Name: Um método para selecionar Aptamers de comutação Estrutura Aplicado a um colorimétrico nanopartículas de ouro Assay (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Aprenda a selecionar aptâmeros de comutação estrutural para detecção de pequenas moléculas como o cortisol usando contas magnéticas. Este método melhora a sensibilidade dos ensaios analíticos em bioquímica.

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Esta pesquisa foi realizada enquanto o autor (JAM) recebeu um Prêmio de Associação de Pesquisa do Conselho Nacional de Pesquisa nos Laboratórios de Pesquisa da Força Aérea. O co-autor MW recebeu uma Wright Scholar Fellowship apoiada pelo Escritório de Pesquisa Científica da Força Aérea. Este trabalho foi apoiado pelo Escritório de Pesquisa Científica da Força Aérea, Laboratório de Pesquisa da Força Aérea e Bio-X Strategic Technology Thrust.

1. Biblioteca e Primer Projeto e Síntese <ol><li> Projete a biblioteca inicial e primers (este tópico foi revisado em publicações anteriores extensivamente) 25,26. <ol><li> Sintetizar as seguintes sequências para este estudo, utilizando a química do fosforamidito padrão: Biblioteca: GAATGGATCCACATCCATGG-N 40 -TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTTGACGAA Primer Forward: GGAATGGATCCACATCCATGG Primer reversa: Biotina-AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA </li><li> Conceber as sondas de captura de cDNA para ser complementar à região 5 &#39;da biblioteca. Escolher o comprimento inicial por análise de software de temperatura de fusão em linha para proporcionar uma temperatura de fusão ligeiramente acima RT, com cada base subsequente fornecimento de um aumento da temperatura de fusão. mer Captura Probe: CCATTCC-Biotina mer Captura Probe: TCCATTCC-Biotina mer Captura Probe: ATCCATTCC-Biotina </li></ol></li><li> Purifica-se a biblioteca por HPLC padrão. A dessalinização é suficiente para os iniciadores e sondas de captura. Reconstituir oligonucleótidos em água livre de nuclease na concentração desejada e armazenar a -20 ° C durante até vários meses. </li></ol> 2. Tampão, Biblioteca, e Preparação de Amostras <ol><li> Preparar 500 ml de tampão ou em água Millipore grau livre de nuclease, com concentrações de 50 mM Tris, 137 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, pH 7,4. Filtra-se o tampão através de uma membrana de 0,2 um estéril; armazenamento é possível em condições ambientes durante meses. <ol><li> Em alternativa, utilizar outros tampões tais como PBS (tampão fosfato salino), HEPES (ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico), etc. </li></ol></li><li> Configure dois thermomixers; definir uma a 95 ° C e manter o outro em condições ambiente (~ 20 ° C no presente trabalho). Prepare um balde de gelo. </li><li> O calor / pressão arrefecer a biblioteca de ADN, colocando biblioteca 100 ul (~ 2,5 nmol por 10 15 -10 16 sequências) na termomisturador definir umt 95 ° C durante 5 min. Colocar o tubo no gelo enquanto as esferas magnéticas são preparados (seções 3.1-3.6). Determinar a concentração real da biblioteca de ADN por absorção de UV a λ = 260 nm, e aplicando o factor de conversão apropriada para a biblioteca. </li><li> Preparar as soluções de reserva alvo num meio apropriado para a solubilidade alvo. <ol><li> Prepare 100 ações de analitos mM em DMSO. Estas reservas são viáveis ​​durante aproximadamente 1 mês, quando armazenada à temperatura ambiente, mas diferentes objectivos demonstrar diferentes perfis de degradação. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de grânulos magnéticos e rodada inicial de Seleção <ol><li> Vortex 6,7 x 10 8 / mL de esferas de esferas magnéticas revestidas com estreptavidina e remover 400 ul a um tubo de microcentrífuga novo. Colocar o tubo sobre o magnete durante 2 min e remove-se o sobrenadante. </li><li> Lavar os grânulos por adição de 400 ul de tampão de ligação, vortex, e aspirando o sobrenadante após a colocaçãoo tubo sobre o magneto para separar os grânulos. Repita esse processo três vezes. </li><li> Imobilizar a sonda de captura sobre as esferas magnéticas as pérolas por ressuspensão em 400 ul de tampão de ligação com 50 uM de sonda de captura (final) e incubou-se durante 10 min com agitação suave na termomisturador a condições ambientes. </li><li> Lave as contas três vezes com 400 mL de tampão de ligação, repetindo os passos de lavagem descritos na seção 3.2 para remover sonda de captura livre. </li><li> Ressuspender as contas em 400 mL de tampão de ligação. Retirar 100 ul da solução de grânulo para as etapas seguintes, e reter os restantes 300 ul a 4 ° C até ser usado para outras rondas de selecção para um máximo de três semanas. </li><li> Lave as contas duas vezes com 200 mL de tampão de ligação, tal como descrito no ponto 3.2. </li><li> Adicionar 100 ul de ADN de encaixe arrefecido secção 2.3 para as pérolas lavadas e incubar durante 30 min com agitação suave usando o termomisturador a condições ambientes. NOTA: As concentrações de DNA nas primeiras rodadas são mais elevados do que a de rodadas subseqüentes para minimizar a perda de sequência nas rodadas anteriores, onde sequências únicas são teoricamente presente. </li><li> Quantificar o ADN no sobrenadante utilizando a absorção de UV como na secção 2.3 e subtrair este a partir da quantidade inicial adicionado na secção 3.7 para avaliar a quantidade de ADN ligada às pérolas. <ol><li> Lavam-se as esferas com 200 ul de tampão, seguido por duas lavagens adicionais com 200 ul de tampão de ligação, com agitação suave num termomisturador durante 5 minutos nas condições ambientes de ligação. </li></ol></li><li> Ressuspender as pérolas em 200 ul de 100 uM alvo diluído em tampão de ligação, e girar sobre a termomisturador durante 30 minutos nas condições ambientes. Preparar as soluções de trabalho fresca no início de cada dia, antes da selecção porque foram observadas e o controlo alvo para agregar-se da solução aquosa ao longo do tempo. Manter a solução do sobrenadante que contém a sequência-alvo eluidas para um estudo mais aprofundado. </li><li> Realizar a selecção negativa após a conclusão de 1-2 rodadas adicionando 200 ul de 1 uM de progesterona para as pérolas preparadas no ponto 3.8.1. Agitar suavemente durante 30 min no termomisturador a condições ambientes. </li><li> Utilizar o suporte magnético para capturar os grânulos e descartar o sobrenadante, lavagem das pérolas duas vezes em 200 ul de tampão antes da adição de cortisol de ligação como na secção 3.9. </li></ol> 4. Acompanhamento Enrichment, PCR, e Single-stranded DNA Generation <ol><li> Adicionar a solução de sobrenadante para uma cassete de diálise para monitorizar o enriquecimento selecção. A diálise é necessário remover o cortisol a partir do ADN eluído porque cortisol está presente em concentrações muito mais elevadas do que o ADN e também tem um pico de absorção de UV, que se sobrepõe ao padrão de ADN λ UV máx = 260 nm. <ol><li> Execute esta etapa todos os outros rodada (rounds 2, 4, 6, e 8) nas primeiras rodadas de seleção. Isso reduz amostra loss quando potencialmente alguns números de cópias de cada sequência estão presentes (maior diversidade). Para obter resultados mais rápidos, métodos alternativos, tais como colunas de exclusão de tamanho podem ser utilizadas, bem. </li></ol></li><li> Dialisar cassete com amostra fresca em 250 ml de tampão de ligação, durante 2 horas em condições ambientais duas vezes. Substituir tampão e incubar a 4 ° CO / N. </li><li> Analise da piscina dialisada por espectroscopia de UV para determinar a percentagem de ADN eluído por o alvo (comparar com os resultados de secção 3.8). </li><li> Preparar um gel de agarose a 3% com 1% w / v de brometo de etídio. Neste trabalho, preparar a partir de um gel de agarose a 1,5 g, 50 ml de tampão TAE (40 mM de Tris-Acetato, EDTA 1 mM, pH = 8,0), e 10 ul de brometo de etídio. </li><li> Ciclo-optimizar a piscina dialisada através da realização de uma pequena escala de PCR (5 x 50 mL alíquotas) usando ~ 5-15 ciclos. Para os componentes de PCR, utilizar 1x tampão de PCR reaccional (todas as concentrações finais), 200 uM de dNTP, 10% de volume de reacção de DNA molde, 500 nM de cada iniciador, e 2,5U polimerase (2,5 L estoque / l). <ol><li> Executar PCR utilizando condições optimizadas, a 95 ° C durante 2 min, seguido de repetidos ciclos de 95 ° C (30 segundos), 55 ° C (30 s) e 72 ° C (1 min), seguida de 72 ° C (10 min) de extensão final e mantenha a 4 ° C. </li><li> Empregar uma escada padrão 25 pb para comparação e visualizar em um imager gel. Selecione o número de ciclos que produz a banda intensidade maior no marcador tamanho correto, sem subprodutos indesejáveis. </li><li> Analisar os resultados da optimização do ciclo através da combinação de 10 ul de cada ciclo de PCR com 2 ul de corante de carga de 6x azul / laranja, e o carregamento na 5 cavidades separadas do gel de agarose a 3%, preparado no passo 4.4 (125 V durante 45 min). </li></ol></li><li> Realize uma PCR em larga escala utilizando as condições e número do ciclo adequado determinado no ponto 4.5. Tipicamente 6-8 ml de reacções de PCR foram requeridos para obter o 1-2,5 nmol utilizado para cada rodada nesta selecção. Utilize tubos de 8 tiras para simplificarmanipulação dos diversos tubos necessários para este volume aliquotar para amplificação por PCR. </li><li> Preparar um gel de agarose a 3% como descrito na seção 4.4, e validar que a banda PCR aparece no local correto, seguindo os passos das secções 4.5.2-4.5.3. </li><li> Converso todo o produto de cadeia dupla de DNA secção 4.7 para DNA de cadeia simples por os passos descritos abaixo: <ol><li> Adicionar 300 ul de contas revestidas com estreptavidina (não magnético) a uma pequena coluna bloqueada por fritas. Lave as contas com 5 ml de tampão de ligação, anexando uma seringa luer-lock e aplicar pressão suave para o êmbolo. Remover a seringa a partir da coluna e remover o êmbolo da seringa fora de linha após a adição de cada material de modo que os grânulos não são perturbados por aspiração do êmbolo. </li><li> Adicione o produto de PCR e passá-lo através da coluna usando uma leve pressão sobre o êmbolo. Use várias colunas de modo a que não mais de 1-1,2 ml de produto de PCR é adicionado a cada coluna. Descarte a fl definitivaow através de uma vez que o ADN será retido na coluna por a porção de biotina na cadeia anti-sentido. </li><li> Lavar a coluna com 5 ml de tampão de ligação. </li><li> Dehybridize o DNA pela adição de 0,5 ml de 0,2 M de NaOH. Reter o fluido, pois ele contém o single DNA sentido encalhado. </li></ol></li><li> Dessalinizar a ssDNA em NaOH 0,2 M, adicionando os 0,5 ml a uma coluna de dessalinização preparado por uma lavagem com água livre de nuclease. Descarte a 0,5 ml de fluido inicial, em seguida, adicione água livre 1 ml nuclease e recolher essa amostra ssDNA dessalinizada. O uso de múltiplas colunas de dessalinização será requerido para cada 0,5 ml porção. <ol><li> Determinar a concentração de ADN eluído por absorção de UV a 260 nm = λ. </li><li> Aspirador de secar a amostra e reconstituir num volume apropriado de tampão de ligação. Se não havia DNA suficiente obtida para a próxima rodada de seleção, repita seções 4.6-4.9.2. </li></ol></li></ol> 5. rodadas subseqüentes de Seleção e Seqüenciamento <ol><li> Ajuste o rigor das condições de seleção, dependendo dos resultados da monitorização de enriquecimento (seção 4.1). Geralmente, tornar as condições mais rigorosas em sucessivas fases de selecção, a fim de selecionar o mais alto ligante de afinidade da piscina. NOTA: Este pode envolver uma combinação de aumentar a concentração de ADN, aumentando o número, a hora, ou o volume dos passos de lavagem, diminuindo a concentração de alvo, aumentando a concentração do composto-selecção negativa, ou uma variedade de outros métodos 27. <ol><li> Aplicar um controlo adequado, como apropriado para garantir a especificidade das sequências para a molécula alvo. Neste trabalho, aplicar uma molécula de selecção negativa (progesterona) para o sistema (Tabela 1), com início na ronda 3, e o aumento na concentração de toda a selecção. A partir de 11 rodada, pré-incubar a piscina DNA para 30 min com 10-20 mM progesterona antes da imobilização sobre as contas (antes da seção 3.7). </li&gt; <li> Aumentar o comprimento da sonda de captura após enriquecimento máxima é observada. </li></ol></li><li> Prepare a piscina final (rodada 15) e outras piscinas representando maximamente enriquecido (round 13) e minimamente enriquecido (redondo de 6) As condições para a sequenciação por PCR com oligonucleotídeos compatíveis e uma polimerase de alta fidelidade. <ol><li> Configurar um volume de 50 mL de reação utilizando concentrações finais de 1x (tampão de reação), 200 um (cada dNTP), 400 nm (cada primers), 0,5 l de piscina DNA e 0,5 l de polimerase. Ciclo optimizar para cada rodada utilizando os passos descritos na secção 4.5, utilizando as mesmas condições de PCR, com a excepção de um porão 7 min a 72 ° C durante a extensão final. </li><li> Enviar 50 ul de piscinas preparadas para uma instalação de seqüenciamento em microtubos com tampas bem vedadas com filme não adesiva. Colocar os tubos em um tubo de 15 ml embalado com plástico bolha e navio O / N com compressas de gelo para a instalação de seqüenciamento. </li></ol&gt; </li><li> Determinar o número de cópias de cada sequência a avaliar o enriquecimento da piscina sequenciado (s). <ol><li> Use o código-escrita / classificação etapas (Veja Complementar arquivo de código) para dados de sequenciamento de próxima geração no formato FASTA para determinar os números de freqüência / cópia de cada sequência repetida nos dados de todos os pools fornecidos pelo serviço de sequenciação: </li></ol></li><li> Analisar a especificidade e afinidade das sequências maior número de cópias. O tipo de interacção (proteína ou molécula pequena), as propriedades estruturais do aptâmero após ligação, e a afinidade esperada ditará qual o método é adequado. Este tópico é revisado em mais detalhes em um número de referências 1,28-30. </li></ol> 6. Síntese e AUNP Detecção <ol><li> Sintetizar os AuNPs usando o método de redução de citrato de 21. Misturar 98 ml de água Millipore com 2 ml de HAuCl 4 50 mM e de calor até à ebulição. </li><li> Adicionar 10 ml de citrato de sódio 38,8 mM comoLogo que se inicia o refluxo. Cor muda para uma cor vermelha após alguns minutos. Continuar a agitar a solução durante 20 minutos com a libertação de calor. </li><li> Permitir que a solução AUNP arrefecer até à TA e filtrar através de uma membrana de 0,2 um poliéster. Guarde todas as suspensões AUNP em uma garrafa âmbar escuro. </li><li> Calcular a concentração AUNP por absorção de UV, utilizando o coeficiente de extinção de 2,4 x 10 8 L mol -1 cm -1 31. A concentração foi de 10 nm de este trabalho, com um tamanho de 17 ± 0,6 nm determinada pela luz dinâmica de espalhamento 21. </li><li> Incubar o ADN com 10 nM AUNP durante 1 h a condições ambientes protegidos por uma folha de alumínio. Variar o volume de AUNP para fornecer a solução suficiente para permitir que todos os testes desejados para ser executada (~ 1-2 ml). As densidades de carga de 73, (moléculas de DNA por AUNP) 120 e 200 D / NP foram examinados neste trabalho, eo volume e concentração varia de acordo. </li><li> Dilui-se a solução de ADN / AUNP 1: 1 utilizando HEPES tampão (20 mM de HEPES, 2 mM de MgCl2, pH = 7,4). Permitir que a mistura se equilibre a TA coberto por folha de alumínio. NOTA: O tempo necessário para este passo terá de ser optimizada pelo pesquisador. Neste trabalho, os tempos que vão de vários minutos a S / N foram investigadas. </li><li> Prepare analito (cortisol, ácido eólico, 2 -metoxinaftaleno) soluções estoque em 100 mM em DMSO e cubra com papel alumínio. Adicione soluções iniciais fresco antes de cada experiência por diluição do stock de 100 uM numa diluição do tampão de ligação de cortisol (secção 2.1) 1/3. Diluir a solução inicial com o tampão de ligação 1/3 de tal modo que um volume constante (10 ul) de destino é adicionado para gerar uma gama de concentrações. </li><li> Optimizar a concentração de sal requerida pela adição de 80 ul da solução de ADN / AUNP com 10 ul de tampão de ligação 1/3 (referido como o &quot;branco&quot;). <ol><li> Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente, em seguida, adicionar diferentes volumes de NaCl solutde iões. Olhar para o volume de sal que induz uma mudança mal visualmente perceptível para uma cor azul após adição de sal (13-40 ul de 1 M de NaCl utilizado neste trabalho). Isto fornece um bom ponto de partida, mas pode precisar de mais ajustes na sequência dos resultados, incluindo adição de destino. </li></ol></li><li> Combinar 80 ul da solução de ADN / AUNP com 10 ul da solução de destino e incubar durante 20 min à temperatura ambiente. Utilizar uma placa de 96 poços e pipeta de canais múltiplos para analisar várias concentrações alvo em simultâneo, compreendendo sempre um espaço em branco (ponto 6.8). <ol><li> Adicionar o volume apropriado de solução de NaCl (13 mL de 1 M de NaCl foi utilizado neste trabalho) e analisar imediatamente a absorvância a 650 e 530 nm utilizando um leitor de placas. </li></ol></li><li> Traçar os resultados como a relação dos valores de absorvância (650 E / E 530) versus a concentração de alvo normalizado em relação à medição em branco. </li></ol>

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Declaração de Distribuição A: Aprovado para publicação; distribuição é ilimitada (88 ABW-2014-4103). Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O fato de que pequenas moléculas são de interesse biológico, mas constituem apenas 19% de todos os aptâmeros relatados torna métodos concebidos para a seleção de aptâmeros que são aplicáveis ​​a pequenas moléculas de grande importância. SELEX de moléculas pequenas é particularmente difícil uma vez que menos grupos funcionais, motivos estruturais, e a área de superfície estão disponíveis para interacção com as sequências de proteínas, em comparação com uma, e estima-se que menos do que 30% de todas as selecções para alvos tentativas resultaram em um aptâmero 38. Portanto, é preciso ser excepcionalmente consciente de concepção experimental e a execução a fim de seleccionar com sucesso um aptâmero a uma pequena molécula alvo. O método de selecção aptâmero descrito neste trabalho é vantajoso porque é aplicável a pequenas moléculas, sem necessidade de qualquer modificação química as quais podem alterar as suas propriedades de ligação. É também eluição com base, o que significa que uma vez que tADN que, em vez do alvo, é inicialmente ligado, em seguida, eluiu-se a partir das esferas magnéticas por o alvo, o ADN que interage com a matriz de pérolas não será amplificado para a próxima ronda de selecção porque ligantes para a molécula de interesse são libertadas para o sobrenadante tampão e ligantes de matriz inespecíficos permanecer vinculado. Por outro lado, é necessário um método de selecção negativa contra a matriz por métodos que imobilizam o alvo ao suporte sólido, cada rodada porque o ADN que interage com a matriz vai ser amplificado em adição aos ligantes alvo 1. O método atual foi concebido como uma estratégia de seleção limitada T m. Isto significa que a T m do cDNA / piscina hibridação foi mantida junto à RT. Morse utilizada uma estratégia semelhante, mas aplicada uma sonda de ADNc de 6-mer com uma T m &lt;10 ° C com condições de selecção, a 4 ° C 17. O nosso pedido era de um ensaio biosensoriamento realizada à temperatura ambiente, de modo que o comprimento do ADNc foi ajustada de acordoly. Isso mantém o rigor da selecção suficientemente baixo de modo que os potenciais ligantes não sejam perdidos por causa da interacção de ligação alvo ocorre num local remoto que não induz uma mudança conformacional capaz de destruir a ligação de cDNA. No entanto, a eficiência de particionamento do método proposto é baixa porque algumas sequências vai dehybridize unicamente com base em termodinâmica. Em contraste, Nutiu et al. Aplicado um ADNc de 15-mer, e eram apenas capazes de identificar aptâmeros para dois dos quatro alvos, possivelmente porque a T m do 15-mer foi demasiado elevada para permitir uma libertação por uma pequena molécula alvo 18. Portanto, enquanto que a estratégia de selecção actual exigirá muitas rodadas para remover as sequências de fundo, através do controlo do rigor da selecção e minimizar a perda de ligantes potenciais a probabilidade de sucesso vai ser aumentada. Muitos pesquisadores novos para seleção aptamer não têm conhecimento de aspectos importantes relacionados com a PCR depotenciais ligantes. Optimização do ciclo (secção 4.5) é necessária porque o excesso de amplificação de bibliotecas de ADN produz subprodutos não desejados (tipicamente maiores em tamanho) em números elevados de ciclo, e o produto desejado pode desaparecer completamente com um excesso de apenas 5 ciclos 39. No caso de excesso de amplificação, os produtos de PCR já não representam as sequências eluídas pelo alvo, e as possibilidades de sucesso selecção são significativamente diminuída. A Figura 4 ilustra um exemplo de ciclo de optimização rodada 5 neste trabalho. O ciclo menor produz um produto mínima banda, os aumentos da banda em montante a 8 ciclos; em 10 ciclos a banda inicia uma transição para um excesso de amplificação do produto de tamanho maior, e é quase inteiramente constituída do produto amplificado ao longo-prazo de 12 ciclos. Outro detalhe que muitos pesquisadores inexperientes em SELEX pode ignorar é que todo o conjunto deve ser ampliado em grande escala amplificação PCR (secção 4.6) no first rodada para atenuar a perda de ligantes. O número de sequências únicas possíveis a partir de oligonucleótidos 4 é N, onde 4 representa as quatro bases de ácido nucleico, e N é o número de bases da região aleatória da biblioteca. Para este trabalho, N = 40, o que resulta em um espaço de sequências de 1,2 x 10 24 possíveis sequências únicas. A 2,5 nmol de biblioteca utilizada no primeiro ciclo de selecção corresponde a 10 ~ 15 moléculas, o que significa que cada cópia de ADN é provável representado no conjunto inicial como uma sequência única. Portanto, todo o volume de DNA eluído das contas de pelo destino deve ser ampliada para manter uma cópia de cada pasta potencial para a próxima rodada de seleção. Uma vez que esta amplificação inicial ocorreu, várias cópias estão disponíveis para seleção nas rodadas seguintes, onde uma solução homogénea é assumida por amostragem. A concentração de destino também deve ser cuidadosamente considerado em cada rodada. Nutiu et al. Usoconcentração da meta de 1 mM durante todo o processo de seleção, e selecionou um aptamer ATP com K d = 600? M 18. Tanto a corrente de trabalho e a pesquisa de Morse 17 começou com 100 uM alvo, diminuindo ao longo do curso da selecção, e resultou em aptâmeros com afinidades micromolares baixas. Exatamente o que ronda o rigor deve ser aumentado (menor concentração da meta) depende de quando o enriquecimento é observado. Um outro passo crucial é a aplicação de medidas adequadas de selecção negativa de modo aptâmeros demonstrar especificidade para a molécula alvo. Quais controles são usados ​​está condicionada à aplicação pretendida do aptamer selecionado. Por exemplo, aptâmero 15-1 foi concebido para funcionar como um elemento de reconhecimento num ensaio biosensoriamento para o cortisol, assim progesterona foi usado como uma molécula de selecção negativa, porque é um precursor metabólico para o cortisol, que é encontrado nos fluidos fisiológicos 40. O aptâmero ATP seleccionado por Nutiu et al. &lt;/ Em&gt; não incluir uma etapa de seleção negativa, e interage com moléculas estruturalmente semelhantes, incluindo ADP, AMP, a adenosina, e dATP 18. Uma nota final para a consideração é que o ensaio AUNP muitas vezes requer otimização considerável para cada par aptamer / target. Olhando para o volume de sal que induz uma mudança mal visualmente perceptível em direção a uma tonalidade azul após a adição de sal é um bom ponto de partida, mas o ajuste do ponto de partida pode ser obrigado a observar a resposta. Também se verificou que o ensaio produz drasticamente diferentes respostas dependendo da concentração de tampão (o tampão de selecção pode exigir a diluição devido a elevada concentração de sais de tampões, muitas vezes origina a agregação) e composição, o grau de cobertura de DNA (Figura 3), a preparação da amostra (alguns orgânica Os solventes utilizados para dissolver o alvo pode causar um fundo alta que as máscaras de alvo de resposta), temperatura, tipo de sal e concentração, e incubatempo mento (de ambos DNA com AUNP e DNA / AUNP com alvo). Sob condições totalmente optimizadas, os resultados são tipicamente observados com um tempo de incubação de destino &lt;5 min, demonstrando o benefício de uma resposta rápida alvo da plataforma biosensoriamento AUNP. Por exemplo, na Figura 5, o tempo de incubação do aptâmero / AUNP passo foi reduzido a partir de O / N (Figura 3) e 30 min, e sal foi adicionado imediatamente (&lt;10 segundos), após a adição de destino, em vez de 20 minutos mais tarde (Figura 3 ) a uma densidade de carga de 73 D / NP. Isto aumentou a resposta de cortisol para ~ 82% mais elevado do que o espaço em branco (Figura 5A) numa concentração de 10 fiM contra o alvo ~ 40%, utilizando as condições anteriores (Figura 3). Esta resposta pode ser distinguidas a olho nu (Figura 5B). Note-se que o intervalo de linearidade da detecção de cortisol é diferente do que utilizando as condições anteriores, sugerindo que estas condições podem ser optimizadas para um desejadoalcance de detecção. Ácido eólico e 2-metoxinaftaleno (2MNP) controlos não produziu uma resposta significativa (Figuras 5A-B). Os pesquisadores devem estar cientes de que a redução destes tempos de incubação pode facilitar a resposta aumentada de analitos com a superfície do AUNP, que podem contribuir para o sinal global aprimorada (alvo) ou fundo (moléculas não-alvo). Portanto, cuidado AUNP desenho do ensaio e desempenho caracterização é necessário para cada par aptamer / target. Este processo descreve um protocolo para a selecção de pequenas estrutura de comutação de aptâmeros de moléculas que funcionam de uma plataforma biosensoriamento tais como o ensaio descrito AUNP, que requerem uma alteração de conformação do ADN para detectar a presença do alvo. No entanto, este método pode ser aplicado a outros sistemas de biossensores, tais como electroquímica ou fluorescência que funcionam na mesma premissa para virtualmente qualquer tamanho alvo. O poder do protocolo pode ser desenvolvido experimentalmente porvárias abordagens. Em primeiro lugar, o próprio processo de selecção pode ser potencialmente melhoradas através da investigação de métodos de optimização, tais como a determinação do ideal T m do cDNA / biblioteca de hibridação que proporciona uma interacção que é suficientemente fraca para interagir com uma pequena molécula alvo, mas suficientemente forte para reduzir a quantidade de fundo dehybridized exclusivamente a partir de sequências de termodinâmica. Isto vai condensar o número de ciclos necessários para a selecção, o horário de trabalho e em reduzir o consumo de reagente. Outras investigações sobre modificações ao selecção seria para determinar as concentrações mais favoráveis ​​de grânulos e de ADN, de modo que uma população diversa de sequências é exposta ao alvo, especialmente na primeira ronda. O sucesso desses experimentos de prova de princípio fornecer uma base para investir mais recursos para otimizar e adaptar o ensaio tampão AUNP de fluidos fisiológicos. Há uma necessidade legítima de uma plataforma biosensing rápida, robusta que pode function como uma ferramenta de diagnóstico do estado fisiológico de um indivíduo, e um maior desenvolvimento do ensaio AUNP no soro humano, suor ou saliva iria atender a uma esta lacuna atual.

Pequenas moléculas têm sido reconhecidos como desempenhando um papel vital em diversos processos biológicos, tais como toxicidade fisiológica ou nutrição, a sinalização celular e tratamentos farmacêuticos como a doença 1. Várias moléculas pequenas também têm sido sugeridos como biomarcadores indicativos de condições fisiológicas, incluindo o stress 2,3, fadiga 4, 5 e doença. Por exemplo, os níveis elevados de cortisol correlacionar com o stress, que pode resultar na diminuição do desempenho fisiológico e outras condições de saúde 6-8. Da mesma forma, as variações nas proporções de certos péptidos na saliva são preditivos de fadiga, onde manifestações fisiológicas incluem falta de concentração, tempo de reacção prejudicada, e redução da função cognitiva 4. Portanto, o desenvolvimento de biossensores específicos para o alvo para monitorar os níveis de moléculas pequenas pode proporcionar uma métrica de valor inestimável para avaliar as capacidades de saúde e de desempenho de um individual. Historicamente, a pequena molécula de detecção foi realizada por técnicas de separação de trabalho intensivo, ou por reconhecimento baseado em anticorpos 6,7. Mais recentemente, os aptâmeros de ácidos nucleicos 9,10 surgiram como elementos de reconhecimento que possuem vantagens distintas sobre os anticorpos em aplicações específicas. Com a sua capacidade de se ligar a um alvo que variam entre os íons metálicos 11 para tecidos 12, aptâmeros têm sido amplamente empregados como elementos de reconhecimento em plataformas biosensoriamento 13,14. Em comparação com anticorpos, aptâmeros são quimicamente sintetizados, e é, por conseguinte, simples de introduzir modificações químicas reprodutíveis para imobilização superfície ou relatórios. Aptamers podem ser selecionados com alta especificidade alvo nas condições desejadas, modificando as condições de selecção utilizados, enquanto que os anticorpos são limitados a condições fisiológicas 15,16. Além disso, aptâmeros são capazes de mais elevada densidade de ligando devido ao thEIR tamanho menor, resultando em maior eficiência alvo de sinalização em uma plataforma biosensor, ea maior estabilidade de aptâmeros permite o uso repetido e armazenamento do sensor de longo prazo 16. Os aptâmeros são gerados utilizando um procedimento conhecido como SELEX, em que uma biblioteca inicial de sequências é desenvolvida a partir de 10 13 -10 15 moléculas únicas de piscina definitiva enriquecido contendo vários (1 10 2) -10 sequências com potencial para se ligar à molécula alvo. A piscina é, em seguida, enriquecido definitiva sequenciado, e as constantes de dissociação K (d) são obtidos a partir de ensaios de as sequências mais elevados do número de cópias de ligação com a molécula alvo. Evolução da piscina para uma população final enriquecido é seguido por monitorização da percentagem da ligação do alvo em cada ronda piscina, até enriquecimento máximo é obtido. Isso ocorre ao longo de um número de rodadas evolutivos, onde sequências de ligação são divididas de nonbinders e amplacidificado utilizando a reacção em cadeia da polimerase (PCR). A capacidade de criar partições e manter efetivamente ligantes é um dos principais determinantes da eficiência da seleção e impacta diretamente as características dos aptâmeros selecionados 15. A etapa de particionamento SELEX é mais desafiador para as moléculas pequenas, uma vez que não possuem o tamanho ou a variedade de grupos funcionais que auxiliam o processo de particionamento de metas de proteína 1,15. Por exemplo, muitas plataformas de separação de proteínas dependem de tamanho ou de separação à base de carga, no entanto as propriedades de complexos ligados alvo da molécula de ADN não-pequenas são geralmente significativamente diferente do que a de sequências não ligantes, resultando em um particionamento ineficaz. Métodos alternativos de separação de SELEX pode envolver a imobilização ou a rotulagem do alvo, o que potencialmente alterar as características de ligação de uma molécula pequena. Consequentemente, o design de um processo de selecção para gerar aptâmeros para pequena molécula alvo requires consideração especial. Uma variedade de modificações têm sido aplicados com a metodologia SELEX original para aumentar a eficiência do processo de particionamento, melhorar a afinidade ou especificidade das sequências no conjunto final, ou torná-la mais receptiva a diferentes aplicações 15,16. Uma modificação SELEX capaz de seleccionar para pequenas moléculas foi concebido para gerar a estrutura de comutação de aptâmeros, ou aptâmeros que sofrem uma alteração conformacional após interacção com a molécula alvo 17,18. Num exemplo deste método, a biblioteca é hibridizado com um pequeno pedaço de DNA complementar não ligante (cDNA) imobilizado sobre esferas magnéticas 17. Após a ligação ao alvo, a mudança conformacional de sequências de ligação permite-lhes dehybridize a partir do ADNc, libertando-as para dentro da solução sobrenadante, enquanto os restantes nonbinders hibridado com o ADNc / grânulos são magneticamente e repartiu descartado. Este método é vantajosa para moléculas pequenas, pois não requer a imobilização ou a rotulagem de a molécula alvo para conseguir a separação. Aptâmeros que são capazes de estrutura de comutação de possuir uma característica valiosa para qualquer plataforma biossensor potencial que requer uma mudança na estrutura aptâmero para detectar a presença de uma molécula alvo. Especificamente, aptâmeros podem ser combinados com nanopartículas de ouro (AuNPs) para criar ensaios que funcionam com base no princípio da estrutura de comutação para produzir uma resposta colorimétrica na presença de molécula alvo após desafio sal 19,20. Num ensaio AUNP, o aptâmero de DNA de cadeia simples (ssDNA) inicialmente adsorve à superfície da AUNP e protege-lo do desafio sal. A presença do alvo induz uma alteração conformacional na aptâmero que expõe a superfície AUNP, resultando numa mudança de cor vermelho-para-azul a seguir à adição de sal. AUNP ensaios também foram exibidas para amplificar o sinal, no qual a afinidade micromolar aptâmeros pode detectar níveis alvo em ordens de magnitude inferior à constante de dissociação (K d) 21. Esse recurso é especialmente atraente para os alvos de moléculas pequenas, onde afinidades normalmente variam de baixo micromolar a concentrações milimolares 1,15. Geralmente, o ensaio também é relativamente rápido e simples de realizar, encorajar a continuação estudo de ensaios aptâmero-AUNP como plataformas de detecção de biossensor. O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo universal para a seleção de mudança de estrutura aptâmeros de pequenas moléculas para aplicações biosensoriamento utilizando o cortisol marcador de stress como uma molécula representante. Um esquema de detecção biosensor AUNP é de interesse devido à sua simplicidade de operação e leitura colorimétrica, mas de mudança de estrutura aptâmeros são aplicáveis ​​às saídas da plataforma de detecção alternativos, como eletroquímica 22 ou 23 de fluorescência, que também permitem a detecção através de uma mudança na aptamer conformation em cima meta vinculativa. Comparado com os métodos anteriores, várias etapas de seleção negativos foram incorporados ao projeto 17,18, e um esquema simples de detecção de enriquecimento à base de UV foi implementado (Figura 1). Este protocolo está em contraste com o esquema de detecção de enriquecimento radioligando utilizado em métodos herdados 17. O método proposto também incorporado um aumento no comprimento das sondas de captura de ADNc utilizadas na selecção para aumentar a eficiência de separação e ajustar eficazmente o rigor da selecção após enriquecimento máxima foi observada 24. O chumbo rigor sintonizado numa percentagem total inferior de DNA eluição pela alvo na piscina final, mas resultou em números de cópias mais altos de uma seqüência que prendiam com afinidade melhorada em comparação com o número de seqüência de cópia mais alta de um primeiro turno. O número de sequência mais elevada cópia da piscina final foi aplicado a um ensaio AUNP para ilustrar que a sequência era passível de uma plataformaque requer uma mudança estrutural para indicar meta vinculativa. Este tampão de ensaio baseado mostra que a resposta do ensaio AUNP pode ser modificada alterando a densidade de ADN aplicados à superfície, e serve como prova de princípio de trabalho de dedicar futuros esforços de investigação para o desenvolvimento de pequenas moléculas à base de aptâmeros biossensores em AUNP fluidos fisiológicos.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads M280 Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>112.06D</td><td>Compatível com DynaMag-2</td></tr><tr><td>Magnet DynaMag-2 Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Compatível com Dynabeads M280 Streptavidin</td></tr><tr><td>Streptavidin Sepharose High Performance</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5113-01</td><td>Este é um produto de alta densidade de estreptavidina para preparação de ssDNA</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td>&ge; 98%</td></tr> <tr><td>Progesterona</td><td>Sigma</td><td>P0130</td><td>&ge; 99%</td></tr> <tr><td>Ácido Cólico</td><td>Sigma</td><td>C1129</td><td>&ge; 98%</td></tr> <tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>Substituído pelo modelo ND-2000</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>&ge; 99.9%</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>&ge; 99.5%</td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio Hexahidratado</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td>&ge; Sistema de Filtro 98%</td></tr><tr><td>500 ml</td><td>Corning</td><td>430769</td><td>0.22 &micro; m membrana de acetato de celulose</td></tr><tr><td>Biblioteca de DNA</td><td>Operon</td><td>Custom</td><td>HPLC purificado</td></tr><tr><td>Todas as outras</td> sondas e primers <td>de captura personalizada</td><td>de DNA IDT</td><td>&#8212; dessalinizados; Aptâmeros &#8212; Termomisturador HPLC</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>R</td><td>Qualquer modelo com&nbsp; controle de temperatura e velocidade de mistura funcionará</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn</td><td>Agilent</td><td>600674</td><td>Taq polimerase também podem ser usados</td></tr><tr><td>Mistura de Desoxinucleotídeos, Grau PCR&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>200415</td><td>Outras marcas trabalharão aqui</td></tr><tr><td>10x Tampão de DNA Polimerase Pfu Clonado</td><td>Agilent</td><td>200532</td><td>Este tampão foi otimizado para PfuUltra II polimerase</td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>9700</td><td>Qualquer modelo que permita ao pesquisador abrir a tampa para otimização do ciclo funcionará</td></tr><tr><td>Agarose-LE</td><td>Ambion</td><td>AM9040</td><td>&ge; 99,9%</td></tr> <tr><td>Brometo de Etídio</td><td>Sigma</td><td>E-1510</td><td>Toxicidade aguda, inalação; suspeito de carcinógeno</td></tr><tr><td>Colunas de síntese vazias, 1 &micro; m Estilo Expedite</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-01</td><td>Este modelo é ideal por causa do encaixe Luer-Lok para acoplar com seringa</td></tr><tr><td>Filtros de Substituição Expedite</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-0F 1</td><td>&micro; tamanho m</td></tr><tr><td>Illustra NAP-25 Colunas</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0852-01</td><td>Qualquer marca com coluna de filtração de gel de resina de grau DNA funcionará</td></tr><tr><td>de Diálise Slide-A-Lyzer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>66205</td><td>2k MWCO usado</td></tr><tr><td>Hidrato de cloreto de ouro(III) Sigma</td><td></td><td>254169</td><td>99,999% de pureza é importante</td></tr><tr><td>Citrato de Sódio Dihidratado</td><td>SAFC</td><td>W302600</td><td>Descobrimos que o composto produzido por diferentes fabricantes afeta muito os ensaios AuNP</td></tr><tr><td>SpectraMax&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>M5</td><td>Os resultados foram semelhantes aos do sistema Bio-TEK</td></tr><tr><td>Synergy</td><td>Bio-TEK</td><td>HT</td><td>Os resultados foram semelhantes aos do sistema Molecular Devices</td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Amresco</td><td>J848</td><td>Qualquer marca que faça um produto esterilizado funcionará</td></tr><tr><td>250 ml Sistema</td><td>de Filtro Corning</td><td>430767</td><td>0.22 &micro; Membrana de acetato de celulose</td></tr><tr><td>M Espectrofotômetro UV</td><td>Varian</td><td>Cary 300&nbsp;</td><td>Outras marcas funcionarão aqui</td></tr><tr><td>Seringa de 5 ml</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309646</td><td>Este modelo é ideal por causa do encaixe Luer-Lok para acoplar com a coluna Expedite</td></tr><tr><td>ThermoEC Minicell Primo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EC320</td><td>Compatível com Fonte de Alimentação</td></tr><tr>Fonte de<td>Alimentação</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB300</td><td>Compatível com ThermoEC Minicell Primo</td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Inflamável líquido</td></tr><tr><td>2-metoxinaftaleno</td><td>Sigma</td><td>148245</td><td>99%</td></tr> <tr><td>Placa de ensaio</td><td>Corning</td><td>3370</td><td>96 poços fundo plano, estéril</td></tr></tbody></table>

um método para selecionar aptamers de comutação estrutura aplicado a um colorimétrico nanopartículas de ouro assay

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Pequenas moléculas fornecer alvos ricos para aplicações biosensoriamento devido às suas implicações fisiológicas como biomarcadores de vários aspectos da saúde humana e performance. Aptâmeros de ácidos nucleicos têm sido cada vez mais aplicado como elementos de reconhecimento em plataformas de biossensores, mas selecionando aptâmeros em direção a alvos pequenos de moléculas requer considerações especiais do projeto. Este trabalho descreve a modificação e etapas críticas de um método destinado a seleccionar, de mudança de estrutura aptâmeros para pequenos alvos molécula. Binding sequências a partir de uma biblioteca de ADN hibridado com sondas de captura de DNA complementares sobre esferas magnéticas são separadas do nonbinders através de uma mudança induzida por alvo na conformação. Este método é vantajoso porque sequências de ligação da matriz de suporte (grânulos) não irá ser amplificado, e que não requer a imobilização da molécula alvo. No entanto, a temperatura de fusão da sonda de captura e uma biblioteca é mantida a temperatura ambiente ou ligeiramente acima, de modo a que as sequências Tdehybridize chapéu baseado em termodinâmica, também estará presente na solução sobrenadante. Isso limita efetivamente a eficiência de particionamento (capacidade de alvo separado sequências de nonbinders obrigatório), e, portanto, muitas rodadas de seleção será obrigado a remover as sequências de fundo. O método relatado difere da estrutura de comutação de seleções aptamer anteriores devido à implementação das etapas de seleção negativa, monitoramento enriquecimento simplificada e extensão do comprimento da sonda de captura seguinte seleção enriquecimento para fornecer maior rigor. Os aptâmeros de comutação de estrutura seleccionadas são vantajosos numa plataforma de ensaio de nanopartículas de ouro que reporta a presença de uma molécula-alvo pela alteração conformacional do aptâmero. O ensaio de nanopartículas de ouro foi aplicada, porque fornece uma rápida leitura simples, colorimétrico que é benéfico num ambiente clínico ou implantado. Considerações de design e otimização são apresentados para o ensaio como prova de principle trabalho em tampão para fornecer uma base para uma maior extensão do trabalho em direção a pequena biosensing molécula em fluidos fisiológicos.

O rigor das condições foi inicialmente mantida baixa para reter ligantes presentes no baixo número de cópias nas primeiras rodadas. A primeira rodada, em particular, implementado o menor rigor para preservar ligantes normalmente apresentados como sequências únicas, demonstrada pelas concentrações de DNA de alta e cortisol, e da falta de etapas de seleção negativos. O sucesso desta selecção aptâmero é demonstrada pela evolução das piscinas de uma percentagem baixa eluída por o alvo (Fase 2) para uma fracção mais elevada eluída pelo alvo que permanece relativamente constante no rodadas 12-13 (Tabela 1). Este platô de DNA eluição pela alvo é tradicionalmente um ponto final na seleção (&quot;enriquecimento&quot;). No entanto, este método aumentou ainda mais o rigor da selecção após enriquecimento através do aumento do comprimento da sonda de captura de cDNA (Figura 1). Alongamento esta sonda aumenta a força da hibridação entre o CDNA e a piscina, aumentando a temperatura de fusão (Tm) do complexo, e exigindo uma maior interacção entre alvo e a sequência para libertar as sequências de ligação em solução. A primeira ronda de selecção implementado uma interacção mais fraca devido ao ADNc menos uma base G na extremidade 5 &#39;da biblioteca. Isto está de acordo com as condições de rigor geralmente mais baixos na primeira rodada, e não é esperado para afetar significativamente a seleção diferente, permitindo que os ligantes mais potenciais, bem como sequências de fundo (dehybridize baseadas em termodinâmica) para passar para a próxima fase de seleção. Estas sequências de fundo foram minimizados como a seleção continuou em direção enriquecimento através da implementação de maiores condições de rigor em rondas de selecção subsequentes. Quando o cDNA foi prolongado a partir de um 7-mer para um 8-mer em redondo de 14, a percentagem de ADN eluído por o alvo é reduzida de 15,3% para 11,1% para uma T m aumentou de 19,2 ° C a 26,7 ° C. O cDNA wnovamente prorrogado para 9-mer no round 15 com T m de 31,3 ° C, caindo do total eluído para 3,3%. Outras informações sobre o enriquecimento pode ser obtida por sequenciação de vários pools de ambos os exemplos, enriquecidas e não enriquecido, a fim de controlar a progressão das piscinas em cada ronda. Sequenciamento de próxima geração (NGS) surgiu como um método poderoso para seqüenciamento em seleção, principalmente devido maior seqüência lê (número total de sequências relatado) são obtidos em relação ao sequenciamento Sanger. Estes seqüência maior lê apresentar uma maior cobertura do número total de sequências na piscina, proporcionando uma imagem mais completa da diversidade de sequências. NGS também remove a clonagem de polarização 32, e permite a sequenciação de múltiplos conjuntos num único lote, com a adição dos códigos de barras 24,33. NGS foi usada para analisar a evolução de enriquecimento a partir de três grupos separados nesta selecção da amostra (Figura 2). Poolsda rodada 6 (ligeiro enriquecimento comparação com round 2% por eluída), redondo 13 (mais alto enriquecimento) e rodada 15 (maior rigor) foram escolhidos como pontos representativos da seleção. Os números de cópias de cada sequência única foram representados como uma percentagem do número total de sequência lê para cada pool. O topo do ranking (o mais alto número de cópias) seqüência constituía apenas 0,1% de todas as seqüências em rodada 6 (33.435 seqüências totais, 22.463 sequências únicas). Como a piscina se torna maximamente enriquecido no round 13, os melhores classificados seqüência aumenta para compor 15,4% de todo o pool (17.681 seqüências totais, 2.987 sequências únicas), 150x maior do que na rodada 6 apesar de só um ~ 5x aumento enriquecimento observado por UV . 15 redondo (28,919 sequência total lê, 2980 sequências únicas) saltou para 44,9% de todas as sequências representadas pela sequência única classificados topo, embora o controlo de enriquecimento de UV mostrou que a quantidade eluída por o alvo foi de ~ 5 vezes inferior do que a de volta 13 ( Tabela 1 </strong&gt;). Enriquecimento também é demonstrado pela menor porcentagem de sequências únicas (67% no round 6 a 10% na rodada 15) como a piscina evolui de muitos para várias sequências com a ligação potencial alvo. Além disso, a top sequência classificados no round 13 (15-3) foi a terceira sequência de número de cópias maior no round 15 depois do comprimento do cDNA foi prorrogado, e a sequência segundo classificado na rodada 13 tornou-se a seqüência do número de cópias maior no round 15 (15 -1): 15-1 GGAATGGATCCACATCCATGGATGGGCAATGCGGGGTGGAGAATGGTTGCCGCACTTCGGCTT CACTGCAGACTTGACGAAGCTT 15-3 GGAATGGATCCACATCCATGGGAGGGTTGGAAGGGAGGGGCCCGGGGTGGGCCATCGTTCGTT CACTGCAGACTTGACGAAGCTT Estudos anteriores examinaram a ligação destas duas seqüências termoforese microescala e diálise de equilíbrio 24. Os resultados mostraram cortisol significativa de ligação para a sequência de 15-1 (K d = 6,9 ± 2,8 mM por diálise de equilíbrio; 16,177; 0,6 mM por termoforese microescala), enquanto uma ligação mínima foi observada entre cortisol e sequência 15-3. Isso mostra que o aumento do comprimento da sonda de captura no round 15 auxiliado no fornecimento de condições de rigor mais elevados para analisar a maior ligante de afinidade. Além disso, nem demonstrado observável sequência de ligação à molécula de selecção negativa, a progesterona, que mostra que a adição dos passos de selecção negativa foi vantajosa para o processo. O facto de um agente de ligação de afinidade mais elevada surgiram após enriquecimento máximo (determinado pelo método tradicional de se analisar a percentagem de ADN eluído pelo alvo) após elevadas condições de severidade foram aplicados em novas rondas de selecção valida o método de prolongamento do comprimento da captura de cDNA sondar pós-enriquecimento. Este resultado mostra que o seu número de cópias a partir de um pool de sequenciada e afinidade para o alvo pode estar associado apenas sob certas condições 24,34, em concontraste com um relatório prévio que implica uma correlação direta 35. Ele também destaca o benefício de monitoramento de enriquecimento através da NGS, ao invés de somente pela estratégia eluída% comum na maioria das seleções, que pode variar naturalmente de uma rodada para o próximo como condições de rigor mais elevados são aplicadas. No entanto,% eluída é útil para monitorar o enriquecimento, quando as condições semelhantes são aplicados em várias rodadas. Por exemplo, rodadas de 10/06 todos os envolvidos condições semelhantes, com nenhuma mudança significativa no enriquecimento (Tabela 1). Quando isso é observado em várias rodadas, as condições são provavelmente demasiado rigorosos para promover o enriquecimento, eo pesquisador deve diminuir rigor na próxima rodada. Por exemplo, a concentração de cortisol foi aumentada de 35 uM a 100 uM em rodadas 11-13, e o eluído% aumentou de 2,5% em rodada 10-14,5% em volta 12. Assim,% eluído pode servir como um guia para ajustar o rigor durante o curso de uma selecção quando similar condições são comparados de rodada a rodada, e pode fornecer informações complementares para NGS para determinar um ponto final a seleção. Sequência 15-1 foi aplicada a um ensaio AUNP para determinar se uma sequência seleccionada de forma a produzir uma estrutura de comutação de aptâmero seria funcionar num ensaio que se baseia numa alteração estrutural seguinte ligação para produzir uma resposta de destino. Estudos iniciais anteriores mostraram que o ensaio AUNP com 15-1 responderam ao biomarcador estresse cortisol, mas não para outros dois marcadores de stress, epinefrina e norepinefrina, ou ácido eólico, um marcador de doença hepática estruturalmente semelhante ao cortisol 24. A resposta foi observada na gama normal de cortisol livre relatado no soro humano (~ 150-600 nM) 6, validando que o aptâmero seleccionado para uma mudança estrutural após a ligação de cortisol produz uma resposta no ensaio de AUNP. Neste trabalho atual, a caracterização do sistema foi dado mais um passo, ajustandoa cobertura (densidade) de 15-1 na superfície do AUNP. Utilizando o mesmo conjunto de condições, a cobertura de ADN foi aumentada de 73 D / NP (moléculas de ADN / AUNP), a 120 D / NP e 200 D / NP (Figura 3). Ácido eólico produziu uma resposta mínima, com a excepção de 10 uM a 200 D / NP. A resposta do ensaio diminui à medida que a cobertura foi aumentou com o aumento dos limites de detecção (LOD). O LOD foi de 29,5 nM para 73 D / NP, 145,2 nm para 120 D / NP, e 27,3 M para 200 D / NP. Este resultado está de acordo com o trabalho de Smith et al., Que ilustra que a resposta de um ensaio utilizando o aptâmero AUNP cocaína diminuiu quando a cobertura aptâmero foi aumentada de 60 D / NP para 300 D / NP 36. Isto implica que o intervalo de detecção para o alvo de interesse pode ser ajustada com base em optimizar a cobertura da superfície de DNA no ensaio AUNP. Isto pode ser benéfico quando se compara, por exemplo, a gama de cortisol livre no soro humano (~ 150-600 nM) em comparação com saliva humana (~ 5-25 nM) &lt;sup&gt; 6,37. Enquanto fluidos fisiológicos são muito mais complexos do que este ensaio buffer, os resultados fornecem uma extensão no trabalho de prova de princípio demonstrando que as condições AUNP pode ser ajustado, dependendo da aplicação, e que a continuação dos trabalhos no sentido de alargar a médio e fluidos biológicos seria de interesse para a comunidade biossensor. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52545/52545fig1highres.jpg" /> Figura 1. Visão geral do método de selecção de mudança de estrutura. Uma pequena sonda de captura cDNA biotinilado é imobilizada em esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. O cDNA é complementar à região a 5 &#39;da biblioteca, a biblioteca de hibridação para os grânulos. Quando alvo é adicionado, uma mudança conformacional induzida a libertar sequências de ligação do grânulo, permitindo particionamento facilitada pela aplicação de um íman. O sobrenadante é retido para monitorizar o enriquecimento (% do ADN eluído por the de destino) por UV após diálise o alvo do DNA. Este passo só é necessário se a molécula alvo absorve na mesma faixa de UV como DNA. As sequências são então PCR amplificado e preparado para a rodada seguinte de seleção. À medida que a selecção progride, a selecção negativa é aplicada, em que as sequências eluídas pela molécula de selecção negativa são descartadas, e os grânulos com os potenciais ligantes alvo são então incubadas com alvo. O comprimento da sonda de cDNA é aumentada após o enriquecimento máximo (% eluída), para aumentar o rigor da selecção. Este número foi reproduzido com permissão da 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52545/52545fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Redondo </td><td> [Cortisol] (? M) </td><td> [Progesterona] (? M) </td><td>DNA Bound (pmol) </td><td> % Eluï¿½o por alvo </td><td> cDNA Comprimento </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 100 </td><td> 0 </td><td> 357,57 </td><td> N / D </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 50 </td><td> 0 </td><td> 145,49 </td><td> 1.4 </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 50 </td><td> 1 </td><td> 188,74 </td><td> N / D </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 50 </td><td> 5 </td><td> 336,4 </td><td> 2.3 </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 35 </td><td> 5 </td><td> 88,05 </td><td> N / D </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 35 </td><td> 10 </td><td> 303,89 </td><td> 3.1 </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 35 </td><td> 10 </td><td> 255,01 </td><td> N / D </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 35 </td><td> 10 </td><td> 236,81 </td> &lt;td&gt; 2.1 </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 9 </td><td> 35 </td><td> 10 </td><td> 318,95 </td><td> 2.6 </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 35 </td><td> 10 </td><td> 297,18 </td><td> 2,5 </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 11 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td> 147,61 </td><td> N / D </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 12 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td> 154,36 </td><td> 14.5 </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 13 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td> 150,39 </td><td> 15.3 </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 14 </td><td> 75 </td><td> 20 </td><td> 247,71 </td><td> 11.1 </td><td> 8-mer </td></tr><tr><td> 15 </td><td> 50 </td><td> 40 </td><td> 409,63 </td><td> 3.3 </td><td> 9-mer </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Selecção e progressão enriquecimento por eluição 24% &lt;<html> strong&gt;. N / A (Não Aplicável) é relatado para as rodadas em que o acompanhamento de enriquecimento de diálise / UV não foi realizada em rodadas de seleção precoce para mitigar a perda de sequências de baixo número de cópias. Este quadro foi reproduzido com permissão da 24. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52545/52545fig2highres.jpg" /> Figura 2. Seleção enriquecimento determinado pelo sequenciamento de próxima geração (A) Round 6.; (B) Rodada 13; (C) adesivo 15. As sequências foram classificados de acordo com seu número de cópias. A sequência de número de cópias maior aumento de constituir um baixo percentual de toda a piscina seqüenciados em rodada 6 (0,1%) para uma alta porcentagem em rodada 15 (44,9%) como a piscina foi enriquecida para sequências de ligação de cortisol. Este número foi reproduzido com permissão da 24.et = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52545/52545fig3highres.jpg" /> Figura 3. AUNP resposta do ensaio variando de 15-1 aptâmero cobertura. A densidade do aptâmero incubadas com o AuNPs foi aumentada de 73 D / NP (triângulo vermelho), a 120 D / NP (quadrado verde) e 200 D / NP ( círculo azul). Respostas de cortisol são cores fortes, a resposta ácido eólico está em cores claras. A resposta do ensaio é melhorada por cortisol em densidades mais baixas, reduzindo assim a LD e a gama o alvo pode ser detectado dentro. As condições de maior resposta de cortisol (73 D / NP) foram caracterizados ainda na gama linear para proporcionar mais pontos dentro da gama normal esperada de cortisol livre relatado no soro humano (~ 150-500 nM) e de saliva (5-25 nM ) 6,37. A resposta mínima de ácido eólico aplicando as mesmas condições de 73 D / NP tem seren detalhado no trabalho anterior 24. Todos os lotes representam a média ± SEM para medições em duplicado ou triplicado. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52545/52545fig4highres.jpg" /> . Figura 4. Os resultados representativos de optimização do ciclo de PCR da esquerda para direita os poços representam: 4 ciclos, 6 ciclos, 8 ciclos, 10 ciclos, 12 ciclos, (nenhum modelo de DNA) negativo, 25 pb padrão escada DNA. As condições óptimas são observados em 8 ciclos, onde a banda único produto está em alta intensidade, sem excesso de amplificação produtos presentes em ciclos mais elevados. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52545/52545fig5highres.jpg" /> Figura 5. AUNP optimização do tempo de ensaio de incubação. O tempo de incubação do passo AUNP / ADN a 73 D / NP foi reduzido a partir de O / N (Figura 3) e 30 min, e a incu alvobation foi imediatamente seguida por adição de sal, em vez de depois de 20 minutos (Figura 3). (A) A resposta é observada para cortisol (diamantes azuis), mas não para o ácido eólico (círculos verdes) ou 2MNP (2-metoxinaftaleno; quadrados vermelhos). Todos os lotes representam a média ± SEM para medições em duplicado ou triplicado. (B) Da esquerda para a direita: em branco, 10 cortisol mM, 10 mM de ácido eólico, 10 mM 2MNP. Visual mudança pode ser observada a olho nu para cortisol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52545/52545fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Um protocolo é fornecido para selecionar aptâmeros de comutação de estrutura para alvos de moléculas pequenas com base em um método de seleção de esferas magnéticas de rigor ajustável. Os aptâmeros selecionados com propriedades de comutação de estrutura são benéficos para ensaios que requerem uma mudança conformacional para sinalizar a presença de um alvo, como o ensaio de nanopartículas de ouro descrito.

Um método para selecionar Aptamers de comutação Estrutura Aplicado a um colorimétrico nanopartículas de ouro Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar aptâmeros com comutação estrutural para integração como elementos de reconhecimento em plataformas de detecção que funcionam sinalizando uma mudança na conformação do aptâmero após ligação ao alvo. Isso é alcançado pela adição de uma sonda de captura biotinilada e de uma biblioteca de DNA complementar a microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina, a fim de imobilizar a biblioteca de DNA na superfície das microesferas. Em seguida, um ímã é aplicado à solução para separar as sequências ligantes das sequências não ligantes que permanecem nas microesferas.As sequências retidas são então purificadas e amplificadas para a próxima rodada de seleção. Após algumas rodadas de seleção, uma etapa de seleção negativa é adicionada ao processo. Após várias rodadas de seleção, o aptâmero selecionado demonstra uma mudança estrutural ao se ligar ao alvo, com base em um ensaio de detecção de alvo utilizando nanopartículas de ouro.A vantagem desta técnica em relação a técnicas existentes, como a célula X baseada em solução, é que não precisamos imobilizar o alvo em um suporte sólido. Assim, as implicações dessa técnica estão na avaliação de risco do estado fisiológico de um indivíduo, e isso se deve ao fato de que o cortisol é um indicador de estresse, o que pode levar à avaliação de problemas de saúde. Sempre utilize soluções de DNA recém-preparadas para este protocolo, especificamente para o alvo e o controle.A preparação do DNA requer atenção especial. Transfira uma alíquota de 100 microlitros da biblioteca de DNA para um tubo de termociclador e aqueça a 95 graus Celsius por cinco minutos em um termomisturador. Em seguida, transfira o tubo para gelo até o momento em que for necessário, antes de usar este DNA, determine sua concentração exata em um espectrofotômetro.Em seguida, prepare as microesferas magnéticas, vortexe as microesferas magnéticas codificadas com strept e transfira 400 microlitros delas para um novo tubo de microcentrífuga. Coloque este tubo no ímã por dois minutos e remova o sobrenadante, depois lave as microesferas. Adicione 400 microlitros de tampão de ligação e vortexe para completar a lavagem.Use um ímã para separar as esferas e descarte o sobrenadante. Repita este processo de lavagem três vezes. Em seguida, imobilize a sonda de captura nas esferas magnéticas.Inicie ressuspendendo as microesferas em 400 microlitros de tampão de ligação contendo a sonda de captura a 50 micromolar. Em seguida, incube as microesferas por 10 minutos com agitação suave à temperatura ambiente. Para remover a sonda de captura livre, lave as microesferas mais três vezes como anteriormente, utilizando 400 microlitros de tampão de ligação por lavagem.Após as três lavagens, adicione mais 400 microlitros de tampão e colete 100 microlitros da solução de perlas para as etapas restantes, mantendo o restante a quatro graus Celsius. O restante pode ser usado para rodadas subsequentes de seleção por até três semanas. Quando forem necessárias mais perlas, elas podem ser preparadas com sondas mais longas para aumentar a rigidez neste esquema de seleção.Por exemplo, sondas mais longas foram utilizadas após a rodada 13, momento em que um enriquecimento significativo já foi alcançado utilizando outras condições de rigidez. Ao usar esferas retiradas do armazenamento, inicie lavando a alíquota de trabalho duas vezes, utilizando 200 microlitros de tampão de ligação por lavagem. Caso contrário, as esferas recém-preparadas já estão limpas.Agora, adicione 100 microlitros de DNA resfriado rapidamente às esferas e incube-as por meia hora à temperatura ambiente com agitação suave. Após a incubação, isole as esferas antes de descartar o sobrenadante. Calcule a concentração de DNA contida para determinar a quantidade de DNA ligada às esferas.Em seguida, lave as esferas três vezes com 200 microlitros de tampão de ligação. Deixe o tampão de ligação lavar as esferas com agitação suave durante cinco minutos a cada vez. Em seguida, prepare a molécula alvo no tampão de ligação a 100 micromolar e re-suspenda as esferas em 200 microlitros dessa preparação, a molécula alvo.Neste caso, o cortisol geralmente é altamente concentrado na primeira rodada de seleção. Incube as microesferas com o alvo por meia hora com agitação suave em condições ambientes. Após a incubação, guarde o sobrenadante contendo as sequências que se ligaram ao alvo.Após cada rodada alternada de enriquecimento, colete uma amostra do sobrenatante final para monitorar o processo. Remova o cortisol do sobrenatante por diálise. Esse passo pode ser ignorado se a molécula-alvo não interferir na medição da absorvância de DNA a 260 nanômetros após cada rodada; amplifique o DNA de ligação-alvo por PCR utilizando o sobrenatante coletado da etapa de seleção positiva como molde.Inicialmente, execute sempre uma PCR-teste em pequena escala para determinar o número ideal de amplificações. Colete amostras de 10 microlitros após cada ciclo e compare as amostras com uma escada de 25 pares de bases. Neste caso, a biblioteca deve apresentar-se em 85 pares de bases, já que produtos amplificados são observados após o 10º ciclo; portanto, deve-se utilizar um número menor de ciclos.Esse resultado pode variar de uma rodada para outra, portanto, uma execução de teste é sempre necessária. Em seguida, realize uma PCR em larga escala utilizando o número selecionado de ciclos com oito tubos em fita. Amplifique de seis a oito mililitros da mistura de reação para obter a quantidade necessária de amplicon para a próxima rodada de seleção, que é entre um e 2,5 nanomols de DNA.Verifique novamente uma amostra dos produtos de PCR utilizando um gel. Em seguida, converta a maior parte dos produtos em DNA de fita simples utilizando esferas revestidas com estreptavidina não magnéticas. Carregue 300 microlitros de esferas em uma coluna pequena bloqueada por fritz.Em seguida, utilizando uma seringa com trava de isca, lave suavemente as esferas com cinco mililitros de tampão de ligação. Ao trocar a solução para lavar a coluna, remova a seringa da coluna e retire o êmbolo da seringa. Isso evita perturbações desnecessárias das esferas.Crie e lave colunas de perlas suficientes para um mililitro de produto de PCR por coluna. Passe um produto de PCR pelas colunas usando pressão suave. Os produtos de DNA serão retidos pelas perlas ligadas por suas fitas antissenso.Em seguida, lave as colunas com DNA ligado com cinco mililitros de tampão de ligação para remover todos os componentes da PCR, deixando apenas o DNA do pool de ligação. Para desidratar o DNA da coluna, adicione 0,5 mililitros de hidróxido de sódio 0,2 molar. Em seguida, dessaline o DNA de fita simples no eit utilizando uma coluna de dessalinização preparada com água livre de nucleases. Descarte os primeiros 0,5 mililitros do eluato.Em seguida, passe um mililitro de água livre de nucleases pela coluna para coletar o DNA dessalinizado. Meça a absorbância do DNA coletado e prepare-o para a próxima rodada de seleção. Conforme descrito no protocolo textual, o DNA de fita simples coletado é agora adicionado novamente a uma alíquota recém-preparada de microesferas preparadas com a sonda de captura.A segunda rodada de seleção é semelhante à primeira, empregando uma concentração mais baixa de cortisol. No entanto, a partir da terceira rodada, incorpore uma etapa de seleção negativa antes da seleção positiva. Para a primeira rodada de seleção negativa, adicione 200 microlitros de progesterona de um micromolar no tampão de ligação às esferas.É estruturalmente semelhante, mas distinto do cortisol. Em rodadas subsequentes, aumente a concentração de progesterona após agitar suavemente a mistura por meia hora à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e lave as esferas duas vezes usando 200 microlitros do tampão de ligação.Em seguida, prossiga com a seleção positiva. Conforme descrito anteriormente, à medida que as rodadas avançam, a concentração do substrato é variada para afetar a rigidez do processo de seleção. Os detalhes são discutidos no protocolo descrito no texto.Em seguida, siga o protocolo descrito para realizar o ensaio com nanopartículas de ouro para detecção de cortisol. Esta leitura colorimétrica rápida e simples baseia-se em uma mudança estrutural do aptâmero após a ligação ao alvo. Assim, fornece uma métrica para avaliar a capacidade do método de selecionar aptâmeros com propriedades de comutação estrutural.Outra vantagem do ensaio com nanopartículas de ouro é que ele amplifica um sinal de modo que um aptâmero de afinidade micromolar, comum a pequenas moléculas, possa ser detectado em níveis várias ordens de magnitude abaixo da constante de dissociação. O protocolo de seleção a seguir foi utilizado para isolar aptâmeros específicos ao cortisol. A diálise e o monitoramento do enriquecimento foram utilizados para demonstrar o aumento na eluição da molécula-alvo após etapas posteriores de seleção.Uma diminuição na eluição foi observada quando menos molécula-alvo e sondas de captura mais longas foram utilizadas nas etapas finais. O sequenciamento de nova geração foi usado para analisar o DNA eluído após várias rodadas diferentes. Logo após a sexta rodada de seleção, uma baixa porcentagem das sequências apresentava número aumentado de cópias, que foi classificada em 20 grupos após 13 rodadas.Uma porcentagem muito maior dos abers apresentava alto número de cópias. Em seguida, ao tornar o processo de seleção mais rigoroso, nas rodadas 14 e 15, quase metade dos abers selecionados estava na primeira categoria de frequência de número de cópias.Neste ponto, havia cerca de 3000 sequências únicas em 30.000 execuções. A AP selecionada foi incubada com nanopartículas de ouro, seguida pela adição do alvo ou de substratos controle para comparação. Este ensaio mostrou que a AP tinha maior especificidade para o cortisol do que para o ácido cólico ou ao tentar este procedimento.É importante controlar a rigidez da seleção em cada rodada, bem como otimizar o número de ciclos de PCR. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como selecionar um AP com comutação de estrutura e realizar um ensaio de detecção com nanopartículas de ouro.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

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