Name: Geração e Alongamento das embarcações da engenharia de tecidos em um modelo de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Aprenda a gerar enxertos vasculares de engenharia de tecidos funcionais usando células PiPSC e biorreatores em modelo de rato. Este método avança a medicina regenerativa cardiovascular.

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Este trabalho foi apoiado pela The British Heart Foundation e pela The Oak Foundation.

Executar todas as experiências com animais de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de uso e cuidados de animais de laboratório. 1. Preparação de Meios de Cultura <ol><li> Adicione meios de cultura para a linha de células de fibroblasto humano CCL-153: F-12K Médio, 10% de soro fetal bovino (FBS) e 100 U / ml de penicilina e estreptomicina. </li><li> Adicione reprogramação dos meios para geração de PPCPE: meio de Eagle modificado por KO Dulbecco (DMEM) contendo 20% de substituição KO Soro, 0,1 mM β-mercaptoetanol, 0,1 Mínimo mM Meio Essencial (MEM) não-aminoácidos essenciais, 10 ng / ml do factor de crescimento básico de fibroblastos 2 (bFGF-2) e 100 U / ml de penicilina e estreptomicina. Adicionar bFGF-2 recém cada vez antes de usar a mídia. </li><li> Adicione Diferenciação Meios (DM) para induzir células de músculo liso (SMC) diferenciação: α-MEM meio contendo 10% de FBS, factor de crescimento de 0,1 mM β-mercaptoetanol, 100 U / ml de penicilina e de estreptomicina e 25 ng / ml Derivado de Plaquetas(PDGF-ββ). </li><li> Adicione endotelial Diferenciação Meios (CE-MS) para induzir a diferenciação de células endoteliais (CE): crescimento endotelial meios-2 (EGM-2) meio contendo 50 ng / mL de Factor de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) e 100 U / ml de penicilina e estreptomicina. </li></ol> 2. reprogramação fibroblastos humanos em induzidas Parcialmente células-tronco pluripotentes (PPCPE) <ol><li> Cultura linha de células de fibroblastos humanos CCL-153 em 0,04% de solução de gelatina frascos revestidos em meio de cultura. </li><li> Células de passagem a cada 3 dias, à razão de 1: 6. Use as células antes da passagem 9 para otimizar a eficiência da geração de PPCPE. As células estão prontas para transfecção ao atingir 80 - 90% de confluência. </li><li> Linearizar pCAG2LMKOSimO plasmídeo polycistronic contendo 4 fatores de reprogramação octâmero vinculativo fator de transcrição 4 (OCT4), SOX2, fator Kruppel-like 4 (KLF4) e C-MYC (pCAG-OSKM). Digest 5 ug de plasmídeo com 5 unidades de enzima de restrição Pvul durante 3 horas a 37 ° C. Purificaro plasmídeo com um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Transfectar 2 x 10 6 de fibroblastos humanos com 4 ug de plasmídeo linearizado pCAG-OSKM por electroporação com o kit de fibroblasto dérmico humano (NHDF) nucleofection de acordo com o protocolo do fabricante. Suavemente semear as células transfectadas para pré 0,04% de gelatina revestida frasco T25 contendo 5 ml de pré-aquecido reprogramação mídia. </li><li> Após 24 h, alterar forma com suplementos de 25 ug / ml de neomicina para seleccionar uma população pura de células transfectadas. </li><li> Alterar médio em dias alternados até dia 4. Nota: fibroblastos humanos tornam-se PPCPE após 4 dias de reprogramação. </li></ol> 3. Diferenciação de PPCPE em endotelial e nas células musculares lisas <ol><li> PPCPE Semente em pratos colágeno IV pré-revestidos contendo DM por 4 dias para induzir a diferenciação em células musculares lisas. Alterar médio em dias alternados até dia 4. </li><li> PPCPE Semente sobre o colágeno IV pré-revestidas pratos containing endotelial-DM durante 6 dias para induzir a diferenciação em células endoteliais. Alterar médio em dias alternados até dia 6. </li></ol> 4. descelularizado Aorta Graft Preparação Nota: Todas as soluções e equipamento deve ser estéril. <ol><li> Sacrifique o mouse por deslocamento cervical e corrigir o mouse em uma posição supina sob dissecção microscópio. </li><li> Corte através do esterno e em torno da caixa torácica para abrir a cavidade torácica. Retirar o coração, pulmões e esôfago para expor a aorta. Com cuidado, retire a gordura peri-aorta com uma pinça. </li><li> Corte a aorta a partir do final anterior com uma tesoura e gentilmente segure a ponta com uma pinça sem corte. Retire a aorta da coluna vertebral para trás por dissecção romba. Feche cuidadosamente todas as artérias se ramificam a partir da aorta por ligação com um electrocoagulador bipolar e corte a partir da extremidade da ligação com uma tesoura. </li><li> Use uma seringa de 5 ml para irrigar o lúmen da aorta com 3 ml de solução salina contendo 100 U de heparina para prevenir a formação de coágulos sanguíneos. </li><li> Corte a extremidade posterior da aorta antes de se ramifica na renal. Manter a integridade da aorta é muito importante durante todo o procedimento. </li><li> Lave o lúmen da aorta ascendente com 5 ml de solução de 0,075% de dodecil sulfato de sódio (SDS), diluída em tampão fosfato salino (PBS). </li><li> Mergulhe a aorta torácica em solução SDS 0,075% em uma placa de Petri de 10 cm. Colocar a placa de Petri num agitador orbital durante 2 horas a 150 rpm à temperatura ambiente. </li><li> Lave o lúmen da aorta com 5 ml de PBS. </li><li> Mergulhe a aorta na PBS em uma placa de Petri de 10 cm. Colocar a placa de Petri num agitador orbital durante 2 horas a 150 rpm à temperatura ambiente. Refresque PBS a cada 20 min. </li><li> Lave o lúmen da aorta com 5 ml de PBS. </li><li> Manter enxerto aorta descelularizado em PBS a 4 ° C durante até uma semana. </li></ol> 5. Dupla Sementeira de PPCPE e Bioreactor Condicionado Nota: Toda a soluçãos e o equipamento deve ser estéril. Realizar todas as operações em uma capa de cultura de tecidos. <ol><li> Montar o circuito de fluxo biorreactor, como ilustrado na Figura 1. Ligue câmara de incubação, meios reservatório, bomba peristáltica, e câmara de conformidade com tubagem. Volume mínimo de meio necessário para a circulação é de 40 ml. </li><li> Pré-condição do navio descelularizado com meio de cultura por imersão da aorta em meio DM em um prato de Petri de 10 cm. Colocar a placa de Petri num agitador orbital durante 1 h, a 50 rpm à temperatura ambiente. </li><li> Inserir um centímetro de comprimento de nylon tubos (OD 0,9 milímetros, 0,75 milímetros ID) em ambas as extremidades do recipiente de descelularização sob microscópio. Amarre a embarcação e os tubos com 8-0 suturas de seda. </li><li> Montar o enxerto descelularizado aorta na câmara de incubação, ligando os tubos de nylon com as portas de entrada e de saída (1/32 &quot;) de tubagem a partir da parede da câmara. Manter a câmara de incubação com 5 ml de meio de cada vez. </li><li> Trypsinize PPCPE adicionando pré-aquecidotripsina para cobrir a placa de cultura e agite levemente o prato 10 vezes. Descarte a tripsina e deixar o prato na incubadora por 2-3 min. Adicionar meio de cultura pré-aquecido no prato e misturar o meio com as células. </li><li> Contar o número de células usando um hemocitômetro. Centrífuga de duas alíquotas de suspensões de células contendo 5 x 10 5 células por cada 5 min a 300 x g. Aspirar o sobrenadante completamente. </li><li> Depois de aspirar o sobrenadante completamente, ressuspender um sedimento dos pips sedimentos celulares em 50 ul de DM. Injetar a suspensão de células no lúmen do vaso descelularizados. </li><li> Em seguida, voltar a suspender o outro pellet pips celular em 100 ul de Matrigel. Pipeta cuidadosamente a mistura sobre o enxerto aorta descelulada. </li><li> Espere por 10-15 min até que a mistura se transforma em um estado de gel-like e uniformemente envolve em torno de superfície externa do navio. Encha a câmara de incubação com DM. </li><li> Colocar todo o biorreactor configuração em um 5% de CO2 a 37 ° C. Rodar manualmente o enxerto descelularizado 90 ° em torno do eixo longitudinal a cada meia hora durante as primeiras 2 horas. </li><li> Mantenha cultura estática durante 12 horas para permitir a adesão celular. </li><li> MS entregar através do lúmen pela bomba peristáltica para induzir a diferenciação de células de músculo liso. Iniciar a taxa de fluxo inicial de 5 ml / min e aumento gradual de 20 mL / min ao longo de 24 h. </li><li> Manter a taxa de fluxo do meio que circula em 20 ml / min durante 24 horas. </li><li> Interromper o fluxo médio e mover a configuração fora da incubadora biorreator. </li><li> Re-semente a luz do enxerto com PPCPE. Trypsinize, contar e centrífuga de 1 x 10 6 PPCPE como nos passos 5,5-5,6. Ressuspender as células em 50 ul de meio EGM-2 contendo 50 ng / ml de VEGF. Injectar a mistura de células para o lúmen do enxerto. </li><li> Alterar a forma da câmara de incubação e toda a circulação de meio EGM-2 que continha 50 ng de VEGF / mL para induzir a diferenciação endotelial. </li><li> Mova o biorreator configuração de volta ao the incubadora. Rodar manualmente o enxerto 90 ° de cada 30 min durante as primeiras 2 horas e, em seguida, manter uma cultura estática, durante 12 h. </li><li> Começar a circular o fluxo de 5 ml / min e aumento gradual de 35 ml / min. Manter a taxa de fluxo a 35 ml / min, durante 5 dias. Alterar circulando e médio câmara a cada dois dias. </li><li> Colher o enxerto de engenharia para posterior enxertia para mouse. </li></ol> 6. Alongamento das Duplo-semeado PPCPE Graft em Ratos <ol><li> Uso NOD.CB17-Prkdc scid / NcrCrl ratos macho como receptores de enxertos navio. Assegure-se sempre que os ratos são cerca de 10 semanas de idade, pesar cerca de 25 - 35 g, e estão em boas condições de saúde. </li><li> Anestesiar rato destinatário através da administração de uma combinação de Hypnorm (25 mg / kg) e Hypnovel (25 mg / kg) por via intraperitoneal. Aplique vaselina pomada oftálmica nos olhos para evitar a secura e sob anestesia. Confirme anesthetization eficiente, garantindo que os ratos têm músculos relaxados e está respirando de forma constante. <ol><li> Corrigir o mouse em decúbito dorsal com o seu pescoço raspada e estendida. Administrar sulfato de atropina (1,7 mg / kg) em combinação com os anestésicos para assegurar que o tracto respiratório do rato permanece claro. </li></ol></li><li> Prepare uma incisão na linha média da mandíbula para esterno do mouse. Sob um microscópio de dissecação com 5- a 10-vezes a amplificação, levantar as glândulas salivares direita lateralmente e remover o músculo cleidomastoid direito para expor a artéria carótida comum direita. </li><li> Suavemente remover tecidos ligados a mobilizar a artéria carótida comum direita a partir da extremidade distai para a extremidade proximal. Ligadura a porção média da artéria carótida comum, duas vezes com uma sutura de seda 8-0 e dissecar entre os dois laços. </li><li> Passe por uma braçadeira feita de tubo de nylon autoclavable em cada extremidade do vaso e corrigir cada extremidade com grampos microhemostat. </li><li> Remover laço de sutura numa extremidade e aplicar uma gota de heparina (100 U / ml). Imediatamente depois, inverter a extremidade distal do the artéria para cobrir todo o corpo cuff e corrigir o navio invertido com uma sutura 8-0 seda para o manguito. <ol><li> Repetir o mesmo procedimento para a outra porção da artéria. Lave artéria com solução salina para remover coágulos sanguíneos. </li></ol></li><li> Implantar um enxerto navio descelulada entre duas extremidades da artéria carótida, deslizando as extremidades dos vasos decelularizadas do ao longo dos punhos das artérias e fixando-o com fio de seda 8-0. Remover pinças vasculares a partir de qualquer termina antes de avaliar a pulsação do enxerto. </li><li> Coloque a glândula salivar de volta à sua posição original. Fechar a pele sobre o local cirúrgico com uma sutura interrompida utilizando um fio de sutura 6-0 de poliglactina. </li><li> Consistentemente observar os sinais vitais do rato após o procedimento for concluído, até que ele retoma a consciência. Sacrifique ratos receptores por luxação cervical e vasos colheita enxertos ou 24 horas ou 3 semanas mais tarde, para posterior análise. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm interesses financeiros conflitantes.

O protocolo atual indica um som, rápido, estratégia simples, eficiente e reprodutível em que os navios da engenharia de tecidos funcionais podem ser gerados usando PPCPE a partir de fibroblastos humanos. Esta técnica é uma ferramenta valiosa para a medicina regenerativa, engenharia de tecidos e terapia celular específico paciente potencialmente no futuro próximo. As etapas críticas para assegurar a eficácia do protocolo inclui a preparação de PPCPE, preparação de aórticos descelularizados totalmente estéreis e, semeadur...

A construção de condutas vasculares é uma estratégia fundamental para a reparação cirúrgica de vasos danificados e feridos resultantes de doenças cardiovasculares. Até à data, materiais de enxerto utilizados em cirurgia incluem biocompatível polímeros sintéticos (politetrafluoretileno [Teflon], politetrafluoretileno expandido [ePTFE; Gore-Tex] ou tereftalato de polietileno [Dacron]), enxertos, tecido autólogo (pericárdio ou veia safena) e xenotransplantes 1. Enquanto enxertos artificiais (por exemplo, Gore-Tex e Dacron) são mais comumente usados, estes materiais provável causar inúmeras complicações a curto e longo prazo que incluem estenose, a deposição de cálcio, trombo-embolia e infecções. Embora os pacientes com enxertos biológicos apresentam redução de eventos tromboembólicos, eles ainda se deparam com limitações, como a falência do enxerto secundário e durabilidade encurtado devido à calcificação degradação 2. Portanto, apesar das melhorias significativas na cirúrgico techniques longo dos anos, pesquisadores e clínicos ainda estão sobrecarregados com a necessidade de identificar a conduta ideal para doenças vasculares. Mais recentemente, no campo da engenharia de tecido vascular investigação tem gerado um conceito em que as células são incorporados em suportes biodegradáveis, com o objectivo de criar um ambiente biomimética que simboliza um recipiente funcional de um enxerto bem sucedido. Fundamentalmente, o sucesso das construções vasculares dependem de três componentes essenciais; As células que compreendem o andaime, ou seja, uma camada interior de células endoteliais e uma camada de células de músculo liso, um andaime que contém a matriz extracelular apropriado para proporcionar propriedades mecânicas comparáveis ​​à vasculatura nativa, e a sinalização celular / molecular que é necessário para iniciar / regulação reparação. Dos enxertos a longo prazo e desenvolvimento sustentado dos neo-tecidos são altamente dependentes de semeadura de células eficaz de andaimes, thereby tornar a decisão do tipo de célula de importância crítica. Vários relatos demonstram a utilização de células endoteliais maduras e células do músculo liso a partir de várias fontes para desenvolver condutas de diâmetro pequeno 3-6. Embora promissora, a falta de vasos autólogos suficientes para se obter endoteliais maduras e células musculares lisas continuam a ser um fardo considerável. Mais recentemente, as células estaminais a partir de várias fontes têm sido exploradas para aplicações de engenharia de tecidos vasculares. Células mononucleares de fato, uma grande variedade de tipos de células-tronco, incluindo células-tronco embrionárias 7, células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) 8,9, PPCPE 10,11, derivadas da medula óssea 12, células-tronco mesenquimais 13, células progenitoras endoteliais e da parede do vaso adulto -derived célula estaminal antigénio-1 (Sca-1) + de células estaminais / progenitoras 14,15 têm sido demonstradas ser capazes de se diferenciarem em células endoteliais ou funcional ou de músculo liso, em resposta a meios definidos econdições de cultura. Além disso, a capacidade de auto-renovação ilimitada das células estaminais torná-los melhores candidatos ao contrário endoteliais maduras e as células musculares lisas, que apenas se podem dividir para um número limitado de vezes antes de se submeter a paragem do crescimento e senescência. A seleção do material andaime para gerar tecido sucesso navio projetado para enxertia depende de vários fatores, tais como biocompatibilidade, propriedades biomecânicas, e taxa de biodegradação. Fundamentalmente, os materiais usados ​​para criar suportes para os enxertos devem ser biodegradáveis ​​e não será montado receptores desnecessária respostas imunes. Além disso, ele deve abranger uma porosidade adequada e microestrutura para a fixação das células e subsequente sobrevivência. Até à data, os materiais mais comuns utilizados para suportes na engenharia de tecido vascular incluem polímeros de ácido poliglicólico, ácido poliláctico, e poli-caprolactona ε 16. Mais recentemente, materiais biológicos têm decelularizadastambém sido aplicada com algum sucesso. Vários laboratórios mostraram que a semeadura vasos porcino descelularizado humano, canino ou com células autólogas proporcionado um enxerto biológico que resistiu a coagulação e a hiperplasia intimal 17-19. Outras estratégias de engenharia de tecido vascular incluem enxertos vasculares extracelulares baseada em proteínas da matriz, por exemplo, células de semeadura em gel de fibrina 13 e folhas de células geradoras sem apoio andaime 20, 21. O actual protocolo demonstra a diferenciação de PPCPE humano em endotelial funcional e células do músculo liso, a geração de um biorreactor que consiste em um recipiente de andaime descelularizado para abrigar células vasculares PPCPE derivados funcionais, e enxerto de vasos em engenharia de tecidos de imunodeficiência combinada severa (SCID ) camundongos. PPCPE são um tipo de célula ideal para usar para engenharia de tecidos de enxertos de vasos porque essas células não formam tumores em camundongos ou aumentar ética eas respostas alo-imunes. Além disso, mostramos que a estratégia para a geração de células musculares pips-células endoteliais e pips-suave é eficiente e reprodutível 10,11. Depois disso, foi elaborado um navio descelulada para a semeadura de células vasculares PPCPE derivados para imitar de perto as proteínas da matriz que existe dentro de um vaso nativo, reforçando assim a enxertia e sobrevivência eficácia. Além disso, a descelularização dos vasos antes da semeadura PPCPE impede a ocorrência de reacções inflamatórias montados por tipos de células imunes tais como os macrófagos. Mais importante, este protocolo não representa apenas uma metodologia para gerar prometendo condutas vasculares para a tradução para os seres humanos, mas também fornece valioso meio de estudar e compreender os mecanismos moleculares que governam a regeneração do tecido vascular através de modelos de mouse.

<table><tbody><tr><td>Fibroblastos Humanos CCL-153</td><td>ATCC</td><td>CCL-153</td><td>Fibroblastos embrionários humanos pré-natais</td></tr><tr><td>ATCC F-12K Medium (Modificação de Kaighn do Meio F-12 de Ham)</td> <td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal</td><td>Bovino ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Nocaute Meio DMEM otimizado para células-tronco embrionárias</td><td>Life technologies (Gibco)</td> <td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Life technologies (Invitrogen)</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Human Basic FGF-2&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-837</td><td></td></tr><tr><td>meio alfa-MEM</td><td>Tecnologias de vida (Invitrogen)</td><td>32571093</td><td></td></tr><tr><td>PDGF humano</td><td>R& D System</td><td>120-HD-001</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Gelatina 2%</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)</td><td>Addgene</td><td>20866</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Enzima de Restrição PvuI</td><td>New England Biolabs</td><td>RO150S</td><td></td></tr><tr><td>SureClean Plus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Nucelofection (Kit NHDF)</td><td>LONZA</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Neomicina</td><td>SIGMA</td><td>G418</td><td></td></tr><tr><td>KL 1500 LCD, Iluminação para Microscopia Estéreo</td><td>SCHOTT</td><td>KL 1500 LCD</td><td>Iluminação de luz fria para microscopia estéreo</td></tr><tr><td>Esteromicroscópio Zoom Nikon SMZ800</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Sal de sódio de heparina</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS Solução de estoque Reagente de biologia molecular</td><td>Severn Biotech</td><td>CAS 151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (10mg / ml)</td> <td>BD</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>Agitador IKA Vibrax com plataforma vibratória VX 7&nbsp;</td><td>Jepson Bolton, Janke & Kunkel</td><td>S32-102</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Bomba Digital Drive</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-15</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S large cartridges for pump head</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-75</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft</td><td>Cole-Parmer&nbsp;</td><td>WZ-96410-14</td><td>A tubulação passa pela bomba peristáltica</td></tr><tr><td>0.5mm ID, 0.8 mm OD Tubulação de Silicone</td><td>SILEX</td><td>N/A</td><td>As tubulações conectam a câmara de incubação, o reservatório de mídia e a câmara de conformidade&nbsp;</td></tr><tr><td>Redutor de Conexão 0.5 para 1.6, Polipropilina Natural</td><td>Ibidi</td><td>10829</td><td>Adaptador conecta acima dois tipos de tubos</td></tr> 1<tr><td>/32" Tubulação, ID 0.01" (250&micro; m) Material: PEEK</td><td>LabSmith</td><td>T-132-010P</td><td>Tubulação através da parede da câmara de incubação que conecta o enxerto com a tubulação externa</td></tr><tr><td>Conexões de uma peça&nbsp;</td><td>LabSmith</td><td>T-132-100</td><td>Fixe os tubos acima através da parede da câmara de incubação</td></tr><tr><td>Tubos de nylon (OD 0.9mm, ID 0.75mm)&nbsp;</td><td>Os tubos Smiths Medical</td><td>N/A</td><td>são inseridos em duas extremidades do enxerto de aorta</td></tr><tr><td>NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl camundongo</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suturas cirúrgicas, 8-0&nbsp; seda</td><td>ETHICON</td><td>W819</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>Vetapharm</td><td>Vm21757/4000</td><td>Neuroleptanalgésico para uso em camundongos</td></tr><tr><td>Hypnovel (Midazolam)</td><td>Roche</td><td>59467-70-8</td><td>Indução de anestesia</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Carl Zeiss</td><td>Tubo de Nylon Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Portex LTD</td><td>800/200/100/200</td><td>0,65 mm de diâmetro e 1 mm de comprimento; para fazer manguito de artéria</td></tr><tr><td>Eletrocoagulador</td><td>Martin&nbsp;</td><td>SN 54.131</td><td>Ligadura de ramos da artéria na aorta</td></tr><tr><td>Micro fórceps hemostático bipolar</td><td>Martin</td><td>80-91-12-04</td><td>Fixação das extremidades dos vasos</td></tr><tr><td>Dilatador de vasos</td><td>S & T</td><td>JFX-7</td><td></td></tr><tr><td>Dilatador de Vaso</td><td>S & T</td><td>JFL-3dZ</td><td></td></tr><tr><td>Dilatador de Vaso</td><td>S & T</td><td>D-5aZ</td><td></td></tr><tr><td>Mini aplicador&nbsp;</td><td>AESCULAP</td><td>FE572K</td><td></td></tr><tr><td>Micro clipes hemostáticos</td><td>AESCULAP</td><td>FE720K</td><td></td></tr><tr><td>Suturas cirúrgicas, 6-0 VICRYL</td><td>ETHICON</td><td>V489</td><td></td></tr></tbody></table>

geração e alongamento das embarcações da engenharia de tecidos em um modelo de rato

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

A construção de condutos vasculares é uma estratégia fundamental para o reparo cirúrgico de vasos danificados e lesados decorrentes de doenças cardiovasculares. O protocolo atual apresenta uma estratégia eficiente e reprodutível na qual enxertos de vasos de engenharia de tecidos funcionais podem ser gerados usando células-tronco pluripotentes parcialmente induzidas (PiPSC) de fibroblastos humanos. Projetamos um biorreator de andaime de vaso descelularizado, que imita de perto a estrutura da proteína da matriz e o fluxo sanguíneo que existe dentro de um vaso nativo, para semeadura de células endoteliais PiPSC ou células musculares lisas antes do enxerto em camundongos. Essa abordagem demonstrou ser vantajosa porque camundongos imunodeficientes enxertados com enxertos derivados de PiPSC apresentaram taxa de sobrevida acentuadamente aumentada 3 semanas após a cirurgia. Este protocolo representa uma ferramenta valiosa para medicina regenerativa, engenharia de tecidos e terapia celular potencialmente específica do paciente em um futuro próximo.

A geração bem sucedida de PPCPE foi confirmada 4 dias após nucleofecting fibroblastos humanos com um plasmídeo linearizado pCAG2LMKOSimO transportando quatro fatores de transcrição, Oct4, SOX2, KLF4 e c-Myc (OSKM). PPCPE apresentaram um fenótipo marcadamente distinta quando comparados com os fibroblastos (Figura 2A) e expressa os quatro factores de reprogramação no ARNm (Figura 2B) e de proteína (Figura 2C) 10 níveis. A eficácia de um enxerto vascular com bas...

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar engenharia de tecidos enxertos de vasos que são funcionais para enxerto em camundongos por semeadura dupla parcialmente célula-tronco pluripotentes induzidas (PPCPE) - derivados de células musculares lisas e PPCPE - células endoteliais derivadas em um biorreator descelulada navio andaime.

Geração e Alongamento das embarcações da engenharia de tecidos em um modelo de rato

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar enxertos de vasos produzidos com engenharia de tecidos que sejam funcionais para implante em camundongos. Isso é realizado primeiramente reprogramando fibroblastos humanos em células-tronco pluripotentes parcialmente induzidas in vitro, as quais são capazes de se diferenciar em células endoteliais e musculares lisas. Em seguida, uma aorta é removida de um camundongo sacrificado e descelularizada com solução de dodecil sulfato de sódio ou SDS para preparar os enxertos de aorta descelularizados.Em seguida, o circuito de fluxo do biorreator é montado para o semeadura dupla de células-tronco pluripotentes parcialmente induzidas. O passo final é o enxerto do enxerto de células-tronco pluripotentes parcialmente induzidas com semeadura dupla em camundongos. Por fim, a análise das taxas de mortalidade em camundongos três semanas após o enxerto é utilizada para demonstrar a funcionalidade dos enxertos vasculares produzidos por engenharia de tecidos.As implicações dessa técnica estendem-se à terapia de doenças cardiovasculares, pois demonstrou-se que ela gera com sucesso vasos sanguíneos funcionais utilizando células PIPS em um curto período de tempo. De modo geral, é muito importante manter o enxerto vascular íntegro e estéril durante todo o procedimento, especialmente para pessoas novas nesse método. Inicie este procedimento com a reprogramação de fibroblastos humanos em células-tronco pluripotentes parcialmente induzidas, ou células PIPS, transfectando as células com quatro microgramas do plasmídeo OSKM linearizado utilizando um kit de transfeção nuclear de fibroblastos dérmicos humanos.Os fibroblastos humanos tornam-se células PIPS após quatro dias de reprogramação. Após a eutanásia do camundongo por fratura cervical. Posicione o camundongo em posição supina sob um microscópio estereoscópico.Em seguida, corte através do esterno e ao redor da caixa torácica para abrir a cavidade torácica. Remova o coração, os pulmões e o esôfago para expor a aorta e, então, remova suavemente a gordura peri-aórtica com pinça. Corte a aorta a partir da extremidade anterior com tesoura e segure delicadamente a extremidade com pinça romba.Em seguida, descole a aorta da coluna vertebral por trás mediante dissecação romba. Feche cuidadosamente todas as artérias colaterais da aorta por ligadura com um coagulador eletro bipolar e corte a partir da extremidade da ligadura com tesoura. Utilize uma seringa de cinco mililitros para lavar a luz da aorta com três mililitros de solução salina contendo 100 unidades de heparina.Para evitar a formação de coágulos sanguíneos, corte a extremidade posterior da aorta antes de ela se ramificar em direção aos renais. Manter a integridade da aorta é muito importante durante todo o procedimento. Em seguida, lave a luz da aorta com cinco mililitros de 0,075.Solução de dodecil sulfato de sódio ou SDS diluída em solução salina tamponada com fosfato ou PBS imersa com a aorta rasica em solução de 0,075% de SDS em uma placa de Petri de 10 centímetros em agitador orbital durante duas horas a 150 RPM à temperatura ambiente. Em seguida, lave o lúmen da aorta com cinco mililitros de PBS. A seguir, imergir a aorta em PBS em uma placa de Petri de 10 centímetros e colocar a placa no agitador orbital a 150 RPM durante duas horas à temperatura ambiente.Renove o PBS a cada 20 minutos após duas horas. Lave a luz da aorta com cinco mililitros de PBS. Para começar, monte o circuito de fluxo do biorreator conforme descrito no protocolo textual.Em seguida, recondicione o vaso descelularizado com meio de cultura, mergulhando a aorta em meio de diferenciação em uma placa de Petri de 10 centímetros sobre um agitador orbital durante uma hora a 50 RPM em temperatura ambiente. Insira tubos de náilon de um centímetro de comprimento em ambas as extremidades do vaso descelularizado sob microscópio. Em seguida, amarre o vaso e os tubos com suturas de seda número oito zero.Monte o enxerto de aorta descelularizada na câmara de incubação conectando os tubos de náilon aos orifícios de entrada e saída na parede da câmara. Mantenha a câmara de incubação com cinco mililitros de meio a cada vez. Em seguida, a tripsina trata as células PIPS pela adição de tripsina pré-aquecida no meio.Cubra a placa de cultura e balance suavemente a placa 10 vezes. Descarte o meio e deixe a placa no incubador por dois a três minutos. Em seguida, adicione o meio de cultura pré-aquecido na placa e misture o meio com as células.Em seguida, conte o número de células utilizando um centrífugo de hemocitômetro. Duas alíquotas de suspensões celulares contendo meio milhão de células cada, durante cinco minutos a 300 vezes G. Após a supinação, ressuspenda completamente um dos pellets de células PIPS. Em 50 microlitros de dm, injete a suspensão celular na luz do vaso descelularizado.Em seguida, ressuspenda o outro pellet de células PIPS em 100 microlitros de matrigel. Pipete cuidadosamente a mistura sobre o enxerto de aorta descelularizada. Aguarde de 10 a 15 minutos até que a mistura se transforme em um estado semelhante a gel e envolva uniformemente a superfície externa do vaso.Nesse momento, monte a câmara de incubação com dm. Coloque todo o conjunto do biorreator em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Em seguida, posicione o tubo conectado entre o reservatório de meio e a câmara de complacência na bomba peristáltica.No incubador. Gire manualmente o enxerto descelularizado em 90 graus ao redor do eixo longitudinal a cada meia hora nas primeiras duas horas após manter o cultivo estático por 12 horas para permitir a entrega de DM pela luz através da bomba peristáltica, induzindo a diferenciação de células musculares lisas. Inicie a taxa de fluxo inicial em cinco mililitros por minuto.Em seguida, aplique um aumento progressivo de 20 mililitros por minuto ao longo de 24 horas após manter a taxa de fluxo do meio circulante em 20 mililitros por minuto durante 24 horas, pare o fluxo do meio e retire o bioreator do incubador. A seguir, recubra a luz do enxerto com células PIPS por meio de contagem com tripsina e centrifugação, utilizando 1 milhão de células PIPS. Como antes, re-suspenda as células em 50 microlitros de meio de crescimento endotelial.Dois contendo 50 nanogramas por mililitro de fator de crescimento endotelial vascular. Em seguida, injete a mistura celular na luz do enxerto. Troque o meio na câmara de incubação e na circulação inteira para o GM dois contendo VEGF para induzir a diferenciação endotelial.Após retornar o biorreator para o incubador, gire manualmente o enxerto 90 graus a cada meia hora nas primeiras duas horas e, em seguida, mantenha um cultivo estático por 12 horas. Após 12 horas, inicie o fluxo circulatório com cinco mililitros por minuto, aumentando progressivamente até 35 mililitros por minuto, e então mantenha a taxa de fluxo em 35 mililitros por minuto por cinco dias. Em seguida, retire o enxerto produzido cortando as extremidades dos tubos de náilon.Base o enxerto em uma placa de Petri contendo meio GM dois fresco em preparação para o enxerto no camundongo, após a anestesia do camundongo receptor. Fixe o camundongo em posição supina com o pescoço depilado e estendido. Prepare uma incisão mediana do mandíbulo até o esterno do camundongo sob um microscópio estereoscópico com ampliação de cinco a dez vezes.Eleva-se lateralmente as glândulas salivares direitas e remove-se o músculo mastoideio deslizador direito. Para expor a artéria carótida comum direita, removem-se cuidadosamente os tecidos adjacentes para mobilizar a artéria carótida comum direita desde a extremidade distal em direção à extremidade proximal. Liga-se duas vezes a porção média da artéria carótida comum com sutura de seda 8-0 e realiza-se a dissecação entre os dois pontos de ligadura. Introduz-se um enxerto feito de tubo de náilon autoclavável em cada vaso.Termine e fixe cada extremidade com grampos micro-hemostáticos. Em seguida, remova os laços de sutura em uma das extremidades e aplique uma gota de heparina imediatamente após. Inverta a extremidade distal da artéria para cobrir todo o corpo da cânula e fixe o vaso invertido com sutura de seda zero-oito à cânula.Após repetir o mesmo procedimento na outra porção da artéria, lave a artéria com solução salina para remover coágulos sanguíneos. Em seguida, implante um enxerto vascular descelularizado entre as duas extremidades da artéria carótida, deslizando as extremidades do vaso descelularizado sobre o suporte da artéria e fixando-o com oito suturas de seda zero. Remova os grampos vasculares de ambas as extremidades antes de avaliar a pulsação do enxerto, então reposicione a glândula submandibular direita em sua posição original.Fechamento da pele no local cirúrgico com sutura interrompida utilizando fio de prolactina seis zero. Prossiga com os cuidados pós-cirúrgicos conforme descrito no protocolo representativo do texto. A morfologia de fibroblastos humanos após quatro dias de reprogramação em células PIPS é mostrada aqui.Células PIPS exibiram um fenótipo acentuadamente distinto quando comparadas a fibroblastos. Conforme esperado, a descelularização completa da aorta foi obtida pelo tratamento com SDS por duas horas. Como resultado, a aorta descelularizada apareceu como um suporte acelular translúcido quando comparada a uma aorta recém-colhida.Após o duplo semeadura de células PIPS dentro da aorta descelularizada, os enxertos vasculares engenheirizados exibem propriedades de células endoteliais e musculares lisas, diferentemente dos enxertos de vasos descelularizados. Isso é visualizado aqui pela coloração verde para células endoteliais e pela coloração vermelha para células musculares lisas. Camundongos submetidos a enxertos vasculares de células PIPS exibiram uma taxa de sobrevivência de 60% três semanas após o transplante, conforme esperado.Camundongos submetidos a enxertos de vasos descelularizados apresentaram taxas de mortalidade significativamente mais altas já a partir do primeiro dia após o procedimento. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de cardiologia explorassem o uso de células PIPS e enxertos vasculares descelularizados na geração de condutos vasculares funcionais obtidos por engenharia de tecidos. Após assistir a este vídeo, espero que você tenha adquirido uma boa compreensão sobre como preparar o enxerto vascular descelularizado, como montar o biorreator e como implantar novamente o enxerto recém-preparado em camundongos.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Descrevemos os protocolos para nossos arteriosclerois enxerto do mouse (GA) modelos que envolvem a interposição de um segmento de vaso do mouse em um receptor da mesma linhagem consanguínea. Por recruzá alterações genéticas adicionais no recipiente dador, o modelo pode determinar o efeito de genes específicos em GA.

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Para melhorar o nosso conhecimento da formação neotissue celular e molecular, um modelo murino da TEVG foi recentemente desenvolvida. Os enxertos foram implantados como infra-enxertos na veia cava de interposição em camundongos C57BL / 6. Este modelo consegue resultados semelhantes aos obtidos em nossa investigação clínica, mas ao longo de um curso de tempo muito reduzido.

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Estenose de enxerto representa um obstáculo crítico em substituição de engenharia de tecidos das vias respiratórias. Para investigar os mecanismos celulares subjacentes estenose, utilizamos um modelo murino de substituição traqueal de engenharia de tecidos com células mononucleares de medula semeado (BM-MNC). Aqui, nós detalhe nosso protocolo, incluindo a fabricação de andaime, BM-MNC isolamento, enxerto semeadura e implantação.

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Aqui, é apresentado um protocolo para o implante de um enxerto vascular de engenharia tecidual na artéria carótida de camundongo usando a técnica do manguito, fornecendo um modelo animal adequado para investigar os mecanismos de regeneração do tecido vascular.

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