Name: Isothermal amplificação (lâmpada), Ensaios mediada por loop para detecção específica da espécie os de Eimeria Que infectam Galinhas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprenda a usar LAMP para diagnosticar infecções por Eimeria em galinhas com DNA intestinal. Este método rápido de 45 minutos oferece resultados visuais claros sem equipamentos caros, melhorando o manejo avícola.

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O trabalho realizado neste estudo foi apoiado em parte pelo Royal Veterinary College por meio do fundo de projetos de pesquisa estudantil, bem como pelo Conselho de Pesquisa em Biotecnologia e Ciências Biológicas e pelo Departamento de Desenvolvimento Internacional (número de concessão BB / H009337 / 2). Este manuscrito recebeu a PPB_00795 de referência do RVC.

1. Modelo de Preparação NOTA: Qualquer molde de ADN genómico de que se suspeita conter ADN derivado de uma das sete espécies de Eimeria que infectam galinhas pode ser utilizado como molde para a identificação de espécies de Eimeria à base de LAMP. Amostras de tecido intestinal para análise de diagnóstico de campo deve ser recolhida durante a rotina de post-mortem como descrito aqui. <ol><li> Escolha da secção (ou secções) do intestino para ser testado. Ver Tabela 1 para um guia para a escolha do local da amostra e as espécies mais susceptíveis de estar presentes 18 e Figura 1 para a faixa de distribuição e localização dos pontos de amostragem específicos da espécie de Eimeria. NOTA: Este é de fundamental importância, uma vez Eimeria são notavelmente local de acolhimento específico. Cada uma das espécies que infectam galinhas é definida pela região intestinal que tem como alvo 19. A decisão pode ser influenciada pela experiência anterior da fazenda, o interesse em um ou more espécies específicas de Eimeria ou outros indicadores de diagnóstico 6. </li><li> Especiais de Consumo 5 centímetros ou mais longos comprimentos da (s) secção intestinal seleccionado para testar Eimeria utilizando uma tesoura ou de um bisturi estéril. Opcionalmente, armazenar as amostras para análise subsequente num fixador, tal como por exemplo em etanol RNAlater 18 ou 95%. NOTA: Se o armazenamento em etanol a amostra deve ser cuidadosamente lavadas em tris-ácido etilenodiaminotetracético estéril (TE) de tampão antes de ser utilizado. </li><li> Corte a amostra aberta longitudinalmente, retire conteúdos mais intestinais (se houver) e raspar as células da camada mucosa livre usando a ponta de uma estéril microscópio lâmina de vidro ou uma lâmina de tesoura etanol / chama esterilizado. Opcionalmente, para uma amostra colectiva incluem células a partir de todos os quatro locais específicos das espécies intestinais em um único tubo. </li><li> Coloque o material raspados para uma de 1,5 ml com tampa de rosca microtubo estéril contendo tampão TE estéril 100 l incluindo 10% (w / v) de resina Chelex 100. </li><li> Agitar cada amostra vigorosamente durante 1 min. Certifique-se de que a tampa de rosca está firmemente fechada e, em seguida, incubar em um banho de água fervente por 10 min. </li><li> Depois de ferver permitir que cada amostra arrefecer à temperatura ambiente, durante 1-2 min. </li><li> Centrifugar cada amostra usando uma microcentrífuga a alta velocidade (por exemplo, ~ 10.000 xg) durante 1 min. </li><li> Colete 2 ul do sobrenadante resultante para ser modelo em cada ensaio LAMP a empreender. Opcionalmente, reunir mais do que um local no intestino de um único tubo para proporcionar um ensaio de multi-local. </li></ol> 2. Eimeria LAMP Primer Preparação (pré-teste) <ol><li> Prepare Eimeria LAMP stocks de primers adequados para 100 ensaios: <ol><li> Reconstituir cada iniciador Eimeria LAMP liofilizada por adição de água de grau molecular a uma concentração de 100 uM (tal como especificado pelo fabricante). Se não for especificado, calcular o volume de água necessário grau molecular using físicos e os pesos moleculares de cada um dos iniciadores. </li><li> Pipetar 60 ul de grau molecular de água em 0,5 ml de um flip-top tubo de microcentrífuga separados para cada espécie de Eimeria a ser testada. </li><li> Adicionar iniciadores FIP, BIP, F3, B3, LF e LB específico para as espécies de Eimeria alvo para a água utilizando as quantidades indicadas na Tabela 2, criando uma série de misturas de iniciadores específicos para espécies sete. </li><li> Resumidamente vórtice misturar a solução de primário, então pulse microcentrífuga e congelar até ser necessário. </li></ol></li><li> Prepara-se uma reacção mastermix LAMP para cada espécie de Eimeria a ser testada. Multiplicar as quantidades indicadas na Tabela 3, pelo número de amostras e adicionar três para um controlo positivo, de controlo negativo e a pipetagem de reposição. Pipetar para um 0,5 ou 1,5 ml flip-top tubo de microcentrífuga. </li></ol> 3. Eimeria LAMP Assay <ol><li> Espécie-específico DNA polimerase Bst / LAMP pipeta 23 ul Eimeria MasterMix em um 0.5 ml para tubos de microcentrífuga. </li><li> Adicionar molde de ADN de 2 ul (preparada na secção 1), fazendo com que um volume de reacção final de 25 ul. </li><li> Adicionar ADN genómico específicos de espécies de Eimeria 2 ul de uma reacção (controlo positivo). Adicionar 2 mL de água de grau molecular para reacção (controlo negativo). NOTA: Se o DNA genómico específico de uma espécie não está disponível uma LAMP positiva anterior ou produto de PCR convencional pode ser utilizado em vez disso. </li><li> Incubar em banho-maria ou bloco de aquecimento a 62 ° C durante 30 min. Opcionalmente, desactivar a polimerase de ADN Bst por aquecimento a 80 ° C durante 10 minutos, se a reacção não é para ser lido imediatamente. </li></ol> 4. LAMP Ensaio Leia-out <ol><li> Na conclusão da incubação avaliar a cor de cada reacção por olho sob a luz interior. Os resultados negativos aparecem rosa para violeta na cor, os resultados positivos aparecem em azul 20 sky. </li><li> Opcionalmente, confirmar o resultado do ensaio LAMP em um Laboratory por mistura de 5 uL do produto da reacção LAMP com tampão de carga do gel do ADN 1 uL por electroforese em gel de agarose, utilizando um gel de agarose a 2% em 1 x Tris / borato / EDTA-tampão (TBE), pré-corado usando um corante ácido nucleico (5 ul por 50 ml de agarose). Adicionar 5 mL de uma escada de DNA de tamanho molecular 1Kb a faixa 1 do gel para permitir o cálculo do tamanho do fragmento. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os ensaios LAMP específicos da espécie Eimeria descritos neste artigo oferecem um novo kit de ferramentas de diagnóstico em apoio ao controle eficaz de coccídios e da doença coccidiose. Os resultados da infecção eimeriana podem incluir perdas econômicas severas, bem como bem-estar das aves seriamente comprometido e aumento da suscetibilidade à colonização por patógenos zoonóticos21. Oportunidades para monitorar bandos quanto à ocorrência de algumas ou todas as espécies de Eimeria podem fornecer um alerta precoce de um colapso na eficácia do controle anticoccidiano. As principais vantagens do LAMP incluem especificidade robusta do alvo, resultante da necessidade de seis alvos de sequência de DNA diferentes, bem como alta sensibilidade, impulsionada pela inclusão de primers de alça13, embora a natureza qualitativa, não quantitativa, do LAMP possa ser considerada uma limitação. Atualmente, não é possível discriminar o escape de parasitas de baixo nível da quimioprofilaxia de rotina ou a replicação de vacinas vivas da replicação eimeriana não controlada. No entanto, a facilidade técnica do protocolo e da leitura definitiva oferece uma melhoria considerável em relação às abordagens especializadas existentes e frequentemente subjetivas baseadas em patologia e morfologia6,7. Cada ensaio pode ser concluído a um custo de ~ £ 0,75 por amostra, independentemente das despesas de mão de obra e equipamento. Assim, os ensaios LAMP também são mais econômicos do que outros diagnósticos moleculares, como PCR, uma vez que requerem uma incubação isotérmica sem a necessidade de equipamentos especializados. 
Por muitos anos, o acesso ao DNA genômico de Eimeria como modelo limitou o desenvolvimento e a aplicação de diagnósticos de campo molecular. O oocisto é a fase mais facilmente acessível do ciclo de vida eimeriano, mas a extração rotineira de DNA requer instalações laboratoriais22. Outros estágios do ciclo de vida intestinal mais lábeis requerem purificação antes da preparação do DNA para evitar a inibição da PCR e a consequente perda de sensibilidade23,24. A capacidade de extrair DNA eimeriano de qualidade adequada para LAMP usando equipamentos não mais especializados do que uma microcentrífuga e um banho-maria, complementada por adsorção de inibidores usando resina de quelex, agora promove o uso mais amplo da biologia molecular no diagnóstico eimeriano. Curiosamente, a detecção relatada de DNA quantitativo de Eimeria mensurável por PCR no tecido intestinal 20 dias após o início da infecção parasitária, 11 dias após a última saída detectável de oocisto, levanta a sugestão de que o LAMP pode ser usado para detectar a exposição ao parasita resolvida, bem como a infecção em andamento, mesmo após quaisquer lesões visíveis terem sido resolvidas25. 
O custo relativamente baixo e os baixos requisitos técnicos do diagnóstico LAMP Eimeria podem promover sua aplicação no mundo em desenvolvimento, onde outras abordagens mais estabelecidas podem não estar disponíveis ou apropriadas. Para que tal seja aplicável, cada ensaio deve ser capaz de detectar todas as estirpes que possam estar a circular em cada região. Embora a compreensão da diversidade genética predominante entre as espécies de Eimeria seja limitada26, o uso de sequências-alvo previamente validadas para uso em PCR quantitativo com cepas da África, Ásia, Europa e América do Sul fornece algumas evidências de conservação, apoiando a utilidade desses ensaios LAMP em todo o mundo10.

Produção de frango global aumentou dez vezes nos últimos 50 anos, com o mundo em desenvolvimento hospedagem quase quatro vezes a expansão testemunhou no mundo desenvolvido <a href="http://www.faostat.org">(www.faostat.org)</a> . Como a relevância da produção de frango para a segurança alimentar mundial cresceu assim também tem o perfil de patógenos que podem causar doença grave em galinhas. Um bom exemplo são as espécies de Eimeria, protozoários parasitas onipresentes que podem causar a coccidiose doença entérica 1. Onde quer que os frangos são criados um ou mais espécies de Eimeria são susceptíveis de ser comum 2-4. No mundo desenvolvido Eimeria são controladas principalmente por quimioprofilaxia, empregando programas de transporte ou de rotação para minimizar o impacto da resistência 5. As vacinas vivas também são usados ​​em sistemas onde o valor pássaro é suficiente para justificar o custo (por exemplo, criação de gado, as camadas e alguns frangos 5). Como result destas medidas coccidiose clínica é muitas vezes bem controlados, embora a infecção sub-clínica é comum 5. No mundo em desenvolvimento, a vacinação é rara e aplicação de drogas freqüentemente menos bem informados. Como consequência da coccidiose sub-clínica e clínica é mais comum e exerce um impacto econômico significativo 3. O diagnóstico da infecção eimerian tradicionalmente invocado lesão marcando post-mortem, embora até mesmo os autores do sistema de pontuação mais utilizado comentou que para algumas espécies &quot;Parece duvidoso que um tal procedimento deve ser tentada em quaisquer mas moderadamente graves infecções&quot; 6. Provas suplementares podem ser obtidas através de detecção microscópica do estágio do ciclo de vida de oocistos resistente do ambiente, em amostras de fezes ou maca, embora sobrepostos morfologia pode confundir tudo, mas o especialista 6,7. Alternativas Molecular com a reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificatio aleatórian de polimorfismos de DNA PCR (RAPD-PCR) e as tecnologias de PCR quantitativo já estão disponíveis há até 20 anos 10/08, mas até agora eles não conseguiram se tornar popular. Despesa relativa e a exigência de equipamentos de laboratório especialista ou de transformação têm limitado a sua captação, apesar da natureza muitas vezes subjetiva e tecnicamente exigente do pathology- mais velho e com base em microscopia aproxima 10,11. Tais limitações podem ser exagerados em muitas das regiões mais pobres do mundo, como o Sudeste Asiático, onde o impacto da coccidiose sobre a pobreza pode ser proporcionalmente maiores de 12. Em resposta, há uma necessidade clara de novo simples e sensível, mas rentável, ensaios de diagnóstico espécie-específicos de Eimeria. Amplificação isotérmica (LAMP) mediada por laço é um fácil de preparar ADN-polimerase dirigida técnica que é capaz de amplificar grandes quantidades de DNA. Mais importante ainda, LAMP utiliza um polymera ADN Bstse em vez da polimerase do ADN de Taq comumente utilizados em PCR, o que facilita a amplificação de ADN de uma única temperatura constante, sem a necessidade de ciclos térmicos 13,14. LAMP podem ser passíveis de aplicação no mesmo laboratório mais rudimentar ou no campo. Caracterizado por a resistência em relação a muitos inibidores de PCR, de alta sensibilidade e especificidade, ensaios de LAMP foram desenvolvidos para uma vasta gama de agentes patogénicos incluindo o vírus da doença bursal infecciosa, Clostridium perfringens e Cryptosporidium 15-17. Em resposta à demanda por novos diagnósticos específicos de espécies de Eimeria rentáveis ​​um painel de ensaios LAMP específicas para cada uma das sete espécies de Eimeria que infectam frangos tem sido desenvolvidas 18. Os pedidos de novos ensaios incluem monitoramento ocorrência do parasita, um valor especial, dada a associação de espécies como Eimeria maxima ou Eimeria necatrix com má pe econômicarformance 3,4. Outras aplicações incluem a avaliação da eficácia da estratégia anticoccidial de uma fazenda, o diagnóstico da infecção subclínica ou doença clínica e avaliação de risco apresentado por Eimeria a uma fazenda.

<table><tbody><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td>AM7024</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.321</td><td>Cuidado, altamente inflamável</td></tr><tr><td>100 x Tris-EDTA (TE) concentrado tampão</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 resina</td><td>Bio-Rad</td><td>142-1253</td><td></td></tr><tr><td>Água de grau molecular</td><td>Invitrogen</td><td>10977035</td><td></td></tr><tr><td>E. acervulina F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CCTAACATTTCGCTTCACGGAC</td></tr><tr><td>E. acervulina B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*ATGAGCAAGTGGAACACCTTG</td></tr><tr><td>E. acervulina FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*AGAGCACAGTGGCAGTGC-AGCAGACAGCATGGCTTACCT</td></tr><tr><td>E. acervulina BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAAGACCCTCTGAAGAACGGA-CCTTCTCACCGCTTACCGG</td></tr><tr><td>E. acervulina LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TAAGGTTACACCCGTGGAGG</td></tr><tr><td>E. acervulina LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCCATGCACAAAGCGACTT</td></tr><tr><td>E. brunetti F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GGCCATCAAGTTCCATGAGC</td></tr><tr><td>E. brunetti B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TCAACCTCCTGAGTGTGGTT</td></tr><tr><td>E. brunetti FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>* GAAAATGCCTTCGTAGCTGCT-GCTGGGTACGGAGCGTCTT</td></tr><tr><td>E. brunetti BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TACTTCCTAGGATCCATCCTCGC-AGTTTCGCTGCCGCCTC</td></tr><tr><td>E. brunetti LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAAACGCTCGAACATGGC</td></tr><tr><td>E. brunetti LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CTTCTCCACAGACCCAGAGGT</td></tr><tr><td>E. maxima F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>* ACTACGGAAAAGTGCGTAGCT</td></tr><tr><td>E. maxima B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CCTTCCTCCCTTCTGAAAACTG</td></tr><tr><td>E. maxima FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAGTCACTGCTGATGTACCAAA AG-GAACTATGCCGCTTTCCCCTG</td></tr><tr><td>E. maxima BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*AGAATGCGGATTTGTTAGCAGC-AGCAAGTCCAAGGTGTGTGTA</td></tr><tr><td>E. maxima LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>* CAAGCCTACGCGGACATC</td></tr><tr><td>E. maxima LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TTATGCAGCTGGGTCAACG</td></tr><tr><td>E. mitis F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*ACGATAGCCAAGACACGTAAGG</td></tr><tr><td>E. mitis B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA</td></tr><tr><td>E. mitis FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCGGGTCGTGAGATTTAAATT AT-GGAAGATCAGGACGGGCACT</td></tr><tr><td>E. mitis BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GTTTCAGTTGATGAACAAGCGA GA-TGCGCCTCTAGAATCAAGACG</td></tr><tr><td>E. mitis LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TCCATGCATCCCCTTGTT</td></tr><tr><td>E. mitis LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGTGGGCACAGATTGATTC</td></tr><tr><td>E. necatrix F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TGGCTTTCCCGCGTACC</td></tr><tr><td>E. necatrix B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGGCCCAACACAAAGACTG</td></tr><tr><td>E. necatrix FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCTTGAGTTTTAAGCTATGCA CA-GACCCAAGCAGCTCACCAA</td></tr><tr><td>E. necatrix BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCCATGCCATTCAATGAACG-*GAGGCATACCGGCGTTGTC</td></tr><tr><td>E. necatrix LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GTCTGTAACTTGGGACGTTGT</td></tr><tr><td>E. necatrix LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAACAGCCGGAGCCTCTC</td></tr><tr><td>E. praecox F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCCCTTGTATGTTGCTGTTTCT</td></tr><tr><td>E. praecox B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCGCACGAATCTGAATCACAC</td></tr><tr><td>E. praecox FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*ATCTCCTCAAAGACTTTCGCGT A-GCGCTTGGCTATATCCATAGG</td></tr><tr><td>E. praecox BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCTCTCGTGGCATACTTGC-GCCAGGAGCCACTGATTGT</td></tr><tr><td>E. praecox LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAATAGCATTGCCAGGTGG</td></tr><tr><td>E. praecox LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GTCCACTGTCATTAATATTGC TGC</td></tr><tr><td>E. tenella F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCTTGTGAAGGTCAGCGTG</td></tr><tr><td>E. tenella B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>* GCTGAGTCCATACGTACTTCCT</td></tr><tr><td>E. tenella FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCCACTGCTATGGAAAGTCAC AC-CATAACTGGCATGCAGGT</td></tr><tr><td>E. tenella BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GTTTGGCCCGAAAGTTGTGAA GA-CGTCAGAAATTGCTGCCCAAT</td></tr><tr><td>E. tenella LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCATGTGCAGTTGAAGACA</td></tr><tr><td>E. tenella LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CCAAATGTATCTGCTAGTTATA TTAACAAG</td></tr><tr><td>10 x tampão de reação ThermoPol</td><td>New England Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1330</td><td></td></tr><tr><td>Solução de betaína (5 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300</td><td></td></tr><tr><td>Bst polimerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0275S</td><td></td></tr><tr><td>Hidroxinaftol azul</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33936</td><td>Dissolvido em água de grau molecular.</td></tr><tr><td>Agarose UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>10 x Tampão Tris/Borato/EDTA (TBE)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>Corante de carregamento de DNA azul/laranja (x6)</td><td>Promega</td><td>G1881</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1Kb Escada de DNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>SafeView mancha de ácido nucleico</td><td>NBS Biologicals</td><td>NBS-SV</td><td></td></tr></tbody></table>

isothermal amplificação (lâmpada), ensaios mediada por loop para detecção específica da espécie os de<em&gt; eimeria</em&gt; que infectam galinhas

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria espécies parasitas, protozoários que causam a doença entérica coccidiose, representam uma séria ameaça à produção e bem-estar das galinhas. Na ausência de controle eficaz, a coccidiose clínica pode ser devastadora. A resistência aos quimioprofiláticos frequentemente usados para controlar Eimeria é comum e a infecção subclínica é generalizada, influenciando as taxas de conversão alimentar e a suscetibilidade a outros patógenos, como Clostridium perfringens. Apesar da disponibilidade de ferramentas baseadas em reação em cadeia da polimerase (PCR), o diagnóstico da infecção por Eimeria ainda depende quase inteiramente de abordagens tradicionais, como pontuação de lesão e morfologia de oocistos, mas nenhuma delas é direta. As limitações das ferramentas moleculares existentes incluem a necessidade de equipamento especializado e dificuldades de acesso ao DNA como modelo. Em resposta, um protocolo simples de preparação de DNA de campo e um painel de ensaios de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) específicos da espécie foram desenvolvidos para os sete Eimeria reconhecidos por infectar o frango. Agora fornecemos um protocolo detalhado descrevendo a preparação do DNA genômico do tecido intestinal coletado post-mortem, seguido pela configuração e leitura dos ensaios LAMP. O LAMP específico da espécie Eimeria pode ser usado para monitorar a ocorrência do parasita, avaliando a eficácia da estratégia anticoccidial de uma fazenda e para diagnosticar infecções subclínicas ou doenças clínicas com valor particular quando a vigilância especializada não está disponível.

Validação do ensaio Durante a validação de cada ensaio específico LAMP-espécies de Eimeria foi testada utilizando um painel de amostras de ADN puro que representam todas as sete espécies de Eimeria que infectam o frango, assim como ADN genómico de galinha como um controle hospedeiro. Eletroforese em gel de agarose foi usado para resolver cada ensaio e demonstraram especificidade de espécie absoluta, sem acolhimento reatividade cruzada 18. Em seguida, uma série de dez vezes de diluição em série usando preparado purificado de Eimeria tenella do ADN genómico revelou um limite de sensibilidade do ensaio de entre uma e dez cópias do genoma 18. Não há limite superior foi determinado com resultados positivos alcançados até e inclusive a maior concentração (100 mil cópias do genoma) 18. Aplicação com amostras de campo Amostras coletadas para testes de Eimeria são susceptíveis de ser derivado de frangos encontrados mortos, abatidos como consequência da poor saúde ou abatidos pela vigilância da saúde sentinela, indicando um tamanho de amostra provável de entre um e três anos quando parte de uma rotina. Testando três pássaros coletados em uma fazenda de frangos de corte dos EUA como parte de um programa de vigilância produziu três séries de amostras intestinais. Aplicação das espécies específicas ensaios LAMP alvejado, priorizando os locais intestinais preferencial para cada espécie de Eimeria (Tabela 1), permitiu a identificação visual de infecção eimerian em todas as aves testadas usando hydroxynaphthol azul como um indicador (Figura 2A). A cor conseguida com uma reacção negativa ao utilizar azul LAMP hydroxynaphthol pode variar de violeta para rosa, mas é sempre diferente do azul alcançado por um resultado positivo. Confirmação por electroforese em gel de agarose proporcionou resultados comparáveis ​​(Figura 2B). Durante a aplicação de campo, o usuário pode optar por aplicar a tela cheia contra todas as sete espécies, ou alvo apenas as espécies prioritárias comoimportante ou conhecida a circulação na fazenda ou área circundante. A falha de abordagens baseadas em PCR, para se estabelecer como diagnósticos para a ocorrência de Eimeria enfatiza a necessidade de simplicidade em qualquer novo teste. Enquanto LAMP oferece preparação mais simples e processamento de PCR, a exigência de testar vários sites intestinais por ave permanece desanimador. A produção de uma única amostra de DNA agrupado por ave, o qual pode então ser testado com um ou mais ensaios de LAMP, é provável que seja mais atraente. O processamento de uma amostra reunida por ave, material colhido a partir de cada um dos locais intestinais específicas descritas na Tabela 1 e combinadas antes da preparação do DNA, para o ensaio com todos os sete ensaios LAMP representando desde que o mesmo resultado do que quando cada local intestinal foi processado separadamente (Figura 2 em comparação com a Figura 3). <img alt="Figura 1" src=&quot;/files/ftp_upload/52552/52552fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. locais de amostragem intestinais para detecção LAMP de parasitas de espécies de Eimeria que infectam galinhas. As regiões intestinais alvo de cada uma das espécies de Eimeria é realçado pelas linhas coloridas, com os locais preferidos de amostragem indicado pelo número entre as linhas pretas pontilhadas (E. acervulina: amarelo / 1, E. Brunetti: rosa / 2, E. maxima: azul / 3, E. mitis: laranja / 4, E. necatrix: vermelho / 5, E. praecox: verde / 6 e E. tenella: cinza / 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52552/52552fig2.jpg" /> Figura 2. LAMP diagnóstico de infecção eimerian from três frangos de corte comerciais. reações LAMP resolvidos usando (A) hydroxynaphthol azul, onde um céu azul reação foi positiva e uma violeta para reação rosa foi negativo, e eletroforese em gel (B) agarose. Os locais foram amostrados intestinais, como mostrado na Tabela 1 para cada uma das espécies de parasitas. A = E. acervulina, E. B = Brunetti, Ma = E. maxima, Mi = E. mitis, E. N = necatrix, E. P = praecox e T = E. tenella. Pista 1 continha a escada GeneRuler 1Kb DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52552/52552fig3.jpg" /> Figura 3. LAMP diagnóstico de infecção eimerian usando amostras reac LAMP agrupados de três frangos de corte comerciais distintas.ções resolvidos usando azul hydroxynaphthol, onde um céu azul reação foi positiva e violeta para reação rosa foi negativa. A = E. acervulina, E. B = Brunetti, Ma = E. maxima, Mi = E. mitis, E. N = necatrix, E. P = praecox e T = E. tenella. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Site de exemplo </td><td> Ensaio de espécies de Eimeria (mais provável) </td></tr><tr><td> Duodeno (D) </td><td> E. acervulina, E. praecox </td></tr><tr><td> Jejuno / íleo * (J / I) </td><td> E. maxima, E. necatrix </td></tr><tr><td> Cecos (C) </td><td> E. necatrix, E. tenella </td></tr><tr><td> Íleo terminal (TI) </td><td> E. Brunetti, E. mitis </td></tr&gt; <tr><td> Amostra colectiva (P) </td><td> E. acervulina, E. Brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox, E. tenella </td></tr></tbody></table> Tabela 1. intestinal selecção específica da região de ensaios de espécies de Eimeria candidato. A escolha de uma região a ser amostrado varia para cada uma das espécies de Eimeria, como ilustrado na Figura 1. Amostras reunidas incluem material colhido de todos os quatro locais específicos que foram então combinadas para preparação de ADN. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Primer * </td><td> Da concentração (uM) </td><td> Volume (uL) </td></tr><tr><td> Água </td><td> - </td><td> 60 </td></tr><tr><td> Atacante Inner Primer (FIP) </td><td> 100 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Backward Inner Primer (BIP) </td><td> 100 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Atacante Outer Primer (F3) </td><td> 100 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Backward Outer Primer (B3) </td><td> 100 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Circuito Forward (LF) </td><td> 100 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Circuito Backward (LB) </td><td> 100 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Total </td><td></td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Preparação de uma pré-mistura de iniciadores LAMP. Os componentes e as proporções necessárias para se preparar uma pré-mistura de iniciador para LAMP. Volumes são indicados para 100 reações lâmpada. * Identidades Primer como mostrado nos Materiais e Barkway et al (2011) 18. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Da conc n </td><td> Reacção final n conc </td><td> Volume por reacção de (l) </td></tr><tr><td> DDW </td><td> - </td><td> - </td><td> 10.1 </td></tr><tr><td> Tampão ThermoPol </td><td> X 10 </td><td> 1 x </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> 100 mM </td><td> 2 mM </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> Mix Primer * </td><td colspan="2"> Tabela 2 </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> 25 mM </td><td> 400 uM </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> Betaine </td><td> 5 M </td><td> 1 H </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Hydroxynaphthol azul </td><td> 3 mM </td><td> 120 uM </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DNA polimerase Bst </td><td> 8000 U / ml </td><td> 8 L </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Total </td><td></td><td></td><td> 23 </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Preparação de uma LAMMastermix reação P. * Específica da espécie de Eimeria.

O diagnóstico de infecção por Eimeria em galinhas continua exigente. As abordagens baseadas na morfologia do parasita e na patologia do hospedeiro são comumente inconclusivas, enquanto as abordagens moleculares baseadas em PCR provaram ser exigentes em custo e experiência. O objetivo deste protocolo é estabelecer a amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP) como um diagnóstico molecular direto para infecção eimeriana.

Isothermal amplificação (lâmpada), Ensaios mediada por loop para detecção específica da espécie os de<em&gt; Eimeria</em&gt; Que infectam Galinhas

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

O objetivo geral deste procedimento é diagnosticar a ocorrência de parasitas da espécie I myea em uma galinha ou bando de galinhas. Isso é feito preparando primeiro os reagentes para amplificação isotérmica mediada por loop ou reação da lâmpada. Em seguida, o DNA genômico total é preparado a partir de um ou mais locais intestinais post-mortem.Em seguida, o DNA genômico é adicionado à mistura principal da lâmpada e incubado. Por último, avalia-se o resultado do ensaio da lâmpada. Em última análise, o LAMP é usado para determinar a ocorrência de espécies específicas de I miria para melhorar o gerenciamento do estoque e como uma ferramenta para o diagnóstico de doenças.Portanto, a principal vantagem dessa técnica sobre os métodos tradicionais, como microscopia morfológica ou PCR, é que é menos subjetiva e não requer instalações laboratoriais caras. O uso dessa abordagem pode melhorar a saúde e o bem-estar das galinhas, melhorando o diagnóstico da infecção ariana. Para preparar o gabarito para a lâmpada Erea, escolha a seção do intestino a ser testada.Use esta tabela como um guia para a seleção do local de amostragem e as espécies de eria com maior probabilidade de estarem presentes. Isso é de fundamental importância, pois cada espécie que infecta galinhas é definida pela região intestinal que visa usando uma tesoura estéril ou um bisturi. Extirpar cinco centímetros ou mais de comprimentos das secções intestinais seleccionadas para o ensaio de eria.Abrir a amostra longitudinalmente. Remova a maior parte do conteúdo intestinal e use a borda de um microscópio de vidro estéril. Deslize ou esterilize a lâmina da tesoura para raspar as células da camada mucosa.Coloque o material raspado em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro contendo 100 microlitros de TE estéril com 10% de peso, mas célula de volume X 100 resina e aparafuse firmemente na parte superior. Agitar vigorosamente as amostras durante um minuto e, em seguida, incubar em banho-maria a ferver durante 10 minutos. Após a fervura, deixe cada amostra esfriar à temperatura ambiente por um a dois minutos.Centrifugar as amostras a 10 000 vezes G durante um minuto antes de recolher dois microlitros do sobrenadante por ensaio de lâmpada, a utilizar como modelo para preparar as primeiras fontes de ensaio da lâmpada I miria adequadas para 100 ensaios. Reconstitua cada primer liofilizado da lâmpada I miria adicionando água de grau molecular a uma concentração de 100 pipetas micromolares 60 microlitros de água de grau molecular em um tubo de microcentrífuga flip top de 0,5 mililitro separado para cada espécie de iria a ser analisada. Usando o volume mostrado nesta tabela.Adicione primers, F-I-P-B-I-P-F três B três LF e LB específicos para as espécies-alvo de eria para a água. Criando uma série de sete misturas de primers específicos para espécies. Inverta brevemente as soluções de primer para misturá-las, pulse micro fuga e congele até que seja necessário.Usando os volumes listados nesta tabela e as diretrizes do protocolo de texto, prepare uma mistura mestre de reação de lâmpada para cada espécie de iria a ser ensaiada para realizar a pipeta de ensaio de lâmpada 23 microlitros de mistura mestre de lâmpada de polimerase B-S-G-D-N-A específica da espécie IEA em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro. Adicione dois microlitros de molde de DNA previamente preparado, fazendo um volume final de reação de 25 microlitros como controle positivo. Adicione dois microlitros de DNA genômico específico da espécie eria a uma reação.Adicione dois microlitros de água de grau molecular a uma reação como controle negativo, incubando um banho-maria ou bloco de calor a 62 graus Celsius por 30 minutos. Opcionalmente, desative a polimerase B-S-T-D-N-A aquecendo a 80 graus Celsius por 10 minutos. Se a reação não for lida imediatamente após a conclusão da incubação sob luz interna, avalie a cor de cada reação a olho nu.Os resultados negativos aparecerão de cor rosa a violeta e resultados positivos aparecerão. Azul celeste opcionalmente. Para confirmar o resultado do ensaio da lâmpada, misture cinco microlitros de produto de reação da lâmpada com um microlitro de tampão de carga de gel de DNA e execute um gel de prestaína 2% ARO.Use uma escada de DNA de tamanho molecular de base assassina para determinar o tamanho do fragmento, testando três. Aves coletadas em uma granja de frangos de corte dos EUA como parte de um programa de vigilância renderam três conjuntos de amostras intestinais, conforme mostrado aqui. Aplicação direcionada dos ensaios de lâmpada específicos da espécie e priorização dos locais intestinais preferidos para cada I miria.As espécies permitiram a identificação visual de uma infecção por íris em todas as aves testadas usando o azul hidroxi natal como indicador. A cor obtida com uma reação negativa da lâmpada ao usar hidroxi pode variar do violeta ao rosa, mas é sempre distinta do azul obtido por um resultado positivo. A confirmação por eletroforese em gel aose forneceu resultados comparáveis aos mostrados aqui.A preparação do DNA a partir de uma amostra retirada por ave, representando o material coletado de cada um dos locais intestinais específicos e testado com todos os sete ensaios com lâmpada, forneceu o mesmo resultado de quando cada local intestinal foi processado separadamente Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 45 minutos se for feita corretamente seguindo este procedimento. Outras técnicas, como pontuação de lesões, também podem ser realizadas para avaliar a saúde intestinal geral.

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