Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Este experimento examina bibliotecas químicas em busca de compostos que modulam os mecanismos de controle pós-transcricional por meio das três principais regiões não traduzidas dos transcritos. Primeiro, identifique as três principais regiões de interesse não traduzidas no gene alvo. Clone este UTR de três primos no plasmídeo repórter de controle de luciferase El para criar El luciferase três transcritos quiméricos UTR primos.

Então de forma estável. Integre os dois plasmídeos em uma linhagem celular relevante para a doença semeie as células que carregam o transcrito quimérico em 96. As placas de poços os tratam com uma biblioteca de compostos por 24 horas e, em seguida, identificam as moléculas que afetam a atividade da luciferase.

Escolha as moléculas selecionadas para triagem de validação adicional e, em seguida, trate as células de controle e as células que carregam a luciferase três transcritos quiméricos UTR primários com um subconjunto de biblioteca escolhido a dedo. Os resultados diferenciarão se o efeito de um composto é mediado pelas três regiões primárias não traduzidas ou por outras sequências vetoriais. Ao contrário da maioria dos ensaios de triagem baseados em repórteres.

Ensaios que se concentram na regulação da transcrição, estes relatam que o ensaio baseado em células se concentra na identificação de compostos que modulam os níveis de transcrição de mRNA por meio de três regiões principais e traduzidas. Colha as células de neuroblastoma transfectadas de forma estável por tripsina asiática. Diluir as células até uma concentração de duas vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro.

Em RPMI contendo 10%FBS e 1%L-glutamina para 27 placas. Prepare pelo menos 250 mililitros de suspensão celular, levando em consideração o manuseio de líquidos, os volumes mortos e as etapas repetidas de pipetagem. Em seguida, despeje a suspensão da célula em um reservatório estéril e coloque-a na mesa do robô.

Carregue nove barras brancas planas. Placas inferiores de 96 poços e uma caixa de ponteiras de pipeta estéreis de 200 microlitros na mesa do robô. Misture a suspensão celular e dispense 75 microlitros de células em cada poço de nove placas.

Cubra as placas e deixe as células sedimentarem no fundo do poço por 30 minutos para minimizar os efeitos nas bordas. Em seguida, coloque todas as nove placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e incube por 24 horas. Da mesma forma, prossiga com as placas restantes nove de cada vez.

Descongele as placas da biblioteca composta à temperatura ambiente. Encha um cocho com PBS estéril e outro com 0,5% de DMSO em solução de PBS e coloque-os na mesa do robô. Para cada placa de biblioteca.

Prepare e rotule de acordo. Uma placa de diluição. Agora encha cada poço de colunas, dois a 11 das placas de diluição com 398 microlitros de PBS estéril.

Em seguida, preencha as colunas um e 12 com 50 microlitros de 0,5% DMSO em PBS estéril. Em seguida, carregar as duas placas de diluição. Duas placas de biblioteca, duas caixas de pontas estéreis de 50 microlitros e seis placas de células na mesa do robô.

Agora descubra as placas celulares, pipete dois microlitros da solução estoque de 10 milimolares de uma das duas placas de biblioteca na placa de diluição correspondente e misture bem. Usando o mesmo conjunto de dicas. Transfira três microlitros da diluição de 50 micromolares para as três placas brancas de 96 poços com código de barras contendo as células.

Substitua o conjunto completo de pontas e repita as induções celulares para a segunda placa de biblioteca. Cubra as culturas e incube por 24 horas. Em seguida, repita o processo de diluição do composto e indução celular para as placas de biblioteca restantes.

Equilibre o reagente de luciferase reconstituído de escolha à temperatura ambiente. Coloque o reservatório de luciferase na mesa do robô e despeje o reagente nele. Remova nove placas de culturas induzidas da incubadora.

Coloque-os na mesa do robô, descubra e equilibre à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 50 microlitros do reagente de luciferase por poço entre as placas. Introduza um atraso igual ao tempo de leitura de luminescência de uma placa.

Após uma incubação de 30 minutos. Primeiro registre o código de barras da placa para associá-lo ao arquivo de dados correspondente. Em seguida, coloque a primeira placa no luminômetro e meça a luminescência.

Após uma breve etapa de agitação, repita as leituras de luminescência para todas as placas de indução. Em seguida, colete o reagente de raça de Lúcifer restante e armazene-o a 20 graus Celsius negativos. Uma vez que os dados experimentais da triagem primária são processados, selecione as ocorrências para confirmar a especificidade do composto por uma cereja de contra-triagem.

Escolha as ocorrências selecionadas e crie um layout para a nova placa de filtragem, incluindo posições para controles. Em seguida, a partir das alíquotas armazenadas em tubos com código de barras 2D únicos, crie novas placas HIIT. Seguir o mesmo protocolo é para a triagem.

Preparar 3 placas de 96 poços de cada linhagem celular estável por placa hi. No dia seguinte, trate as células com compostos de biblioteca. Use cada placa hi para tratar três placas de CHP 1 34 micken, três UTR primário e três placas com células de controle em concentração de trabalho de dois micromolares em 24 horas.

Meça a atividade da luciferase em todas as placas CHP 1 34, os três conjuntos primários não traduzidos e controle. Tal como acontece com a análise de dados na triagem primária, normalize os dados experimentais dos poços tratados para a média dos controles tratados com veículos em placa. Em seguida, calcule a média e o desvio padrão sobre as réplicas para cada composto testado.

A mudança de dobra da atividade da luciferase em CHP 1 34 McIn três primos UTR versus CHP 1 34. As células de controle selecionam cortes arbitrários de alteração total superiores a 1,5 e valores de P de significância inferiores a 0,01. Este experimento examinou uma biblioteca de compostos de 2000 para potenciais moduladores de mecanismos de controle pós-transcricional exercidos através dos três UTR principais do mic e do oncogene os resultados dos sinais de luciferase de uma única das 25 placas de biblioteca representativas exibidas como uma porcentagem do veículo tratado.

Os controles mostram que a maioria dos compostos não provocou efeito aparente sobre os três principais UTR. Os acertos foram selecionados onde o valor médio e o desvio padrão foram calculados sobre todos os valores de ensaio compostos que reduzem a atividade da luciferase abaixo de 20% são provavelmente indicativos de toxicidade celular pronunciada do composto. Este gráfico mostra resultados representativos para a contra-triagem de quatro compostos selecionados designados WX, Y e Z. Ambos os compostos W e X resultam em aumento da expressão de luciferase do oncogene três prime UTR reporter, conforme indicado pela diferença de mudança de dobra e teste T Observe que, embora os efeitos de ambos os compostos W e X sejam verdadeiramente dependentes de três compostos UTR primos W não tem efeito significativo na viabilidade celular.

Enquanto o composto X exibe alguma atividade citotóxica, conforme indicado pelo sinal de luciferase normalizado em células de controle CHP 1 34, nem o composto Y nem o composto Z em concentração de dois micromolares exibem um efeito dependente de UTR de três primos nos níveis de luciferase. A diminuição da atividade da luciferase detectada na triagem primária após o tratamento com o composto Y é mais uma consequência da citotoxicidade. No caso do composto Z, o aumento da atividade da luciferase é devido à inespecífica em termos de três principais ativações UTR do promotor viral.

Uma vez que uma regulação positiva equivalente é observada em conjuntos de controle e não traduzidos Neste ensaio de alto rendimento, lembre-se de que validar o calor primário nas células de controle é fundamental para a discriminação dos compostos que atuam verdadeiramente através das três regiões principais não traduzidas daqueles compostos que operam via promotor.