Name: A imuno-histoquímica e Rotulagem múltipla com anticorpos da espécie hospedeira Mesmas para Estudar Adulto Hippocampal Neurogênese (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprenda imunofluorescência sequencial múltipla para estudar neurogênese hipocampal adulta usando anticorpos da mesma espécie hospedeira. Este método supera limitações de especificidade e melhora a detecção de células progenitoras neurais.

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Os autores agradecem a S. Tausch pela excelente assistência técnica. O trabalho foi apoiado pelo BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) e DFG (FOR1738).

NOTA: Todos os procedimentos que envolvem animais vivos foram realizadas em conformidade com a directiva EC 86/609 / CEE orientações sobre cuidados e uso de animais de laboratório e aprovado pelo comitê de ética local (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz). 1. injeção intraperitoneal de timidina Analogs <ol><li> Pesar animais o dia antes da injeção. Calcule a quantidade de timidina analógica necessária para todas as injecções planejadas no dia seguinte, bem como o volume de injecção individuais ajustados ao peso de uma solução estoque de 10 mg / ml. </li><li> Prepare / ml solução estoque timidina 10 mg. (CUIDADO! Análogos da timidina são tóxicos. Siga as Fichas de Dados de Segurança específicas (MSDS) prestados pelos fornecedores, ou seja, usar casaco e luvas de laboratório, use um exaustor química). <ol><li> Tome timidina analógico a partir do congelador e trazê-lo até à temperatura ambiente, aproximadamente. 21 ° C. Pesar 10 mg e adicionarsolução salina estéril (para BrdU e CldU) ou NaOH 0,04 N (em solução salina estéril, por IdU), vortex. Colocar por pelo menos 10 - 15 minutos num banho a 50 ° C e água cada vórtice de 2 - 3 minutos para dissolver o pó. NOTA: Utilizar soluções para até 24 horas quando armazenada à temperatura ambiente e durante várias semanas a -20 ° C. Proteger as soluções da luz (cubra com papel alumínio). Sempre verifique se há precipitados e re-dissolver, se necessário. </li></ol></li><li> Contenha o mouse pela nuca e intraperitoneal injetar um volume apropriado, ajustada ao peso da solução de (pelo RT) utilizando uma seringa de dosagem bem com uma agulha G 30. NOTA: No caso de CldU e IdU têm de ser administrados sequencialmente dentro de um mesmo animal, considerar a injectar concentrações equimolares (por exemplo, de 42,5 mg / kg de CldU e 57,5 mg / kg IdU, que correspondem a 50 mg / kg de BrdU). Portanto, ajustar os volumes de injecção das soluções de 10 mg / ml em conformidade. </li></ol> 2. Preparação de tecidos <ol><li> Prepare formaldeído a 4% em 0,1 M de tampão de fosfato pH 7,4 no dia antes da perfusão. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Transcardialmente perfundir os ratinhos anestesiados profundamente (3,5% de isoflurano) através do ventrículo esquerdo com 10 ml de PBS gelado, em seguida, com 40 ml de gelo-frio formaldeído (taxa de fluxo de 5 ml / min). Dissecar o cérebro e pós-fix no mesmo fixador durante 24 horas a 4 ° C. </li><li> Transferir os cérebros consecutivamente em 10% (24 h a 4 ° C) e 30% de sacarose (até as pias cerebrais, aprox. 48 h). Para o congelamento, lentamente submergir os cérebros crioprotegidos em -25 ° C isopentano até sem bolhas surgem a partir do tecido. Armazenar a -80 ° C. </li><li> Corte cortes coronais de 40 m de espessura em um micrótomo de congelação (temperatura do bloco a -25 a -16 ° C). Secções de transferência sequencialmente em solução anticongelante contendo poços de uma placa de 24 poços de cultura de células (ver Figura 1). Armazenar a -20 ° C. </li></ol><img alt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52551 / 52551fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Ilustração esquemática de transferência de fatias do micrótomo em uma placa de 24 poços. Comece na A1 e coloque fatias subsequentes na fileira A, após A6 ir para a próxima linha B e assim por diante. Ao atingir D6, volte para A1 e continuar. Este arranjo de fatias permite a quantificação de cada enésima secção de um cérebro inteiro. Para a quantificação de células recém-nascidas tomar todos os 6 th secção cérebro (equivalente ao conteúdo de uma coluna), para imunofluorescência fenotipagem tomar cada 12 th secção (equivalente ao conteúdo de duas fileiras alternadas de uma coluna). 3. Immunostaining NOTA: As seções são processadas livre flutuação, normalmente em placas de 6 poços equipados com uma placa de suporte e inserções de malha. Como exceção, o bloqueio, incubações de anticorpos e reação ABC são feitos em 12 ou 24 poços placas sem inserções de malha (0,5 a 1 ml por well é suficiente, dependendo do número de fatias que têm de ser marcadas). Durante estas etapas, transferir seções com a ajuda de um pincel fino (enxaguar com cada nova solução). Todas as incubações são realizadas com agitação contínua (máx 150 rpm). <ol><li> A imuno-histoquímica (método ABC) <ol><li> Transferir seções de anticongelante em TBS e enxaguar bem (uma vez O / N a 4 ° C, 5 vezes a TA durante 10 min cada) para remover completamente anti-congelante. </li><li> Incubar durante 30 min em 1,5% de H 2 O 2 em TBS-T, para extinguir a actividade da peroxidase endógena. Preste atenção ao borbulhar e re-submergir seções se necessário. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada. </li><li> Opcional: Entretanto pré-aquecer uma câmara de aquecimento e HCl 2 N a 37 ° C. Incubar secções durante 30 min a 37 ° C em HCl 2 N para desnaturar o ADN. Delicadamente seções separadas com a ajuda de um pincel. </li><li> Opcional: Neutralizar secções durante 10 minutos em 0,1 M de borato de pH8,5, RT. Durante a transferência, pincelar brevemente as inserções de malha contendo as seções sobre uma toalha de papel para remover restos de HCl. Lavar duas vezes em TBS durante 15 minutos cada. </li><li> Incubar em TBSplus para permeabilizar o tecido e para bloquear os locais de ligação de anticorpos não específicos, 1 h à TA. </li><li> Incubar em anticorpo primário diluído em TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada. </li><li> Incubar em anticorpo secundário biotinilado diluído em TBSplus, 3 horas à TA. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada. Enquanto isso ... </li><li> Prepare complexo ABC de acordo com o protocolo do fabricante (1% A + B 1% em TBS-T). Deixa-se repousar durante 30 min à temperatura ambiente antes da sua utilização. Incubar em secções reagente AB durante 1 h à TA. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada. </li><li> Preparar 50 ml de 0,5 mg / ml de DAB em TBS-T, por 6 ou 12 poços, dividida em duas metades e pipetas 4 ml ou 2 ml por poço, respectivamente. Seções transferência para solução de DAB (CUIDADO! DAB é tóxico. Siga o específic MSDS fornecidas pelo fornecedor, ou seja, usar casaco e luvas de laboratório, use um fume hood química). </li><li> Adicionar 0,5 ml de 1% de H 2 O 2 para a solução DAB 25 ml restantes, misturar e pipeta volumes equivalentes, tal como acima, para cada poço para iniciar a reacção de peroxidase. Incubar por 12 min. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada. </li><li> Seções de montagem para as lâminas em gelatina, o ar seco O / N. Lamela com meio de montagem permanente. </li><li> Opcional: contracorante antes de colocar a lamela (ver secção 3.5). NOTA: Se a relação de sinal-para-ruído é baixo por causa da elevada interferência de fundo, repetir H 2 O 2 de tratamento após a incubação com o reagente de AB (passo 3.1.8). </li></ol></li><li> Múltiplo-imunofluorescência <ol><li> Imunofluorescência múltipla de solteiro ou simultânea <ol><li> Transferir seções de anticongelante em TBS e enxaguar bem (uma vez O / N a 4 ° C, 5 vezes a TA durante 10 min cada) para remover completamente umtifreeze. </li><li> Opcional: como as etapas 3.1.3 - 3.1.4. </li><li> Incubar em TBSplus para permeabilizar o tecido e bloquear os sítios de ligação de anticorpos não específicos, 1 h à TA. </li><li> Incubar em cocktail de anticorpo primário (por exemplo, α-BrdU de rato, cobaia α-DCX, α-GFP) de cabra diluídos em TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada. </li><li> Incubar em coquetel de anticorpos secundários fluorochrome conjugado (por exemplo, Rhodamine Red α-rat, Alexa-647 α-cobaia, Alexa-488 α-cabra; todos derivados de burro) diluído em TBSplus, 3 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C. A partir de agora proteger as seções da luz. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada. </li><li> Seções de montagem para as lâminas em gelatina, o ar seco O / N. Lamela com meio de montagem aquoso. </li></ol></li><li> Imunofluorescência múltipla seqüencial com anticorpos primários de espécies hospedeiras mesmos <ol><li> Como as etapas 3.2.1.1 - 3.2.1.3. </li><li> Incubar em fiprimeiro anticorpo primário (por exemplo, α-antigénio de coelho A), O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada. </li><li> Incubar em primeiro anticorpo conjugado com fluorocromo secundário (por exemplo, vermelho de rodamina-conj. Α-coelho de burro), 3 h RT. A partir de agora proteger as seções da luz. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada. </li><li> Incubar em 10% de soro normal a partir do mesmo host que os anticorpos primários (por exemplo, soro de coelho) por 3 hr RT para saturar paratopos abertas no primeiro anticorpo secundário. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada. </li><li> Incubar em TBSplus com 50 ug / fragmentos Fab monovalentes unconjugated ml contra o exército dos anticorpos primários (por exemplo, IgG α-coelho (H + L)) para cobrir epítopos que poderiam ser reconhecidos pelo segundo anticorpo secundário, O / N no 4 ° C. </li><li> Lavar pelo menos 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada. Durante a transferência, swa brevementeb as inserções de malha contendo os cortes em uma toalha de papel para remover quaisquer restos Fab. </li><li> Incubar em segundo anticorpo primário (por exemplo, de coelho α antigénio-B), O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada. </li><li> Incubar em segundo anticorpo conjugado com fluorocromo secundário (por exemplo, Alexa-488-conj. Α-coelho de burro), 3 h RT. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada, montagem e lamela como acima. NOTA: Para identificar antígenos com anticorpos de diferentes espécies hospedeiras adicioná-los para a etapa 3.2.2.2 e os respectivos anticorpos secundários para a etapa 3.2.2.3. </li></ol></li><li> Um dos anticorpos secundários provenientes mesma espécie como um dos anticorpos primários NOTA: Este protocolo é adequado para quadruple-coloração contra BrdU ou Ki67 juntamente com GFAP, nestin-GFP e DCX. <ol><li> Siga rigorosamente o protocolo passos 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Até este ponto utilizar apenas soro de burro em TBSplus. </li><li> Incubar em TBSplus contendo 3% de soro de cabra durante 1 h à TA. Isto cobre paratopos abertas no anticorpo secundário de cabra-α. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada. </li><li> Incubar em AMCA conj. α-cabra de coelho diluído em TBSplus, TA 3 horas ou O / N a 4 ° C. Lavar três vezes em TBS durante 15 minutos cada, montagem e lamela como acima. </li></ol></li><li> Co-coloração CldU, IdU <ol><li> Lavar, desnaturar e neutralizar seções como descrito no ponto 3.2.1 (passos 3.2.1.1 - 3.2.1.2). </li><li> Incubar com 20 ug / ml de fragmentos Fab não conjugados α-IgG de ratinho (H + L) em TBSplus, 1 h à TA. Lavar 4 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada. </li><li> Incubar em cocktail de anticorpo primário contendo α-BrdU de rato (1: 400; purificado IgG2), e rato α-BrdU (1: 350) diluídos em TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada. </li><li> Incubar em cocktail de anticorpo secundário contendo de burro biotinilados α-rato (1: 500) e FITC-conj. burro α-Rato fragmentos Fab (1: 100). Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada. </li><li> Incubar em vermelho-Rodamina conj. Estreptavidina, 2 h à TA. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada, montagem e lamela como acima. </li></ol></li><li> A amplificação do sinal de fluorescência em ratinhos nestina-GFP <ol><li> Adicionar cabra α-GFP para o cocktail de anticorpo primário. </li><li> Adicionar um anticorpo secundário conjugado com fluorocromo propriedades espectrais semelhantes a GFP (tais como Alexa 488 conj. Α-cabra de burro) para o cocktail de anticorpo secundário. </li></ol></li></ol></li><li> Recuperação Epitope <ol><li> Realizar recuperação antigênica após enxaguar anticongelante. Pré-aqueça o vapor com 6 ou 12 poços contendo placas de tampão citrato 0,1 M pH 6,0-95 - 99 ° C (aproximadamente 25 minutos). </li><li> Transfira as seções para o tampão citrato quente e vapor durante 30 minutos (cobrir as placas com folha de alumínio como plástico lids não são resistentes ao calor). </li><li> Colocar imediatamente as placas num banho de gelo para arrefecer. Isso ajuda a proteger a morfologia do tecido, o que é de particular importância quando se trabalha com secções de cérebro de animais após o nascimento. </li><li> Lavar 3 vezes em TBS durante 10 minutos cada para lavar e neutralizar o citrato e continuar a coloração. </li></ol></li><li> Anticorpos de rato sobre o tecido do mouse <ol><li> Adicionar / ml de fragmentos de 20 ug monovalentes Fab α-IgG de ratinho (H + L; mesmas espécies hospedeiras-anticorpo secundário) do que para o primeiro passo de bloqueio (por exemplo, o passo 3.1.5 ou 3.2.1.3). </li><li> Lavar 4 vezes em TBS e uma vez em TBS-T por 10 min cada, e prosseguir com respectivo protocolo. </li></ol></li><li> Cresyl counterstaining violeta <ol><li> Pré-aqueça solução violeta de cresilo a 60 ° C (em frasco de vidro). Incubar as lâminas na solução quente por 3 min. </li><li> Enxágüe em aq. dest. e desidratar 2 vezes durante 1 minuto cada em 70%, 96% e 100% de isopropanol. </li&gt; <li> Limpar por 5-6 min em xileno ou um substituto xileno e lamela com um meio de montagem permanente compatível. </li></ol></li></ol> Análise 4. Dados <ol><li> Contagem de células coradas em recém-nascidos com peroxidase a cada po 6 corte ao longo de toda a extensão rostro-caudal do giro dentado. Use um microscópio de luz em aumento de 400X. </li><li> Multiplicar o número de células resultantes com o intervalo de intersecção para obter uma estimativa do número total de células recém-nascidas. </li><li> A imagem de fluorescência marcado secções com um microscópio confocal de laser equipado com lasers adequados e sistemas de filtragem. Leve pilhas de imagens em posições aleatórias ao longo de toda a extensão do giro denteado no aumento de 400X e analisar pelo menos 50 células selecionadas aleatoriamente de interesse por hemisfério para co-rotulagem com outros marcadores. </li><li> Multiplicar as percentagens calculadas de células co-rotulado (% / 100) com os números totais de células recém-nascidos para calcular absolutonúmero de populações de células específicas de recém-nascidos. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A quantificação e identificação de subpopulações de células-nascidos é uma questão central na pesquisa neurogênese adulta. Combinando marcadores de proliferação e de anticorpos contra as proteínas expressas durante fases específicas da neurogênese adulta permite a detecção imuno-histoquímica destas subpopulações. Alguns dos anticorpos ou combinações de anticorpos específicos requerem condições de coloração. Rotulagem de divisão de células com análogos da timidina sintéticos ainda é o padrão ...

Duas regiões do cérebro constitutivamente gerar novos neurónios ao longo da vida, a zona subventricular dos ventrículos laterais e na zona subgranular (SGZ) do giro dentado do hipocampo (DG). Os neurônios recém-nascidos derivam de células progenitoras neurais e passam por diferentes estágios de desenvolvimento morfológico e fisiológico antes de atingirem a maturidade 1,2. A partir de uma glia-like radial células estaminais lentamente dividindo (tipo 1) estágios consecutivos de trânsito amplificando surgem células progenitoras intermediários. Os subtipos mais indiferenciadas (tipo 2A e tipo 2b) tem uma forma irregular, processos com tangenciais curtas. Geram neuroblastos (Tipo 3) que, gradualmente, sair do ciclo celular para se tornar neurónios imaturos (com dendrites estendido para a camada molecular) e, finalmente, integrar na rede de células granulares do hipocampo como maduros. Devido às suas características fisiológicas específicas dessas células fornecer o circuito com maior plasticidade 3 suggesting um papel único na função do hipocampo. Na verdade, os estudos sobre a última década gerou provas substanciais de que a neurogênese adulta contribui para a memória espacial, a separação padrão e comportamento emocional 4,5. Neurogénese adulto pode ser estudada utilizando diferentes abordagens. Análogos da timidina incorporar em DNA durante a fase S do ciclo celular e permitir o nascimento de encontros, quantificação e análise de células de destino 6-8-nascidos. Aplicação sequencial de diferentes análogos da timidina (eg, CldU Edu ou UDI) pode ser usado para estudar a renovação celular ou populações de células nascidas em diferentes momentos durante o curso de um experimento 9. Uma alternativa, um marcador para a proliferação celular endógeno é Ki67. Ela é expressa em células em divisão, durante todas as fases do ciclo celular (G1, S, G2, H), excepto na fase de repouso (G0), e o início de G1 10,11. Para analisar o fenótipo de populações de células-nascidos no adulto dentate gyrus vários marcadores moleculares específicas de fase podem ser utilizados, tais como a GFAP, nestina, DCX e NeuN 1,6. GFAP é um marcador de astrócitos maduros, mas também é expresso em células da glia, como radiais na parte frontal do cérebro adulto. Nestin é um filamento intermediário específico para células da glia-like radiais e as células progenitoras intermediários iniciais. DCX é uma proteína associada a microtúbulos expressa em progenitores intermediários, neuroblastos imaturos e neurónios. Com base na (co-) expressão destes três marcadores e as características morfológicas das células marcadas quatro subtipos de células progenitoras distintos podem ser identificados: o tipo 1 (GFAP +, nestin +, DCX -), tipo 2a (GFAP -, nestin + , DCX -), tipo 2b (GFAP -, nestin +, DCX +) e tipo 3 (GFAP -, nestin -, DCX +) 1. Co-rotulagem de DCX em conjunto com NeuN, que é expressa nos neurónios pós-mitóticos, permite a diferenciação de immature (DCX +, NeuN +) e maduro (DCX -, NeuN +) neurônios granulares. Os marcadores acima mencionados são freqüentemente usados ​​para co-rotulagem de imunofluorescência e microscopia confocal subseqüente ao analisar o número ea identidade das células-nascidos. Isto requer tipicamente anticorpos de diferentes espécies hospedeiras para evitar anticorpo reactividade cruzada indesejada. No entanto, a maioria dos anticorpos primários adequados para investigação neurogénese são levantados, quer em coelhos ou ratinhos (por exemplo, rato α-BrdU, rato α-NeuN, α-Ki67 de coelho, α-GFAP de coelho). Isto leva a sérias limitações no número e combinação de antígenos que possam ser avaliados em uma única fatia. Este, por sua vez, não só aumenta o esforço de coloração, como múltiplas colorações devem ser realizados, mas pode também comprometer a fiabilidade dos resultados. Além disso, alguns antigénios são susceptíveis de formalina induzida por mascaramento epitopo de fixação (por exemplo, Ki67, Nestina). Descrevemos aqui modificações dos protocolos immunolabeling simples e múltipla clássicos (por exemplo, recuperação antigênica, múltiplos immunostaining seqüencial, uso de nestin-GFP camundongos transgênicos 12) que superar muitas destas questões. Em particular, o protocolo de imunofluorescência múltipla sequencial permite coloração contra até quatro antigénios diferentes mesmo se parte dos anticorpos é derivado a partir do mesmo hospedeiro. Isto permite a detecção simultânea de tipo 1, tipo 2a, 2b e tipo de células progenitoras do tipo 3, bem como a sua actividade proliferativa dentro de uma única secção.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Administração análoga de timidina</td></tr><tr><td>5-Bromo-2&prime;-desoxiuridina, BrdU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9285</td><td>tóxico (mutagênico, teratogênico)</td></tr><tr><td>5-Cloro-2&prime;-desoxiuridina, CldU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6891</td><td>tóxico (mutagênico, teratogênico)</td></tr><tr><td>5-Cloro-2&prime;-desoxiuridina, CldU</td><td>MP Biomedicals</td><td>2105478</td><td>tóxico (mutagênico, teratogênico)</td></tr><tr><td>5-Iodo-2&prime;-desoxiuridina, IdU</td><td>MP Biomedicals</td><td>2100357</td><td>tóxico (mutagênico, teratogênico)</td></tr><tr><td colspan="4">Preparação de tecidos</td></tr><tr><td>Isoflurano-Actavis</td><td>Piramal Healthcare</td><td>700211</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído em pó (PFA)</td><td>Riedel-De H&auml; pt</td><td>16005</td><td>bomba de</td></tr><tr><td>perfusão tóxica e inflamável PD5206</td><td>Heidolph Instruments</td><td>523-52060-00</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação de laboratório Masterflex Tygon, &Oslash; 0,8 mm</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>06409-13</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de alimentação, reta, 21 G, ponta verde-oliva de 1,75 mm, 40 mm</td><td>Agnthos</td><td>1036</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo de congelamento Microm HM 400</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas multipoços de cultura celular de 24 poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Tefal vitacuisine vaporizador</td><td>Tefal</td><td>VS 4001</td><td></td></tr><tr><td>Netwell 24 mm inserções de membrana de malha de poliéster</td><td>Corning</td><td>3479</td><td>pré-carregado em placas de cultura de 6 poços</td></tr><tr><td>Inserções de membrana de malha de poliéster Netwell 15 mm</td><td>Corning</td><td>3477</td><td>pré-carregado em placas de cultura de 12 poços</td></tr><tr><td>Kit de suporte de plástico Netwell de 6 poços</td><td>Corning</td><td>3521</td><td>para inserções de membrana de malha de poliéster de 24 mm Kit</td></tr><tr><td>de suporte de plástico Netwell de 12 poços</td><td>Corning</td><td>3520</td><td>para inserções de membrana de malha de poliéster de 15 mm Kit</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>DAB (hidrato de cloridrato de 3,3&ampe;-diaminobenzidina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5637</td><td>cancerígeno, sensível à luz</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Anticorpos primários</td></tr><tr><td>Rabbit IgG1 &alpha;-Ki67</td><td>Novocastra/ Leica Biosystems</td><td>NCL-L-Ki67MM1</td><td>DAB 1:400/IF 1:100; requer recuperação de epítopos</td></tr><tr><td>Coelho &alpha;-GFAP, AS-3-GF</td><td>Synaptic Systems</td><td>173 002</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Goat IgG (H+L) &alpha;-GFP</td><td>Acris Anticorpos</td><td>R1091P</td><td>1:300</td></tr><tr><td>IgG1 de camundongo &alpha;-nestin</td><td>Abcam</td><td>ab6142</td><td>1:200; requer recuperação de epítopos</td></tr><tr><td>Cobaia IgG (H+L) &alpha;-Doublecortin</td><td>Merck Millipore</td><td>AB2253</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Rato IgG2a &alpha;- BrdU (ascite)</td><td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td><td>OBT0030CX</td><td>para detecção de BrdU; DAB 1:500/IF 1:400</td></tr><tr><td>Rato IgG2a &alpha;-BrdU (purificado)</td><td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td><td>OBT0030&nbsp; &nbsp;</td><td>para detecção de CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 &alpha;-NeuN</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>mouse IgG1&#954; &#945;-BrdU</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>Para detecção de IdU; DAB 1:500/IF 1:350</td></tr><tr><td colspan="4">Anticorpos secundários</td></tr><tr><td>IgG de &alfa;-cobaia de burro (H+L)-Biotina</td><td>Dianova</td><td>711-065-152</td><td>1:500</td></tr><tr><td>IgG de &alfa;-rato de burro (H+L)-Biotina</td><td>Dianova</td><td>712-065-150</td><td>1:500</td></tr><tr><td>IgG de &alfa;-camundongo de burro (H+L)-Biotina</td><td>Dianova</td><td>715-065-151</td><td>1:500</td></tr><tr><td>IgG de &alfa;-rato de cabra (H+L)-Alexa Fluor 488</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A11006</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Burro &alpha;-cabra IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A11055</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Burro &alpha;-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment</td><td>Dianova</td><td>715-097-003</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Burro &alpha;-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>715-605-151</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Burro &alfa;-cobaia IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>706-605-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Burro &alfa;-rato IgG (H+L)-Rodamina Vermelho-X</td><td>Dianova</td><td>712-295-150</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Burro &alfa;-coelho IgG (H+L)-Rodamina Vermelho-X</td><td>Dianova</td><td>711-295-152</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Burro &alfa;-cobaia IgG (H+L)-Rodamina Vermelho-X</td><td>Dianova</td><td>706-296-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Estreptavidin-rodamina Red-X</td><td>Dianova</td><td>016-290-084</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Cabra &alpha;-coelho IgG (H+L)-AMCA</td><td>Dianova</td><td>111-155-144</td><td>1:250, funciona apenas com coelho &alpha;-GFAP</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sondas Moleculares</td><td>H3570</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sondas Moleculares</td><td>D1306</td><td>1:1000</td></tr><tr><td colspan="4">Blocking </td></tr><tr><td>Fab-fragmento de burro &alpha;-camundongo IgG (H+L)</td><td>Dianova</td><td>715-007-003</td><td>1:20</td></tr><tr><td>Fab-fragmento de burro &alpha;-coelho IgG (H+L)</td><td>Dianova</td><td>711-007-003</td><td>1:20</td></tr><tr><td>Soro normal de burro</td><td>Merck Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>Soro normal de coelho</td><td>Dianova</td><td>011-000-010</td><td></td></tr><tr><td>Soro normal de cabra</td><td>Dianova</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Histology</td></tr><tr><td>Cresyl violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>Neo-Clear</td><td>Merck Millipore</td><td>109843</td><td>substituto de xileno não tóxico</td></tr><tr><td>Neo-Mount</td><td>Merck Millipore</td><td>109016</td><td>meio</td></tr> <tr>de montagem permanente<td colspan="4">Microscopy</td></tr><tr><td>Axioskop 2</td><td>Carl Zeiss Microscopia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 710</td><td>Carl Zeiss Microscopia</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a imuno-histoquímica e rotulagem múltipla com anticorpos da espécie hospedeira mesmas para estudar adulto hippocampal neurogênese

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Neurogênese adulta é altamente regulado, processo multi-estágio em que novos neurônios são gerados a partir de uma célula-tronco neurais ativadas via cada vez mais comprometidos subtipos progenitoras intermediários. Cada um destes subtipos expressa um conjunto de marcadores moleculares específicos que, em conjunto com os critérios morfológicos específicos, podem ser usadas para a sua identificação. Tipicamente, técnicas de imunofluorescência, são aplicadas envolvendo anticorpos específicos de subtipo em combinação com marcadores de proliferação exo- ou endógenos. Descrevemos aqui immunolabeling métodos para a detecção e quantificação de todas as fases da neurogénese no hipocampo adulto. Estas incluem a aplicação de análogos da timidina, perfusão transcardial, processamento de tecidos, recuperação antigênica induzida por calor, ABC imunohistoquímica, múltiplos de imunofluorescência indireta, microscopia confocal e quantificação de células. Além disso, apresentamos um protocolo de imunofluorescência sequencial de múltiplas que contorna problemas usually decorrente da necessidade do uso de anticorpos primários levantados nas mesmas espécies hospedeiras. Ele permite a identificação precisa de todos os subtipos progenitoras do hipocampo, juntamente com um marcador de proliferação dentro de uma única seção. Estas técnicas são uma ferramenta poderosa para o estudo da regulação dos diferentes subtipos progenitoras em paralelo, o seu envolvimento em patologias cerebrais e o seu papel em funções específicas do cérebro.

Foram aplicados os métodos descritos acima para quantificar e caracterizar células-nascidos nas pós-natais e adultos hipocampo. Portanto, nós utilizamos wildtype e neurogênese deficiente ciclina D2 vazar (Ccnd2 KO) alojados em condições conhecidos por afetar a taxa de neurogênese (ou seja, o ambiente enriquecido, EE) 13,14. A coloração imuno-histoquímica contra DAB ou Ki67, BrdU, CldU ou IdU revelou consistentemente diferenças no número de células entre os recém-nascidos de tipo selvagem e K...

Este artigo em vídeo ilustra um protocolo abrangente para detectar e quantificar todos os estágios da neurogênese do hipocampo adulto dentro da mesma seção de tecido. Elaboramos um método para superar as limitações da imunofluorescência múltipla indireta que surgem quando anticorpos adequados de diferentes espécies hospedeiras não estão disponíveis.

A imuno-histoquímica e Rotulagem múltipla com anticorpos da espécie hospedeira Mesmas para Estudar Adulto Hippocampal Neurogênese

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

O objetivo geral deste procedimento é contornar as limitações da imunofluorescência indireta para estudar células progenitoras neurais, quando anticorpos primários adequados provenientes de espécies diferentes não estão disponíveis. Inicialmente, um análogo de timidina é injetado para marcar as células em divisão, após o que o tecido é coletado, processado e cortado em seções criostáticas.Em seguida, inicia-se a imunofluorescência múltipla sequencial. Aplica-se um anticorpo primário não marcado, que é então ligado por um anticorpo secundário marcado com fluoróforo. A seguir, os sítios abertos nos pericópios do primeiro anticorpo secundário são bloqueados com soro da espécie do anticorpo primário, e todas as imunoglobulinas que poderiam ser reconhecidas pelo segundo anticorpo secundário são cobertas com fragmentos Fab não conjugados.Isso permite que o tecido seja tratado com um segundo anticorpo primário, que pode ser marcado por um anticorpo secundário diferente. Em última análise, as imagens das seções são utilizadas para estudar o desenvolvimento e a regulação de células progenitoras neurais em resposta a estímulos específicos e seu envolvimento em funções cerebrais particulares. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a imunofluorescência múltipla simultânea, é que ela contorna problemas geralmente decorrentes da necessidade de usar anticorpos primários produzidos na mesma espécie hospedeira.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da neurogênese adulta, como a proliferação de subconjuntos de progenitores do hipocampo em resposta a estímulos fisiológicos ou farmacológicos, patologias cerebrais ou ao envelhecimento. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque a marcação múltipla com anticorpos primários da mesma espécie hospedeira pode levar a atividades cruzadas indesejadas dos anticorpos sem um bloqueio adequado. Primeiro, pese os animais a serem injetados e prepare uma solução estoque fresca do análogo de timidina a 10 miligramas por mililitro para a injeção.Quando a solução estiver pronta, prepare uma dose ajustada ao peso em uma seringa de dosagem fina com agulha de 30 graus. Em seguida, imobilize o camundongo pela nuca e injete o análogo de timidina por via intraperitoneal no ponto temporal desejado, anestesie profundamente o camundongo e realize a punção cardíaca. Perfuse com 10 mililitros de PBS gelado, seguido por 40 mililitros de solução fresca de formaldeído gelada.Em seguida, dissecar o cérebro e removê-lo, fixando-o no mesmo fixador após a fixação. Incubar os cérebros coletados por 24 horas em sacarose 10% a quatro graus Celsius. No dia seguinte, transferir os cérebros para sacarose 30% e incubar por mais 48 horas.Com os cérebros prontos para a crioproteção, congele-os em isopentano a menos 25 graus Celsius. Posteriormente, utilize um criostato para cortar secções coronais de 40 mícrons para armazenamento de longo prazo. Transfira as secções para uma solução anticongelante e mantenha-as a menos 20 graus Celsius.Inicie transferindo os cortes da solução anticongelante para TBS com a ajuda de um pincel fino. Lave bem os cortes, começando com uma lavagem durante a noite a quatro graus Celsius, seguida por cinco lavagens de 10 minutos cada à temperatura ambiente. Todas essas incubações devem ser realizadas com agitação suave contínua.Se um dos antígenos de interesse for um análogo da timidina, um passo de desnaturação com ácido clorídrico deve ser implementado neste momento, seguido por uma etapa de neutralização em tampão bore. Prossiga com a permeabilização e bloqueio dos sítios de ligação inespecíficos para anticorpos em TBS plus. Deixe essa incubação ocorrer por uma hora à temperatura ambiente, depois incube no primeiro anticorpo primário diluído em TBS plus durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte.Lave as seções três vezes em TBS e uma vez em TBST. Deixe cada banho durar 10 minutos. Em seguida, incube com o anticorpo secundário conjugado ao fluorocromo primário por três horas à temperatura ambiente.A partir de agora, proteja os cortes da exposição à luz. Após outra série de lavagens, transfira os cortes para uma solução de soro do hospedeiro a 10%, a partir da qual foram produzidos os dois anticorpos primários. Incube os cortes nesta solução por três horas para saturar os epitopos livres no primeiro anticorpo secundário.Posteriormente, lave três vezes em TBS e uma vez em TBST para remover o soro. Em seguida, prepare uma solução de TBS acrescida de 50 microgramas por mililitro de fragmentos fab monovalentes não conjugados direcionados contra a espécie hospedeira do anticorpo primário. Isso cobre os epítopos que poderiam ser reconhecidos pelo segundo anticorpo secundário.Transfira as seções para esta solução e incube durante a noite a quatro graus Celsius. Após a incubação, lave as seções pelo menos três vezes em TBS e uma vez em TBST. Durante as transferências, passe os insertos de malha contendo as seções em uma toalha de papel para remover resíduos de fab.Agora, incube as seções no segundo anticorpo primário durante a noite a quatro graus Celsius. Após outra série de lavagens, aplique o segundo anticorpo secundário por três horas à temperatura ambiente. Por fim, lave as seções três vezes em TBS e prossiga com o montagem das seções em gelatina.Seque as lâminas ao ar e cubra-as usando um meio de montagem ANTIFA imagem. Observe as seções marcadas com fluorescência em um microscópio confocal de varredura a laser. Capture pilhas de imagens em posições aleatórias ao longo de toda a extensão do giro denteado com aumento de 400 vezes.Analise pelo menos 50 células de interesse selecionadas aleatoriamente por hemisfério para a dupla marcação dos diferentes marcadores. Para calcular os números absolutos de populações específicas de células recém-nascidas, multiplique as porcentagens de células duplamente marcadas pelos números totais de células recém-nascidas estimados a partir da análise de coloração com DAB. Os métodos descritos foram utilizados para quantificar e caracterizar células recém-nascidas no hipocampo pós-natal e adulto de um ciclo com deficiência de neurogênese.No modelo de camundongo com deleção gênica, a coloração com DAB contra diferentes marcadores de proliferação, como KI-67 ou BRDU, revelou consistentemente diferenças nos números de células recém-nascidas entre camundongos selvagens e camundongos com deleção. As células recém-nascidas marcadas com BRDU puderam ser fenotipadas utilizando um protocolo convencional de imunofluorescência múltipla, aplicando simultaneamente anticorpos primários contra B-R-D-U, G-F-A-P, nestina, GFP e doublecortina. Isso permitiu a identificação bem-sucedida de células progenitoras recém-nascidas dos tipos um, dois A, dois B e três dentro de um único espécime.Alternativamente, com intervalos de tempo mais longos entre a injeção de BRDU e o sacrifício do animal, o número final de neurônios recém-nascidos poderia ser analisado por meio de imunomarcação simultânea de BRDU e novo n. O protocolo de marcação imunológica sequencial funcionou perfeitamente se as seções fossem primeiro incubadas simultaneamente com anticorpos coelho anti-KI 67, cabra anti-GFP e porquinho-da-índia anti-double cordon, e em segundo lugar, com anticorpo coelho anti-GFAP, mas não na ordem inversa. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como visualizar até quatro antígenos diferentes em uma única seção de tecido utilizando anticorpos primários produzidos no mesmo hospedeiro.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de incluir controles apropriados para eliminar a possibilidade de reatividade cruzada do anticorpo ou resultados falsos positivos. Esteja ciente de que a sequência das incubações com anticorpos primários pode influenciar fortemente o resultado do protocolo.

immunohistochemistry-multiple-labeling-with-antibodies-from-same-host

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O vídeo ilustra um método de coloração por imunofluorescência usado para examinar a neurogênese no hipocampo adulto. Inicialmente, uma seção do cérebro de camundongo é submetida a tratamento com anticorpos primários direcionados a proteínas marcadoras associadas à neurogênese em células progenitoras neuronais. Em seguida, é marcado com anticorpos secundários marcados com fluoróforos. A seção cerebral é então observada sob um microscópio confocal para distinguir vários subtipos de células...

Uma técnica de coloração por imunofluorescência para detectar a neurogênese do hipocampo adulto

Este vídeo demonstra o procedimento para colorir células-tronco neurais recém-proliferadas em seções de tecido cerebral usando incorporação de EdU, seguida de imunofluorescência para visualizar proteínas específicas, melhorando a compreensão da dinâmica e proliferação celular.

Coloração por imunofluorescência para visualização de células-tronco neurais proliferadas em seções cerebrais de camundongos

A localização e distribuição das proteínas fornecem informações importantes para a compreensão de suas funções celulares. A resolução espacial superior, de microscopia electrónica (ME) pode ser usado para determinar a localização subcelular de um dado antigénio imuno sequência. Para tecidos do sistema nervoso central (SNC), preservando a integridade estrutural durante a antigenicidade manutenção tem sido particularmente difícil em estudos de EM. Aqui, adoptar um procedimento que tem sido...

Pós-incorporação de Etiquetagem immunogold de proteínas sinápticas em culturas de hipocampo

Durante a neurogênese do hipocampo adulto, um conjunto distinto de marcadores genéticos é expresso quando uma célula-tronco neural quiescente progride sequencialmente e se desenvolve em um neurônio funcionalmente integrado no circuito. Usando a recuperação de antígeno induzida por calor, os tipos de células progenitoras que são difíceis de detectar são identificados com maior eficácia.

Recuperação de antígeno induzida por calor: um método eficaz para detectar e identificar tipos de células progenitoras durante a neurogênese do hipocampo adulto

Este protocolo de nível introdutório descreve os reagentes, equipamentos e técnicas necessárias para completar a coloração imuno-histoquímica de cérebros de roedores, usando marcadores para microglia e elementos neuronais como exemplo.

Primer para imunohistoquímica em tecido criosseccionada cérebro de um rato: Exemplo de coloração para Microglia e Neurônios

Nós descrevemos um protocolo de imuno-histoquímica para estudar o perfil de ativação dos neurônios do hipocampo após a exposição a uma tarefa de aprendizagem espacial em um modelo de rato caracterizado por déficits cognitivos de origem do desenvolvimento neurológico. Este protocolo pode ser aplicado a ambos os modelos genéticos ou farmacológicos de ratinho caracterizadas por disfunções cognitivas.

A visualização imuno-histoquímica de Hippocampal Neuron Atividade Após Spatial Aprendizagem em um rato modelo de desordens do desenvolvimento neurológico

Localizar a expressão gênica em tipos específicos de células pode ser um desafio devido à falta de anticorpos específicos. Aqui descrevemos um protocolo para detecção tripla simultânea de expressão gênica combinando hibridização in situ de RNA de fluorescência dupla com imunocoloração.

Combinando Duplo Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com imunomarcação para a detecção da expressão de três genes em secções do cérebro do rato

O objetivo deste protocolo é descrever uma aproximação para analisar o comportamento de pilhas neurais adultas da haste/progenitor em resposta à manipulação chemogenetic de um circuito neural local específico.

Regulação específica do circuito de assaying de células precursoras neurais hipocampais adultas

Este trabalho apresenta quatro das técnicas mais comuns para visualizar células BrdU positivas para medir a neurogênese adulta em ratos. Este trabalho inclui instruções para preparação de reagentes, administração análoga de timidina, perfusão transcárdica, preparação tecidual, reação imuno-histoquímica da peroxidase, imunofluorescência, amplificação de sinal, contracoloração, microscopia e análise celular.

Técnicas de imuno-histoquímica para análise da proliferação celular e neurogênese em ratos utilizando o análogo da timidina BrdU

Aqui, o protocolo descreve como realizar a dupla rotulagem de imunofluorescência usando anticorpos primários criados na mesma espécie para estudar interações hospedeiro-patógeno. Além disso, ele pode incluir o terceiro anticorpo de um host diferente neste protocolo. Esta abordagem pode ser feita em qualquer tipo de célula e patógenos.

Imunofluorescência de rotulagem dupla usando anticorpos da mesma espécie para estudar interações hospedeiro-patógeno

Apresentado aqui é um método para sequenciar núcleos únicos isolados do giro dentado do rato que exclui a maioria dos neurônios através da classificação de núcleos ativados por fluorescência (FAN). Essa abordagem gera perfis de expressão de alta qualidade e facilita o estudo da maioria dos outros tipos de células representadas no nicho, incluindo populações escassas, como células-tronco neurais.

Classificação negativa de neurônios por núcleos ativados por fluorescência combinada com sequenciamento de RNA de núcleos únicos para estudar o nicho neurogênico do hipocampo

Aprenda imunofluorescência sequencial múltipla para estudar neurogênese hipocampal adulta usando anticorpos da mesma espécie hospedeira. Este método supera limitações de especificidade e melhora a detecção de células progenitoras neurais.

A imuno-histoquímica e Rotulagem múltipla com anticorpos da espécie hospedeira Mesmas para Estudar Adulto Hippocampal Neurogênese (Vídeo) | JoVE Journal

A imuno-histoquímica e Rotulagem múltipla com anticorpos da espécie hospedeira Mesmas para Estudar Adulto Hippocampal Neurogênese

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