A técnica de coloração diferencial Tempo Juntamente com completa Bilateral Gill denervação para Estudar Ionocytes no Peixe

O objetivo geral deste procedimento é investigar a proliferação de citos braquiais nas brânquias de peixes dourados, sem inervação extrínseca. Isso é feito colocando primeiro o peixe em um banho de corante específico para mitocôndria para manchar as mitocôndrias preexistentes, ricas em citos braquiais. O segundo passo é realizar a desnervação bilateral completa das brânquias.

Em seguida, os peixes são sacrificados. As guelras são colhidas. Os citos são marcados usando um anticorpo contra o potássio sódico nos TPAs.

Em seguida, a etapa final é criar imagens e contar citos preexistentes e recém-diferenciados. Em última análise, esta técnica de coloração diferencial de tempo com desnervação bilateral da guilda é usada para mostrar a proliferação e distribuição de citos branquiais em peixes dourados sem qualquer entrada nervosa do sistema nervoso central. Portanto, a principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para entender a absorção dinâmica de íons e examinar a redistribuição de citos no epitélio gastrointestinal dos peixes.

Primeiro, prepare uma solução milimolar de estoque vermelho de rastreador mitral dissolvendo 50 microgramas em 94 microlitros de dimetilsulfóxido e proteja da luz. Em seguida, prepare de três a seis caixas escuras com um volume máximo de 600 mililitros. Encha cada caixa com 400 mililitros de água do sistema e coloque uma pedra de ar em cada uma para fornecer uma fonte de oxigênio.

Coloque peixinhos dourados pesando 30 a 40 gramas nas caixas. Após 30 minutos, adicione a solução de rastreador Mitre para obter uma concentração total de corante 0,1 micromolar e 0,01% de DMSO. Banhe o peixe por quatro horas.

Após quatro horas, ligue o fluxo de água para as caixas e deixe o corante sair. Se forem animais de controle, recupere os peixes por três a cinco dias, depois prossiga para a imuno-histoquímica, caso contrário, prossiga para o procedimento de desnervação bilateral completo. Primeiro, anestesiar o peixe colocando-o em banho-maria aerado de benzocaína.

Assim que a respiração cessar, coloque o peixe em uma mesa de cirurgia e insira um tubo na cavidade bucal Para irrigar as brânquias com solução anestésica aerada, posicione o peixe de forma que a cabeça fique ligeiramente inclinada para baixo para permitir um melhor acesso à área atrás do quarto arco branquial. Levante suavemente o opérculo com uma pinça reta de padrão padrão, e, em seguida, coloque afastadores de tecido entre o opérculoma e o interior da cabeça. Abra cuidadosamente os afastadores de tecido para manter o opérculoma longe da cabeça e manter as brânquias expostas.

Descanse as alças do retrator ao lado da cabeça Para fornecer acesso a todos os quatro arcos branquiais. Verifique se a solução anestésica está irrigando as brânquias e coloque uma pinça de padrão padrão curvo ou reto entre o quarto arco branquial e a parte de trás da cabeça. Abra suavemente a pinça para criar tensão no ligamento.

Anexando o quarto arco branquial à cabeça com um par de pinças número cinco. Crie uma abertura de dois a três milímetros perfurando o epitélio, conectando a extremidade dorsal dos arcos branquiais à cavidade auricular. Tenha cuidado para não ir muito fundo, pois existe o risco de danificar um vaso sanguíneo importante.

Em seguida, segure um pequeno cotonete com uma pinça número cinco e use-o para expandir cuidadosamente a incisão para expor o nono e o 10º nervos. Liberte os nervos de qualquer tecido conjuntivo usando a pinça número cinco. Mais uma vez, tomando cuidado para não danificar os vasos sanguíneos.

Uma vez que os nervos tenham sido expostos e identificados, use a tesoura de mola curva para cortar cuidadosamente os nervos enquanto segura a incisão. Abra com a pinça reta de forma padrão. Depois de cortar os nervos, retraia suavemente a pinça curva e remova o tecido.

As suturas retratoras não são necessárias porque a incisão deve fechar sozinha dentro de 24 a 48 horas. Depois de repetir o procedimento do outro lado da cabeça, mude a irrigação das brânquias de anestésico para água fresca aerada e permita que os peixes se recuperem da anestesia. Assim que os movimentos auriculares forem retomados, mova os peixes para tanques experimentais para se recuperar por pelo menos 24 horas.

Finalmente, execute um procedimento simulado em um conjunto separado de peixes, perfurando o epitélio atrás do quarto arco branquial sem cortar os nervos antes de sacrificar o peixe. Coloque três a quatro mililitros de 4% de PFA em um frasco de cintilação. Use um frasco para injetáveis por arco branquial.

Além disso, pegue um pequeno barco de soro de leite e encha-o com um XPBS. Isso será usado para lavar o tecido depois de ter sido excisado. Mantenha todas as soluções no gelo.

Depois de sacrificar o peixe com uma overdose de benzocaína, use uma pinça romba para levantar o permanente de um lado da cabeça e uma tesoura curva para cortar cada extremidade da cesta branquial braquial. Em seguida, use uma pinça romba para pegar cuidadosamente a guelra pelos Rackers e retirá-la da cavidade auricular. Lave imediatamente a brânquia em um XPBS gelado para remover o excesso de benzeno e sangue e coloque a brânquia excisada em um frasco cheio de 4% de PFA, fixe todas as brânquias excisadas durante a noite a quatro graus Celsius após a fixação.

Lave o X-S-P-F-A em um XPBS e coloque o lenço em um tubo de bala de dois mililitros cheio de 1,5 mililitros de 1% de Tritton x. Coloque os tubos de bala em um agitador por seis horas em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Para fazer permanente no tecido, prepare uma diluição de um a 250 de cada anticorpo primário adicionando quatro microlitros dos anticorpos primários NKA e ZN 12 em 992 microlitros de um XPBS.

Certifique-se de que ambos os anticorpos primários foram criados no mesmo hospedeiro. Aspire a solução Triton X e sem lavar primeiro o tecido e a solução de anticorpos primários e incube em um agitador por seis horas em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Após a incubação, aspirar a solução de anticorpo primário e lavar o anticorpo primário três vezes durante três minutos cada.

Usando um XPBS. Prepare o anticorpo secundário em uma diluição de um a 200 misturando cinco microlitros de anticorpo secundário estoque em 995 microlitros de um XPBS. Depois de aspirar o PBS da última lavagem, aplique o anticorpo secundário e incube por seis horas em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius em um shaker.

Finalmente, remova qualquer excesso de anticorpo secundário lavando o tecido três vezes por cinco minutos cada, como antes, após as lavagens montarem o tecido, colocando primeiro uma brânquia em uma gota de 200 microlitros de um XPBS em uma lâmina plana de microscópio. Para garantir que o tecido não seque. Separe as guelras hemi Brinks com uma micro tesoura curva.

Em seguida, coloque uma gota de um XPBS e uma gota de mídia de montagem na depressão de uma lâmina côncava. Coloque as meias-manivelas separadas na lâmina côncava com a borda dianteira do filamento voltada para cima e cubra com uma lamínula, enxugue as bordas da lamínula com esmalte. Para evitar que a lamínula se mova e desloque o tecido, permita que o tecido se acomode na parte inferior da lâmina côncava por 10 a 15 minutos antes da imagem.

Para cada arco branquial, selecione seis filamentos branquiais aleatoriamente para obter imagens, produzindo seis imagens por arco branquial. Use a microscopia confocal convencional para obter imagens do tecido tomando cortes ópticos de um a três micrômetros nas imagens a seguir, os citos indicados por pontas de seta foram corados com o anticorpo alfa cinco e os nervos indicados por setas foram corados com o anticorpo ZN 12. Esta imagem confocal de um filamento branquial de um peixe controle mostra inervação extrínseca com extensa ramificação da lamela de um feixe de nervos centrais, presumivelmente originado do nono e 10º nervos, como visto na imagem inserida.

Alguns dos citos indicados também são inervados. Esta imagem mostra um filamento branquial dois dias após a desnervação bilateral completa. Houve uma redução do feixe nervoso central, enquanto a inervação laminar parecia praticamente intacta.

Aqui, um filamento branquial mostrado cinco dias após a denervação bilateral completa demonstra que a inervação extrínseca está agora praticamente ausente. A análise qualitativa sugere que a desnervação bilateral completa causa degradação da inervação branquial extrínseca, mantendo os nervos com corpos celulares dentro do filamento branquial, criando uma rede de nervos através do filamento e no claudicante. Este procedimento pode ser acoplado a outros métodos, como medir fluxos de íons, usando íons radioativos como o sódio 22 para responder a perguntas adicionais de pesquisa.