Isothermal amplificação (lâmpada), Ensaios mediada por loop para detecção específica da espécie os de

O objetivo geral deste procedimento é diagnosticar a ocorrência de parasitas da espécie I myea em uma galinha ou bando de galinhas. Isso é feito preparando primeiro os reagentes para amplificação isotérmica mediada por loop ou reação da lâmpada. Em seguida, o DNA genômico total é preparado a partir de um ou mais locais intestinais post-mortem.

Em seguida, o DNA genômico é adicionado à mistura principal da lâmpada e incubado. Por último, avalia-se o resultado do ensaio da lâmpada. Em última análise, o LAMP é usado para determinar a ocorrência de espécies específicas de I miria para melhorar o gerenciamento do estoque e como uma ferramenta para o diagnóstico de doenças.

Portanto, a principal vantagem dessa técnica sobre os métodos tradicionais, como microscopia morfológica ou PCR, é que é menos subjetiva e não requer instalações laboratoriais caras. O uso dessa abordagem pode melhorar a saúde e o bem-estar das galinhas, melhorando o diagnóstico da infecção ariana. Para preparar o gabarito para a lâmpada Erea, escolha a seção do intestino a ser testada.

Use esta tabela como um guia para a seleção do local de amostragem e as espécies de eria com maior probabilidade de estarem presentes. Isso é de fundamental importância, pois cada espécie que infecta galinhas é definida pela região intestinal que visa usando uma tesoura estéril ou um bisturi. Extirpar cinco centímetros ou mais de comprimentos das secções intestinais seleccionadas para o ensaio de eria.

Abrir a amostra longitudinalmente. Remova a maior parte do conteúdo intestinal e use a borda de um microscópio de vidro estéril. Deslize ou esterilize a lâmina da tesoura para raspar as células da camada mucosa.

Coloque o material raspado em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro contendo 100 microlitros de TE estéril com 10% de peso, mas célula de volume X 100 resina e aparafuse firmemente na parte superior. Agitar vigorosamente as amostras durante um minuto e, em seguida, incubar em banho-maria a ferver durante 10 minutos. Após a fervura, deixe cada amostra esfriar à temperatura ambiente por um a dois minutos.

Centrifugar as amostras a 10 000 vezes G durante um minuto antes de recolher dois microlitros do sobrenadante por ensaio de lâmpada, a utilizar como modelo para preparar as primeiras fontes de ensaio da lâmpada I miria adequadas para 100 ensaios. Reconstitua cada primer liofilizado da lâmpada I miria adicionando água de grau molecular a uma concentração de 100 pipetas micromolares 60 microlitros de água de grau molecular em um tubo de microcentrífuga flip top de 0,5 mililitro separado para cada espécie de iria a ser analisada. Usando o volume mostrado nesta tabela.

Adicione primers, F-I-P-B-I-P-F três B três LF e LB específicos para as espécies-alvo de eria para a água. Criando uma série de sete misturas de primers específicos para espécies. Inverta brevemente as soluções de primer para misturá-las, pulse micro fuga e congele até que seja necessário.

Usando os volumes listados nesta tabela e as diretrizes do protocolo de texto, prepare uma mistura mestre de reação de lâmpada para cada espécie de iria a ser ensaiada para realizar a pipeta de ensaio de lâmpada 23 microlitros de mistura mestre de lâmpada de polimerase B-S-G-D-N-A específica da espécie IEA em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro. Adicione dois microlitros de molde de DNA previamente preparado, fazendo um volume final de reação de 25 microlitros como controle positivo. Adicione dois microlitros de DNA genômico específico da espécie eria a uma reação.

Adicione dois microlitros de água de grau molecular a uma reação como controle negativo, incubando um banho-maria ou bloco de calor a 62 graus Celsius por 30 minutos. Opcionalmente, desative a polimerase B-S-T-D-N-A aquecendo a 80 graus Celsius por 10 minutos. Se a reação não for lida imediatamente após a conclusão da incubação sob luz interna, avalie a cor de cada reação a olho nu.

Os resultados negativos aparecerão de cor rosa a violeta e resultados positivos aparecerão. Azul celeste opcionalmente. Para confirmar o resultado do ensaio da lâmpada, misture cinco microlitros de produto de reação da lâmpada com um microlitro de tampão de carga de gel de DNA e execute um gel de prestaína 2% ARO.

Use uma escada de DNA de tamanho molecular de base assassina para determinar o tamanho do fragmento, testando três. Aves coletadas em uma granja de frangos de corte dos EUA como parte de um programa de vigilância renderam três conjuntos de amostras intestinais, conforme mostrado aqui. Aplicação direcionada dos ensaios de lâmpada específicos da espécie e priorização dos locais intestinais preferidos para cada I miria.

As espécies permitiram a identificação visual de uma infecção por íris em todas as aves testadas usando o azul hidroxi natal como indicador. A cor obtida com uma reação negativa da lâmpada ao usar hidroxi pode variar do violeta ao rosa, mas é sempre distinta do azul obtido por um resultado positivo. A confirmação por eletroforese em gel aose forneceu resultados comparáveis aos mostrados aqui.

A preparação do DNA a partir de uma amostra retirada por ave, representando o material coletado de cada um dos locais intestinais específicos e testado com todos os sete ensaios com lâmpada, forneceu o mesmo resultado de quando cada local intestinal foi processado separadamente Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 45 minutos se for feita corretamente seguindo este procedimento. Outras técnicas, como pontuação de lesões, também podem ser realizadas para avaliar a saúde intestinal geral.