitro da solução de gelatina-fibronectina a cada poço para revestir as lamínulas e, em seguida, incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius.No dia seguinte, aspire a solução de gelatina e fibronectina dos poços da placa de cultura e, em seguida, adicione 1,5 mililitros do meio final suplementado de argila caseira a cada poço. Em seguida, aspire o meio do frasco T 25 contendo as células HL uma, e lave brevemente a cultura com PBS a 37 graus Celsius. Aspire o PBS do frasco e adicione três mililitros da solução de tripsina-EDTA na parte inferior do frasco T 25, tomando cuidado para não perturbar as células; abaixe e gire suavemente o frasco para cobrir as células com a solução, e então coloque o frasco no incubador por um minuto a 37 graus Celsius.Em seguida, aspire cuidadosamente a solução de tripsina-EDTA do cultivo para não perturbar as células. Então, adicione mais 1,3 mililitros da solução de tripsina-EDTA ao frasco. Incube o frasco à temperatura ambiente por mais um minuto.Observe as células ao microscópio para determinar se elas se desprendeu da superfície do frasco. Bata suavemente no frasco para desprender quaisquer células que ainda estejam aderidas. Assim que todas as células se desprendem, adicione 1,3 mililitros da solução de inibidor de tripsina de soja às células e, em seguida, transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros.Lave o frasco vazio com cinco mililitros do meio de lavagem e adicione a lavagem às células no tubo. Centrifugue o tubo a 500 vezes G durante cinco minutos e, em seguida, aspire o sobrenadante S sem perturbar o pellet celular. Resuspenda suavemente o pellet celular em seis mililitros de meio suplementado.Adicione 0,5 mililitros da suspensão celular a cada poço da placa de cultura. Incube as placas a 37 graus Celsius, trocando o meio diariamente até que as culturas atinjam confluência. Para preparar as soluções de corante de trabalho, dilua as soluções estoque de road two e RH 2 37 em uma proporção de 1 para 1000 em solução salina de Hank.Observe as placas de cultura de 12 poços ao microscópio para determinar se as células HL-1 estão confluentes. Geralmente quatro dias após a semeadura, quando as células estiverem confluentes, remova cuidadosamente a lamínula do poço e lave a lamínula com solução salina de Hank. Coloque a lamínula em uma placa de Petri de 35 milímetros contendo três mililitros da solução trabalho road two.Coloque a placa de Petri em um banho-maria a 37 graus Celsius e borbulhe um fluxo contínuo de gás através da solução para oxigenação. Incube por 30 minutos para corar as células com o corante sensível ao cálcio. Em seguida, transfira o lamínula para três mililitros de solução RH 2 37 oxigenada e incube por 15 minutos.A monocamada de células deve agora ser corada com corantes sensíveis ao cálcio e à voltagem. Para preparar as células para a imagem, coloque o lamínula com a monocamada de células duplamente corada em uma câmara de circulação sobre um microscópio de fluorescência invertido. Ajuste a velocidade de fluxo através da câmara para manter a temperatura em 35 graus Celsius, com um gradiente de não mais que 0,3 graus Celsius ao longo da câmara.Passar solução salina de Hank livre de cálcio pela monocamada celular por cinco minutos para remover qualquer corante em excesso. Após lavar a monocamada, posicionar um eletrodo bipolar na solução o mais próximo possível da monocamada, sem tocar as células. Testar a saúde da monocamada de acordo com o protocolo descrito no texto.Para estimular o monocamada. Programe o eletrodo para administrar pulsos de largura de dois milissegundos por até 500 milissegundos por ciclo. Durante a estimulação da imagem do monocamada, visualize as células com uma objetiva de 40 x e excite os indicadores sensíveis ao cálcio e à voltagem.Usando uma fonte de luz LED acoplada a um filtro de excitação e a um espelho dicróico, passe a fluorescência emitida através de um espelho dicróico para separar os sinais sensíveis ao cálcio e à voltagem e colete os sinais fluorescentes separadamente com duas câmeras CCD. Image quatro áreas diferentes da monocamada para obter cobertura completa e tenha cuidado para registrar o sinal por menos de dois segundos em cada campo. Para evitar fotobranqueamento.Uma monocamada confluente de HL-1 exibe um ritmo regular de contração quando estimulada pelo eletrodo. Os sinais de voltagem e cálcio foram registrados durante uma única batida eletricamente estimulada da monocamada de HL-1 em um ciclo de 500 milissegundos; o início do sinal de voltagem ocorre logo antes da transiente de cálcio. Enquanto o sinal de cálcio persiste por mais tempo do que o sinal de voltagem na superfície.Mapas de intensidade foram gerados a partir dos sinais fluorescentes de voltagem e cálcio na monocamada de células HL. Durante um período de 200 milissegundos, o azul indica sinal baixo, enquanto o vermelho indica sinal alto. Ambos os sinais começam à esquerda da monocamada e se propagam através dela, atingindo a direita.Com o tempo, os potenciais de ação se propagam e retornam à linha de base muito mais rapidamente do que o sinal de cálcio Uma vez em massa. Este procedimento de mapeamento pode ser realizado em uma hora se for executado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar células que estejam na densidade ideal e ter cautela ao posicionar os eletrodos de estimulação para evitar danificar a monocamada.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar um mapa óptico de monocamadas de células atriais, utilizando corantes sensíveis ao cálcio e à voltagem.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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