Ouro nanorod assistida estimulação óptica de Neuronal Cells

Este protocolo descreve como usar o aquecimento transitório associado à absorção óptica de nanobastões de ouro para estimular a diferenciação e a atividade intracelular de cálcio em células neuronais. Esses resultados potencialmente abrem novas aplicações em próteses neurais e estudos fundamentais em neurociência.

O objetivo geral deste procedimento é estimular células neuronais cultivadas com nano hastes de ouro usando um diodo laser infravermelho próximo. Isso é feito preparando primeiro as nanopartículas de ouro na densidade óptica correta. O segundo passo é cultivar as células neuronais e adicionar as nanopartículas a elas.

O próximo passo é a irradiação a laser. A etapa final é verificar a diferenciação celular através da expressão de beta três para tubulina. Em última análise, a microscopia confocal é usada para mostrar a transitoriedade do cálcio intracelular.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos procurando uma maneira de estimular o potencial de ação em neurônios individuais entre uma população de células. Demonstrando o procedimento estarão Jamie May e alunos de graduação do nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, coloque uma solução de nano haste de ouro no espectrofotômetro UV visível.

Meça a densidade óptica inicial registrando os valores de absorção de 300 nanômetros a 1000 nanômetros com uma resolução entre 0,5 a dois nanômetros. Preparar uma solução-mãe de um mililitro diluindo a amostra inicial de anoro de ouro até obter uma densidade óptica de uma centrífuga. Um mililitro da solução de nano haste de ouro duas vezes para remover qualquer excesso químico.

Em seguida, remova os sobrenadantes e ressuspenda as nano hastes de ouro em água deionizada. Para se preparar para uso em cultura de células, sonicar a solução de ouro Anoro por cinco minutos e, em seguida, esterilizá-la com luz ultravioleta por 30 minutos. Neste procedimento, prepare 500 mililitros de dmem estéril para o meio de cultura de células.

Em seguida, cultive as células neuronais NG 1 0 8 15 em 10 mililitros de meio de cultura de células em um frasco T 75, posteriormente incubado a 37 graus Celsius e atmosfera umidificada. Quando as células estiverem 70 a 80% confluentes, troque o meio por meio fresco e quente. Depois disso, separe mecanicamente as células batendo suavemente no fundo do frasco confluente.

Centrifugar uma suspensão celular durante cinco minutos a 600 G e ressuspender a paleta de células em dois mililitros de meio de diferenciação celular quente. Em seguida, veja as células em uma placa de 96 poços com 200 microlitros de meio de diferenciação celular. Incubar a amostra por um dia a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, adicione a solução de nano haste de ouro e incube-a por mais 24 horas. Neste procedimento, acople o laser a uma fibra óptica monomodo e termine-o com um conector FC. Meça a potência do laser de saída com um medidor de potência padrão no terceiro dia de incubação de nano hastes.

Fixe o conector FC ao poço, irradie a amostra e o controle à temperatura ambiente por um minuto em uma onda contínua em diferentes potências de laser no quinto dia, remova o meio de diferenciação celular da amostra e fixe-o com 3,7% de volume por volume de solução de formaldeído por 10 minutos. Em seguida, permeável as células com 0,1% de volume por volume Triton X 100 por 20 minutos. Em seguida, adicione 3% de peso por volume de BSA à amostra por 60 minutos.

Para bloquear os locais de ligação de proteínas não reativas, rotule a amostra com tubulina anti-beta três durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, incube as células por 90 minutos no escuro com um anticorpo secundário apropriado. Em seguida, marque os núcleos celulares com DAP E por 10 minutos.

Em seguida, a imagem da amostra com epifluorescência ou microscopia confocal usando pelo menos uma objetiva de 20 x. Escolha os filtros de microscópio de acordo com o anticorpo secundário e selecione um filtro DAPI para visualizar os núcleos de uma célula. Nesta etapa, prepare uma solução estoque de 20% de peso por volume de F1 27 onic dissolvendo dois gramas de soluto em 10 mililitros de DMSO.

Aquecer a solução de F1 27 a 40 graus Celsius durante 20 minutos para aumentar a solubilidade. No terceiro dia de incubação anaro, prepare uma solução salina balanceada. Em seguida, remova o meio de diferenciação celular e substitua-o pela solução BSS.

Suplementado com cinco micromolares de gripe, 4:00 AM em DMSO e 0,1% de peso por volume de solução estoque F1 27 onic. Em seguida, acople o laser a uma fibra óptica monomodo e corte a ponta. Usando a técnica padrão.

Observe a ponta resultante sob um microscópio óptico para garantir que a ponta seja plana e perpendicular ao eixo da fibra. Em seguida, meça a potência do laser de saída com o medidor de potência padrão. Em seguida, insira a fibra de entrega de luz em um suporte de fibra óptica e fixe-a no microposicionador.

Depois disso, conecte um osciloscópio ao gerador de sinal. Para monitorar a modulação óptica. Use um sinal binário com frequências e comprimentos de pulso variáveis.

Em seguida, conecte o laser e use o sinal de modulação como entrada TTL para o microscópio. Use um laser de íons de argônio para excitar o corante de gripe internalizado oh 4:00 AM e o laser sincronizado dde. Para a excitação dos nano bastões endocitoses, coloque as células sob um microscópio confocal invertido e posicione a fibra de entrega de luz longe da célula-alvo no modo de iluminação de transmissão.

Em seguida, calcule o raio do feixe no alvo. Realize a imagem da amostra e controle à temperatura ambiente usando objetiva de 40 x e colete as varreduras de séries temporais com resolução de 256 por 256 pixels por quadro no modo de ida e volta. Em seguida, execute a gravação sem qualquer excitação DIO do laser para identificar qualquer interferência de laser de íon de argônio de linha de base, mostrada aqui está uma imagem de epifluorescência das células NG 1 0 8 15 roal diferenciadas cultivadas sozinhas e irradiadas com a potência do laser de 7,5 watts centímetro quadrado.

E esta é uma imagem das células cultivadas com nano hastes de ouro irradiadas com a potência do laser de 1,25 watts centímetros quadrados. Aqui está um exemplo das células neuronais NG diferenciadas 1 0 8 15 carregadas com gripe oh 4:00 AM indicador de cálcio. A imagem foi obtida usando um microscópio confocal invertido com uma objetiva de imersão em óleo de 40 x.

Esta figura mostra as amostras representativas das variações de cálcio induzidas por laser em função do tempo. Em NG 1 0 8 15, células neuronais cultivadas em condições livres de soro por três dias com nano bastonetes de ouro de poliestireno sulfonato, nano bastonetes de ouro e sem nano bastonetes. F max sobre F zero indica o aumento da fluorescência máxima detectada em NG 1 0 8 15 células neuronais Após seu desenvolvimento.

Esta técnica abriu caminho para futuras aplicações na simulação óptica de células neuronais.