Um método para selecionar Aptamers de comutação Estrutura Aplicado a um colorimétrico nanopartículas de ouro Assay
February 28th, 2015
Um protocolo é fornecido para selecionar aptâmeros de comutação de estrutura para alvos de moléculas pequenas com base em um método de seleção de esferas magnéticas de rigor ajustável. Os aptâmeros selecionados com propriedades de comutação de estrutura são benéficos para ensaios que requerem uma mudança conformacional para sinalizar a presença de um alvo, como o ensaio de nanopartículas de ouro descrito.
O objetivo geral do experimento a seguir é gerar apti de comutação de estrutura para integração como elementos de reconhecimento em plataformas de detecção que funcionam sinalizando uma mudança na confirmação do aptâmero na ligação do alvo. Isso é obtido adicionando uma sonda de captura biotinilada e uma biblioteca de DNA complementar aos grânulos magnéticos revestidos com tabina estreptocócica para imobilizar a biblioteca de DNA na superfície do grânulo. Em seguida, um ímã é aplicado à solução para particionar as sequências de ligação das sequências não ligadas restantes nas contas.
As sequências retidas são então purificadas e amplificadas para a próxima rodada de seleção. Após algumas rodadas de seleção, uma etapa de seleção negativa é adicionada ao processo. Após várias rodadas de seleção, o aptr selecionado demonstra uma mudança estrutural na ligação do alvo com base em um ensaio de detecção de alvo de nanopartículas de ouro.
A vantagem dessa técnica em relação às técnicas existentes, como a célula X baseada em solução, é que não precisamos imobilizar o alvo para um suporte sólido. Portanto, as implicações dessa técnica estão na avaliação de risco do estado fisiológico de um indivíduo, e isso se deve ao fato de que o cortisol é um indicador de estresse, o que pode levar à avaliação de problemas de saúde. Sempre use soluções de DNA recém-preparadas para este protocolo, especificamente para o alvo e controle.
A preparação do DNA requer atenção especial. Transfira uma alíquota de 100 microlitros da biblioteca de DNA para um tubo termociclador e aqueça-o a 95 graus Celsius por cinco minutos em um misturador térmico. Em seguida, transfira o tubo para o gelo até que seja necessário antes de usar este DNA determinar sua concentração exata em um espectrofotômetro.
Em seguida, prepare as esferas magnéticas, esferas magnéticas codificadas em vórtice e transfira 400 microlitros delas para um novo tubo de microcentrífuga. Coloque este tubo no ímã por dois minutos e remova o sobrenadante, depois lave as contas. Adicione 400 microlitros de tampão de ligação e os vórtice para completar a lavagem.
Use um ímã para separar as contas e descarte o sobrenadante. Repita este processo de lavagem três vezes. Em seguida, imobilize a sonda de captura nas esferas magnéticas.
Comece suspendendo as esferas e 400 microlitros de tampão de ligação com sonda de captura de 50 micromolares. Em seguida, incube as contas por 10 minutos com agitação suave em temperatura ambiente. Para remover a sonda de captura livre, lave os grânulos mais três vezes como antes, usando 400 microlitros de tampão de ligação por lavagem.
Após as três lavagens, adicione mais 400 microlitros de tampão e colete 100 microlitros de solução de esferas para as etapas restantes, economizando o restante a quatro graus Celsius. O restante pode ser usado para rodadas subsequentes de seleção por até três semanas. Quando mais esferas são necessárias, elas podem ser preparadas com sondas mais longas para maior rigor neste esquema de seleção.
Por exemplo, sondas mais longas foram usadas após a rodada 13, ponto em que um enriquecimento significativo foi alcançado usando outros rigores. Ao usar contas retiradas do armazenamento, comece lavando a alíquota de trabalho duas vezes, usando 200 microlitros de tampão de ligação por lavagem. Caso contrário, as contas recém-feitas já estão limpas.
Agora adicione 100 microlitros de DNA frio às esferas e incube-as por meia hora em temperatura ambiente com agitação suave. Após a incubação, isole as esferas antes de descartar o sobrenadante. Calcule a concentração de DNA contida para determinar quanto DNA está ligado às contas.
Em seguida, lave as contas três vezes com 200 microlitros de tampão de ligação. Deixe o tampão de encadernação lavar as contas com agitação suave por cinco minutos de cada vez. Em seguida, prepare a molécula alvo em tampão de ligação a 100 micromolares e ressuspenda as esferas em 200 microlitros desta preparação, a molécula alvo.
Nesse caso, o cortisol é tipicamente altamente concentrado na primeira rodada de seleção. Incube os grânulos com o alvo por meia hora com agitação suave em condições ambientais. Após a incubação, salve o snat que contém as sequências aludidas de destino.
Após cada duas rodadas de enriquecimento, colher uma amostra do sobrenadante final para monitorar o processo de monitoramento. Remova o cortisol do sobrenadante por diálise. Isso pode ser ignorado se a molécula-alvo não interferir na medição da absorbância do DNA a 260 nanômetros após cada rodada, amplificar o DNA de ligação ao alvo por PCR usando o sobrenadante coletado da etapa de seleção positiva como modelo.
Preliminarmente, sempre execute um pequeno teste de PCR para determinar o número ideal de amplificações. Pegue amostras de 10 microlitros após cada ciclo e compare as amostras com uma escada de 25 pares de bases. Aqui, a biblioteca deve ser executada em 85 pares de bases sobre produtos amplificados são vistos após o 10º ciclo, portanto, menos ciclos devem ser usados.
Esse resultado pode variar de rodada para rodada, portanto, um teste é sempre necessário. Em seguida, execute uma PCR em grande escala usando o número selecionado de ciclos usando oito tubos de tira. Amplifique de seis a oito mililitros de mistura de reação para obter a quantidade necessária de amplicon para a próxima rodada de seleção, que é entre um e 2,5 nanomoles de DNA.
Verifique novamente uma amostra dos produtos de PCR usando um gel. Em seguida, converta a maior parte dos produtos em DNA de fita simples usando esferas revestidas com strept não magnético. Carregue 300 microlitros de contas em uma pequena coluna bloqueada por fritz.
Em seguida, usando uma seringa de trava de isca, lave suavemente as contas com cinco mililitros de tampão de ligação. Ao trocar a solução para lavar a coluna, remova a seringa da coluna e remova o êmbolo da seringa. Isso evita perturbações desnecessárias dos grânulos.
Crie e lave colunas de contas suficientes para um mililitro de produto de PCR por coluna. Passe um produto de PCR pelas colunas usando uma leve pressão. Os produtos de DNA serão retidos pelas contas presas por seus fios anti-sentido.
Em seguida, lave as colunas ligadas ao DNA com cinco mililitros de tampão de ligação para remover todos os componentes do PCR, deixando apenas o DNA do pool de ligação para deshibridizar o DNA da coluna e adicione 0,5 mililitros de hidróxido de sódio 0,2 molar. Em seguida, dessalinizar o DNA de fita simples no eit usando uma coluna de dessalinização preparada com água livre de nuclease. Descarte os 0,5 mililitros iniciais de fluxo.
Em seguida, passe um mililitro de água livre de nuclease pela coluna para coletar o DNA dessalinizado. Meça a absorbância do DNA coletado e prepare-o para a próxima rodada de seleção. Conforme descrito no protocolo de texto, o DNA de fita simples coletado agora é adicionado de volta a uma alíquota recém-preparada de contas preparadas com sonda de captura.
A segunda rodada de seleção é semelhante à primeira, com uma concentração mais baixa de cortisol empregada. No entanto, a partir da terceira rodada, incorpore uma etapa de seleção negativa antes da seleção positiva. Para a primeira rodada de seleção negativa, adicione 200 microlitros de uma progesterona micromolar no tampão de ligação às contas.
É estruturalmente semelhante, mas distinto do cortisol. Nas rodadas subsequentes, aumente a concentração de progesterona depois de agitar suavemente a mistura por meia hora em temperatura ambiente. Descarte o supinado e lave as contas duas vezes usando 200 microlitros do tampão de ligação.
Em seguida, prossiga com a seleção positiva. Conforme descrito anteriormente à medida que as rodadas progridem, a concentração do substrato variou para afetar o rigor do processo de seleção. Os detalhes são discutidos no protocolo de texto.
Em seguida, siga o protocolo de texto para realizar o ensaio de nanopartículas de ouro para detecção de cortisol. Essa leitura métrica de cores rápida e direta depende de uma mudança estrutural do aptâmero na ligação do alvo. Assim, fornece uma métrica para avaliar a capacidade do método de selecionar abers com propriedades de troca de estrutura.
Outra vantagem do ensaio de nanopartículas de ouro é que ele amplifica um sinal de tal forma que um aptâmero de afinidade micromolar comum a pequenas moléculas pode ser detectado em níveis ordens de magnitude inferiores à constante de dissociação. O seguinte protocolo de seleção foi usado para isolar abers específicos para cortisol. O monitoramento de diálise e enriquecimento foi usado para mostrar aumento da eluição da molécula alvo após etapas de seleção posteriores.
Uma diminuição na eluição foi observada quando menos molécula alvo e sondas de captura mais longas foram usadas nas etapas finais. O sequenciamento de próxima geração foi usado para analisar o DNA iludido após várias rodadas diferentes. No início da sexta rodada de seleção, uma baixa porcentagem das sequências aumentou o número de cópias, que foi classificado em 20 caixas após 13 rodadas.
Uma porcentagem muito maior dos abers estava em alto número de cópias. Em seguida, tornando o processo de seleção mais rigoroso. Nas rodadas 14 e 15, quase metade dos abers selecionados estavam no primeiro nível de frequência do número de cópias.
Havia cerca de 3000 sequências únicas em 30.000 execuções neste momento. O AP selecionado foi incubado com nanopartículas de ouro seguido de adição de substratos alvo ou para comparação de controles. Este ensaio mostrou que o AP tinha mais especificidade para o cortisol do que para o ácido cólico ou para Durante a tentativa deste procedimento.
É importante controlar o rigor da seleção em cada rodada, bem como otimizar o número de ciclos de PCR. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como selecionar um AP de comutação de estrutura e realizar um ensaio de detecção de nanopartículas de ouro.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para a seleção de aptâmeros de mudança de estrutura para alvos de moléculas pequenas usando um método de seleção por contagem de contas magnéticas. Os aptâmeros selecionados exibem mudanças conformacionais após a ligação ao alvo, o que é vantajoso para ensaios de detecção.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Bioquímica
- Biologia Molecular
- Química Analítica
Fundo
- Aptâmeros são moléculas curtas de DNA ou RNA de fita simples que podem se ligar a alvos específicos.
- Aptâmeros de mudança de estrutura alteram a conformação após a ligação ao alvo, melhorando as capacidades de detecção.
- Ensaios com nanopartículas de ouro utilizam essas mudanças conformacionais para sinalização.
- Este método permite a detecção de moléculas pequenas sem imobilizar o alvo.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um protocolo para a seleção de aptâmeros de mudança de estrutura.
- Melhorar métodos de detecção para moléculas pequenas como o cortisol.
- Avaliar estados fisiológicos com base em indicadores de estresse.
Métodos Utilizados
- Sondas de captura biotiniladas e uma biblioteca de DNA complementar são utilizadas com contas magnéticas.
- A separação magnética é empregada para isolar sequências de ligação das não-ligantes.
- Múltiplas rodadas de seleção e amplificação são realizadas para enriquecer os aptâmeros desejados.
- Ensaios com nanopartículas de ouro são utilizados para demonstrar a funcionalidade dos aptâmeros.
Principais Resultados
- Seleção bem-sucedida de aptâmeros que exibem mudanças estruturais após a ligação ao alvo.
- Eficácia demonstrada na detecção de cortisol como indicador de estresse.
- O protocolo permite o uso de soluções de DNA recém-preparadas para resultados ideais.
- O enriquecimento de aptâmeros melhora com sondas mais longas e maior rigor.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para a seleção de aptâmeros de mudança de estrutura.
- Esses aptâmeros podem aumentar a sensibilidade dos ensaios para detecção de moléculas pequenas.
- A abordagem tem potenciais aplicações em avaliações de saúde relacionadas ao estresse.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This method enables the selection of structure-switching aptamers for small molecule targets without target immobilization, supporting biosensor development for physiological biomarkers. The approach enhances predictive confidence in target validation by enriching aptamers that undergo conformational change upon binding, reducing false positives from non-specific bead interactions. It provides a reusable discovery workflow for assay development in early-stage drug discovery, particularly for targets like cortisol where rapid, colorimetric readout is valuable for decentralized testing. The protocol’s emphasis on negative selection and probe length extension improves stringency, aiding in lead identification by minimizing background sequences and enriching high-affinity binders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by selecting aptamers that undergo target-induced conformational change, providing functional validation of binding specificity.
- Operational Value: Eliminates need for target immobilization, simplifying workflow and reducing artifacts from surface-based interactions.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by enriching sequences with demonstrable structural switching, increasing confidence in target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates aptamers compatible with gold nanoparticle assays, enabling quantitative, colorimetric readout for high-throughput screening.
- Operational Value: Produces standardized binding pools through repeated selection and amplification, improving assay reproducibility across runs.
- Scalability: Extended capture probe length after enrichment increases stringency, supporting reuse of the selection platform for multiple targets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Selected aptamers demonstrate detection capability in buffer, providing a foundation for extension to physiological fluids like saliva or sweat.
- Biomarker Alignment: Cortisol detection aligns with stress-related biomarker monitoring, relevant for assessing physiological state in preclinical safety studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Enrichment monitoring via elution and sequencing allows go/no-go decisions based on aptamer specificity and copy number frequency.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling progression from aptamer selection to functional assay development for small molecule detection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating aptamers that reflect target-induced structural changes, clarifying binding mechanism and specificity.
- Screening: Delivers assay-ready aptamers with demonstrated performance in colorimetric formats, enabling reliable compound or ligand evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs via gold nanoparticle signal shift, allowing comparison of binding conditions and enrichment progress.
- Translational Research: Connects to preclinical workflows through buffer-based proof-of-principle data, informing future adaptation to complex matrices.
- Enterprise Reuse: Magnetic bead selection with modifiable probe length creates a reusable platform for multiple small molecule targets, reducing redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by selecting aptamers with verifiable conformational switching, reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through negative selection steps and defined washing protocols, minimizing batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by enabling early assessment of aptamer functionality, reducing investment in non-viable candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through enrichment tracking and sequencing data, informing advancement based on copy number dominance and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling, magnetic bead separation, and PCR optimization to avoid amplification bias.
- Dependent on magnetic separation equipment, thermocyclers, and spectrophotometry for DNA quantification and quality control.
- Necessitates cross-team standardization of binding buffer conditions and negative selection compounds (e.g., progesterone) to ensure reproducibility.
- Adaptation to physiological fluids may require optimization of salt concentration and temperature to maintain aptamer stability and target binding.
- Practical limitation: Partitioning efficiency is constrained by keeping melting temperature near room temperature, necessitating multiple selection rounds to reduce background.
