A imuno-histoquímica e Rotulagem múltipla com anticorpos da espécie hospedeira Mesmas para Estudar Adulto Hippocampal Neurogênese

O objetivo geral deste procedimento é contornar as limitações da imunofluorescência indireta para estudar células progenitoras neurais. Quando não estão disponíveis anticorpos primários adequados de diferentes espécies hospedeiras. Inicialmente, um análogo da timidina é injetado para rotular as células em divisão, após o que o tecido é colhido, processado e fatiado em seções criogênicas.

Em seguida, a imunofluorescência múltipla sequencial é realizada para começar. Um anticorpo primário não marcado é aplicado, que é então ligado por um anticorpo secundário marcado com fluorescência. Em seguida, as perícopes abertas no primeiro anticorpo secundário são bloqueadas com soro da espécie de anticorpo primário, e todas as imunoglobulinas que podem ser reconhecidas pelo segundo anticorpo secundário são cobertas com fragmentos fab não conjugados.

Isso permite que o tecido seja tratado com um segundo anticorpo primário, que pode ser marcado por um anticorpo secundário diferente. Em última análise, as imagens das seções são usadas para estudar o desenvolvimento e a regulação das células progenitoras neurais em resposta a estímulos específicos e seu envolvimento em funções cerebrais específicas. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a imunofluorescência múltipla simultânea, é que ela contorna os problemas geralmente decorrentes da necessidade de usar anticorpos primários criados na mesma espécie hospedeira.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurogênese adulta, como a proliferação de subconjuntos progenitores do hipocampo em resposta a estímulos fisiológicos ou farmacológicos, patologias cerebrais ou envelhecimento. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a marcação múltipla com anticorpos primários da mesma espécie hospedeira pode levar a atividades cruzadas de anticorpos indesejadas sem bloqueio adequado. Primeiro, pesar os animais a serem injetados e preparar uma nova solução estoque de análogos de timidina de 10 miligramas por mililitro para a injeção.

Quando a solução estiver pronta, prepare uma dose ajustada ao peso em uma seringa de dosagem fina com uma agulha de calibre 30. Em seguida, prenda o mouse pela nuca e injete o análogo de timidina intraperitoneal no ponto de tempo desejado, anestesie profundamente o mouse e trans cardio. Perfunda-o com 10 mililitros de PBS gelado, seguido de 40 mililitros de solução fresca de formaldeído gelado.

Em seguida, disseque o cérebro e poste, fixe-o no mesmo fixador após a fixação. Incube os cérebros coletados por 24 horas em sacarose a 10% a quatro graus Celsius. No dia seguinte, transfira os cérebros para 30% de sacarose e incube por mais 48 horas.

Com os cérebros prontos para a proteção criogênica, congele-os em pentano isop negativo de 25 graus Celsius. Mais tarde, use um criostato para cortar seções coronais de 40 mícrons para armazenamento de longo prazo. Transfira as seções para uma solução anticongelante e mantenha-as a 20 graus Celsius negativos.

Comece transferindo as seções da solução anticongelante para TBS com a ajuda de um pincel fino. Enxágue bem as seções, começando com uma lavagem noturna a quatro graus Celsius, seguida de cinco lavagens de 10 minutos em temperatura ambiente. Todas essas incubações devem ser realizadas com agitação suave e contínua.

Se um dos antígenos de interesse for um análogo da timidina, uma etapa de desnaturação do ácido clorídrico deve ser implementada neste ponto, seguida por uma etapa de neutralização no tampão do furo. Prossiga com permeável e bloqueio dos locais de ligação de anticorpos inespecíficos no TBS plus. Deixe essa incubação agir por uma hora em temperatura ambiente e, em seguida, incube no primeiro anticorpo primário diluído em TBS mais durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte.

Lave as seções três vezes em TBS e uma vez em TBST. Deixe cada banho agir por 10 minutos. Em seguida, incubar no primeiro anticorpo secundário conjugado com fluorocromo por três horas à temperatura ambiente.

A partir de agora, proteja as seções da exposição à luz. Após outra série de lavagens, transfira as seções para uma solução de soro de 10% da espécie hospedeira, a partir da qual os dois anticorpos primários foram produzidos. Incube as seções nesta solução por três horas para saturar as perícopes abertas no primeiro anticorpo secundário.

Mais tarde, enxágue três vezes em TBS e uma vez em TBST para remover o soro. Em seguida, prepare uma solução de TBS plus com 50 microgramas por mililitro de fragmentos fab monovalentes não conjugados dirigidos contra as espécies hospedeiras do anticorpo primário. Isso cobre os epítopos que poderiam ser reconhecidos pelo segundo anticorpo secundário.

Transfira as seções para esta solução e incube durante a noite a quatro graus Celsius. Após a incubação, enxágue as seções pelo menos três vezes em TBS e uma vez em TBST. Durante as transferências, esfregue as inserções de malha contendo as seções em uma toalha de papel para remover os restos residuais de fabricação.

Agora incube as seções no segundo anticorpo primário durante a noite a quatro graus Celsius. Após outra série de lavagens, aplicar o segundo anticorpo secundário durante três horas à temperatura ambiente. Por fim, lave as seções três vezes em TBS e prossiga com a montagem das seções de gelatina.

Seque as lâminas ao ar livre e cubra as lâminas usando uma imagem de meio de montagem ANTIFA. A fluorescência marcou seções com um microscópio confocal de varredura a laser. Pegue pilhas de imagens em posições aleatórias ao longo de toda a extensão do giro dentado com ampliação de 400 vezes.

Analise pelo menos 50 células de interesse selecionadas aleatoriamente por hemisfério para co-marcação dos diferentes marcadores. Para calcular números absolutos para populações específicas de células recém-nascidas, multiplique as porcentagens de células marcadas com co pelo número total de células recém-nascidas, conforme estimado a partir da análise de coloração DAB. Os métodos descritos foram utilizados para quantificar e caracterizar células recém-nascidas no hipocampo pós-natal e adulto de um ciclo deficiente em neurogênese.

D dois modelos de camundongos knockout, a coloração DAB contra diferentes marcadores de proliferação como KI 67 ou BRDU revelou consistentemente diferenças no número de células recém-nascidas entre camundongos selvagens e knockout. As células recém-nascidas marcadas com BRDU podem ser fenotipadas com um protocolo convencional de imunofluorescência múltipla de aplicação simultânea de anticorpos primários contra o ninho B-R-D-U-G-F-A-P em GFP e dupla cortena. Isso permitiu a identificação bem-sucedida de células progenitoras recém-nascidas tipo um, tipo dois A, tipo dois B e tipo três em uma única amostra.

Alternativamente, com intervalos de tempo mais longos entre a injeção de BRDU e o sacrifício do animal, os números finais de neurônios recém-nascidos podem ser analisados por coloração imunológica simultânea de BRDU novo n. O protocolo de imunomarcação sequencial funcionou perfeitamente se as seções fossem primeiro incubadas simultaneamente com anticorpos anti KI 67 de coelho, anti GFP de cabra e anti cordão duplo de porquinho-da-índia e, em segundo lugar, com anticorpo anti GFAP de coelho, mas não vice-versa. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar até quatro antígenos diferentes na seção de tecido único usando anticorpos primários criados no mesmo hospedeiro.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de incluir controles apropriados para eliminar a possibilidade de anticorpos, reatividade cruzada ou falsos positivos. Esteja ciente de que a sequência de incubações primárias de anticorpos pode influenciar fortemente o resultado do protocolo.