Name: Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprenda a rastrear bibliotecas químicas para moduladores de mecanismos pós-transcricionais via região 3' UTR usando ensaios de luciferase em linhagens celulares. Este método identifica compostos que afetam a estabilidade do mRNA.

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Agradecemos à Fundação Italiana de Neuroblastoma pelo total apoio financeiro a este projeto.

NOTA: A taxa de transferência de tais sistemas de ensaio depende do equipamento de laboratório HTS disponível. Este protocolo é facilitada por um Tecan Freedom EVO 200 robô, que executa o manuseamento de líquidos em formato de 96 poços. A miniaturização para o formato de 384 poços é também possível. O sistema robótico de manuseamento de líquidos está posicionada sob uma câmara de fluxo laminar, a fim de manter as condições assépticas durante todos os passos experimentais. Se não automatização da movimentação de líquido está disponível, o protocolo pode ser facilmente adaptado para o formato de baixa taxa de transferência. Rastreio primário 1. Dia 1: Preparar e celulares das sementes NOTA: Semear as células para se obter 80% de confluência no tempo do ensaio de actividade de luciferase, ou seja, 48 horas após a sementeira. <ol><li> Ressuspender as células de neuroblastoma tratadas com tripsina CHP134-mycn3UTR a uma concentração de 2 x 10 5 células / ml em RPMI contendo 10% de FBS e 1% de L-glutamina. Por 27 placas preparar pelo menos 250 ml de<html> suspensão de células tendo em conta a manipulação de líquidos, bebedouros volumes mortos e passos repetidos pipetagem. Despeje a suspensão de células em reservatório estéril e colocá-lo sobre a mesa do robô. </li><li> Coloque 9 brancas de fundo plano placas de 96 poços com código de barras e uma caixa de 200 ul pontas de pipetas estéreis sobre a mesa do robô. Misture a suspensão de células por pipetagem antes de cada etapa de dispensação para evitar células sedimentação por gravidade. Dispensar 75 uL de células para cada poço de placas de 9 para obter uma densidade final de 1,5 x 10 4 culas por po. </li><li> Cobrir as placas com as tampas e deixá-los fora da incubadora durante 30 minutos para permitir que as células sedimentar para o fundo do poço. Isso irá minimizar os efeitos de borda. </li><li> Repita os passos 1.2 e 1.3, duas vezes, a fim de preparar um número total de 27 placas. </li><li> Colocar as placas a 37 ° C e 5% de CO 2 e incuba-se durante 24 horas. </li></ol> 2. Dia 2: tratar as células com compostos Biblioteca ntent &quot;&gt; NOTA: A biblioteca de moléculas pequenas Colecção Espectro consiste em 2000 compostos dispostos em 8 fileiras e 10 colunas em 25 placas de 96 poços a uma concentração de 10 mM em DMSO As cavidades sobre os primeiros e últimos colunas são deixados vazios para os controlos. ensaios de rastreio. Composto são tipicamente realizadas a uma concentração de composto 1-10 uM 8. O protocolo de rastreio aqui descrito corrige 2 uM como a concentração de trabalho e 24 horas como o ponto final do ensaio. <ol><li> Descongele 9 placas biblioteca de compostos à temperatura ambiente. </li><li> Prepare duas calhas com PBS estéril e soluções de DMSO PBS-0,5% e coloque-os sobre a mesa do robô. Para cada biblioteca de placa, preparar e rotular em conformidade uma placa de diluição - um polipropileno com fundo em U de placas de 96 poços com um volume de trabalho de pelo menos 400 ul. Encher cada poço de colunas 2-11 de placas de diluição de 398 mL de PBS estéril usando dicas fixos da manipulador de líquido. Preencha colunas 1 e 12 anos, com 50 mL de PBS estérilcom DMSO 0,5%, a fim de reproduzir a concentração do veículo nos poços de controlo (0,02%). </li><li> Coloque duas placas de biblioteca, as placas de diluição correspondentemente marcados, duas caixas de 50 l pontas de pipeta estéril e seis células placas sobre a mesa do robô. Descubra placas células. </li><li> Pipetar 2 uL da solução de stock 10 mM de um dos dois pratos de biblioteca na placa de diluição correspondente e misturar bem. Isto irá resultar numa concentração de compostos intermédios 50 uM. Utilizando o mesmo conjunto de pontas, dispensar 3 ul da diluição de 50 uM em 3 placas de 96 poços com células brancas com código de barras. Este esquema de diluição resulta em 2 uM de concentração de cada composto testado de trabalho. NOTA: Para evitar manipulações desnecessárias com as pontas, use um conjunto completo de 96 pontas, desde o início, apesar de as placas de biblioteca contêm apenas 80 compostos. Isto é possível uma vez que a primeira e as últimas colunas das placas da biblioteca estão vazias. </li><li> Substitua as pontas de pipeta e repita StEP 2.4 para a segunda placa de biblioteca. </li><li> Cobrir as placas de células e devolvê-las para a incubadora durante 24 h. </li><li> Repita os passos de 2,3-2,6 mais duas vezes para as placas de biblioteca restantes. </li></ol> 3. Dia 3: Realizar ensaio de luciferase NOTA: Antes de realizar o ensaio de luciferase, é possível multiplexar com um ensaio de viabilidade celular baseado na redução de resazurina, a fim de se obter um índice de viabilidade celular de cada poço 9. Multiplexing luciferase e ensaio de viabilidade ensaios resulta numa redução de sinal da luciferase que, no entanto, pode ser ignorado se as células fornecer um alto nível suficiente de actividade de luciferase. A actividade da luciferase pode ser detectada por uma variedade de reagentes do ensaio de luciferase 10,11 comerciais e caseiros com sinal luminescente estável. <ol><li> Equilibrar o reagente luciferase reconstituído de escolha para a temperatura ambiente. Verifique se o volume é suficiente para todas as placas ensaiadas. Para 27 de placas 170 ml de reagente luciferase serão necessárias, tendo em conta a manipulação de líquidos, bebedouros volume morto e passos repetidos pipetagem. Despeje o reagente luciferase em um reservatório e coloque-o sobre a mesa do robô. </li><li> Remover 9 placas com células da incubadora, coloque-os sobre a mesa robô, descobrir e esperar até atingir a temperatura ambiente. Adicionar 50 ul de reagente de luciferase por cavidade de placa de chapa. Entre as placas, introduzir um atraso igual ao tempo de leitura de luminescência de uma placa. Isto irá assegurar que todas as placas são medidos dentro de intervalo de tempo igual a partir da adição de reagente. </li><li> Após 30 minutos de incubação, colocar a primeira placa na luminometer e medir luminescência após um breve passo tremendo. Repita o procedimento para todas as placas. Grave o código de barras de cada placa e associá-lo ao arquivo de dados correspondente para evitar erros decorrentes de um grande número de placas manipulados. </li><li> Repita os passos de 3,2-3,3 duas vezes para os restantes 18 placas com células. </li&gt; <li> Recolhe-se o reagente de luciferase restante e armazená-lo a -20 ° C. </li></ol> 4. Dia 4: Análise de Dados <ol><li> Processar dados experimentais utilizando normalização de todas as amostras para a média dos controles na placa tratados com o veículo. Para cada composto biblioteca, calcular o valor de x média e SD sobre triplicados. </li><li> Selecione up-regulação e down-regulação sucessos, definindo um limite de X ± k × SD, onde o X valor médio e SD são computadas com todos os valores de ensaio processado, e k é uma constante definida. </li><li> Escolher um limite arbitrário de corte &lt;20% dos controlos tratados com o veículo quando uma redução do sinal da luciferase é mais provavelmente associados com a toxicidade do composto. Descartando os hits abaixo deste limiar irá reduzir significativamente uma série de visitas de falso-positivos no contra-triagem. NOTA: Em vez de normalização à base de controle, dados experimentais podem ser processados ​​aplicando pontuação Z ou o seu B s analógico robustanúcleo 12. Além disso, os métodos estatísticos alternativos para seleção hit estão disponíveis 12. </li></ol> 5. Counter-screening NOTA: Os compostos identificados no rastreio primário (rotulado &quot;hits&quot;) são confirmadas e avaliadas para a especificidade por um contra-rastreio. <ol><li> Cereja escolher os hits selecionados das alíquotas armazenados em tubos com código de barras 2D individuais e criar novo &quot;hit placas&quot;, salvando o layout correspondente. Não se esqueça de deixar posições livres para controles. NOTA: Na ausência de um sistema de cherry-picking eficiente, pode-se testar tanto o controle e 3 &#39;células portadoras UTR em paralelo na triagem primária. Neste caso, a selecção específica de compostos com efeitos dependentes apenas introduzido na UTR 3 &#39;será possível após o rastreio primário eliminando a necessidade de contra-rastreio. No entanto, o rastreio paralelo em duas linhas celulares vai dobrar o ensaiocustos. </li><li> Seguindo o protocolo para o rastreio primário (seção &quot;Dia 1: Preparar e celulares das sementes&quot;), para cada um &quot;hit placa&quot; preparar três placas de 96 poços de cada CHP134-mycn3UTR e CHP134-CTRL células estáveis. </li><li> Seguindo o protocolo para o rastreio primário (seção &quot;Dia 2: tratar as células com Biblioteca compostos&quot;), use cada placa hit para tratar de três CHP134-mycn3UTR e três placas CHP134-CTRL em 2 mM concentração de trabalho. NOTA: Enquanto o contador da tela aqui descrito é realizado em triplicado, com a dose única de 2 uM, pode ser benéfico para substituir as repetições padrão e testar as visitas em 3 concentrações de diluições de 10 vezes variando de 2 uM a 20 nM. A aplicação desta abordagem não só permitiria confirmar os dados do ecrã primário, mas também para obter dados preliminares de resposta à dose sobre as visitas primárias, minimizando taxas de falsos positivos. Neste caso, uma tubagem análise diferente deve ser aplied para processar os dados experimentais e confirmar os hits. </li><li> Seguindo o protocolo para o rastreio primário (seção &quot;Dia 3: Execute Luciferase Assay&quot;), medir a atividade da luciferase em todas as placas-CHP134 mycn3UTR e CHP134-CTRL. </li><li> Seguindo o protocolo para o rastreio primário (seção &quot;Dia 4: Análise de Dados&quot;), normalizar os dados experimentais de poços tratados com a média dos controles na placa tratados com veículo e calcular a média e SD sobre repetições. Para cada composto testado, calcular a alteração vezes a actividade de luciferase em CHP134-mycn3UTR versus células CHP134-CTRL. Selecione mudança vezes arbitrária cut-offs&gt; 1,5 e significância p-valores de &lt;0,01. NOTA: Nas configurações de ensaio descritas o parâmetro determinante para o sucesso especificidade é uma mudança vezes significativa da atividade da luciferase em CHP134-mycn3UTR vs. células CHP134-CTRL. Se necessário, pode-se também avaliar a toxicidade composto realizando simultaneamente um ensaio de viabilidade celular no SEcompostos selecionada. Isso pode ser especialmente benéfico se os hits primários são contra-selecionados em uma análise de resposta à dose. Para uma dose única, a experiência indica uma forte correlação da actividade da luciferase reduzida com a diminuição da viabilidade celular 6. Portanto, diminuição da actividade de luciferase em células-alvo bem como as células de controlo pode ser considerado como um indicador de toxicidade do composto na concentração testada. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este protocolo descreve um ensaio de gene repórter baseado em células com o objetivo de identificar moduladores que visam processos pós-transcricionais dependentes de 3' UTR. Abrange o rastreio primário e o contra-rastreio e, se necessário, pode ser acompanhado por um ensaio de citotoxicidade. O resultado da triagem primária é uma série de compostos candidatos valiosos, cuja reprodutibilidade e especificidade são validadas na contra-triagem.
A identificação de hits primários é baseada em varia...

Durante um longo período de regulação de transcrição da expressão do gene foi pensada para desempenhar um importante papel, se não exclusiva no controlo da produção de proteína. Um acúmulo de evidências, no entanto, indica que a regulação pós-transcricional contribui tanto quanto, se não mais do que, a regulação da transcrição para determinar a abundância de proteína celular 1,2. Controle pós-transcricional da expressão do gene é muito mais complexo e elaborado do que se pensava anteriormente. Na verdade, todas as diversas fases de controle pós-transcricional surgiram para ser regulamentada, incluindo processamento de mRNA, localização, volume de negócios, a tradução 3, bem como o recém-descrita RNA metilação reversível 4. A partir de um número de processos de regulação pós-transcricional potencialmente afectados, o ensaio descrito a seguir concentra-se sobre aquelas envolvendo &quot;região não traduzida (3 &#39;UTR do mRNA 3). 3 &#39;UTR amplamente afeta destino mRNA, principalmente, via interação específica de ligação RNA-proteins e RNAs não-codificantes para as suas sequências reguladoras e / ou estruturas secundárias 5. Portanto, pequenas moléculas que alteram essas interações ou interferir com a montante vias de transdução de sinal vai mudar o equilíbrio que regula a abundância de proteínas. Esta abordagem terapêutica é de particular importância para patologias humanas em que existem evidências mostrando que os genes relevantes a doença estão sujeitos a regulação pós-transcricional, o qual representa, assim, um alvo potencial para a intervenção farmacológica. Portanto, os sistemas que permitam a triagem de moduladores níveis de mRNA &#39;através da interferência com os mecanismos de controle pós-transcricional em um formato de alto rendimento podem se tornar ferramentas valiosas na identificação de potenciais tratamentos novos. O ensaio do gene repórter baseado em células descrito permite a identificação de compostos capazes de modular destino ARNm através de mecanismos dependentes da sua extremidade 3 &#39;UTR. Consiste em várias diretor componentes (Figura 1) e requer poucos passos preliminares para validar a viabilidade do ensaio. Em primeiro lugar, a construção do repórter é concebido de modo a incluir a UTR 3 &#39;de um gene de interesse. A UTR 3 &#39;é fundido com a extremidade de um gene repórter, tal como luciferase de pirilampo (figura 1). Quaisquer alterações nos mecanismos de controle pós-transcricional exercidas através da inserida UTR 3 &#39;irá alterar a estabilidade e / ou a eficiência da tradução desta transcrição quimérico, resultando em níveis de luciferase variadas. Portanto, mudanças na atividade luciferase servir como medida indireta de regulação pós-transcricional afetada do gene de interesse. O segundo componente do sistema é uma construção repórter de controlo, um plasmídeo de expressão idênticos que expressa o mesmo gene repórter, mas não contém qualquer UTR 3 &#39;. Os dois plasmídeos repórter pode ser concebido no laboratório utilizando protocolos de biologia molecular convencionais ou adquiridos de fontes comerciais. A selecção de uma linha celular apropriada é essencial para a construção de ensaio. Qual linha celular é o modelo ideal depende de inúmeros fatores que vão desde a necessidade clínica, como semelhança máxima de patologia para questões apenas práticos como características disponibilidade, transfectabilidade, e de crescimento. É importante notar que antes de proceder se deve certificar-se de que a fusão da UTR 3 &#39;para o gene repórter tem um efeito esperado sobre o nível de transcrição quimérico. A ausência de diferença significativa no sinal da luciferase a partir do 3 &#39;UTR de suporte e controlo repórter construções transfectadas transientemente em células seleccionadas que indicaria que a UTR 3&#39; não é funcional neste modelo celular, o que levou para a pesquisa de outros alternativos. Para o formato de alto rendimento, os UTR 3 &#39;de suporte de controlo e de luciferase construções repórter deve ser integrado de forma estável na linha de células seleccionada. Usando um integrado de forma estável ao longo transfectadas transitoriamenteA linha celular é preferível por várias razões. Isso vai ampliar a escolha de um modelo de celular, incluindo linhas de células difíceis de transfecção, diminuir a variabilidade dos dados decorrentes de oscilações de eficiência de transfecção, diminuir os custos. Além disso, após a transfecção as células transientes são frequentemente muito sobrecarregada com um plasmídeo de ADN que conduz à saturação do sistema. Nestas configurações de um novo aumento na expressão repórter pode ser um desafio, resultando em diminuição da sensibilidade em relação a compostos upregulating potenciais. Finalmente, quando todos os componentes do ensaio são criados, é fundamental antes de se mudar para o formato de alto rendimento para determinar a viabilidade do ensaio, ou seja, se a atividade luciferase pode ser de fato para cima e para baixo-regulado especificamente através da inserido 3 &#39; UTR. Os melhores controlos seria pequenas moléculas relatados para modular a estabilidade do mRNA ou traductibilidade através da UTR 3 &#39;de interesse. Se tendo estes énão é possível, são aceitos controles substitutos imitando o efeito desejado. Estes poderiam ser miARNs ou proteínas de ligação a ARN conhecidos para exercer os seus efeitos através de ligação a UTR 3 &#39;de interesse. Avaliação de tais controlos antes da despistagem primária não só indica a funcionalidade do ensaio desenvolvido, mas também permite uma estimativa da sua gama dinâmica, sensibilidade e desempenho no formato de alto rendimento. Usando o protocolo descrito nós analisamos uma biblioteca de 2.000 composto 6. Neuroblastoma, o tumor sólido extracraniano mais comum da infância, foi usada como modelo biológico e a 3 &#39;UTR do oncogene MYCN, cuja amplificação prediz fortemente resultado adverso de neuroblastoma, como um gene alvo 7. A Figura 2 descreve o esquema experimental. A triagem foi dividida em três corridas com o tamanho do lote de 27 placas teladas em uma corrida. O lote de 27 placas incluído biblioteca Coleção Spectrumplacas n.1-n.8 + n.25 (primeira corrida), n.9-n.16 + n.25 (segunda corrida) e n.16-n.24 + n.25 (terceira pista), cada placa exibido em triplicado. Assim, uma placa de biblioteca (n.25) foi testada em todas as três corridas possibilitando comparação inter-run. O protocolo a seguir descreve uma única corrida de 9 placas de biblioteca testados em triplicado.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura 96 poços</td><td>Branco PerkinElmer</td><td>6005688</td><td></td></tr><tr><td>StorPlate 96 poços fundo em U (placa de diluição)</td><td>PerkinElmer</td><td>6008190</td><td></td></tr><tr><td>100 ml calha descartável para reagentes</td><td>Tecan</td><td>10 613 048</td><td></td></tr><tr><td>300 ml reservatório robótico descartável</td><td>VWR</td><td>PB12001301</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de robô DITI 50&nbsp; &mu; l Pontas de</td> Robô <td>30038607</td><td></td><td>Tecan</td> Estéril</tr><tr><td>DITI 200&nbsp; &mu; l Matriz</td><td>de 30038617</td><td></td><td>Tecan</td> Estéril</tr><tr><td>1.4 ml 2D Código de Barras c, Tubos de Fundo Plano</td><td>Sistema</td> de Ensaio Luciferase <td>3711</td><td></td></tr><tr><td>ONE-Glo da Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E6120</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>BE12-918F</td><td></td></tr><tr><td>PBS-1x, sem Ca2+, Mg2+</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200&nbsp; mM</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>A coleção Spectrum (biblioteca composta)</td><td>MicroSource Discovery Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Freedom EVO200 robot&nbsp;</td>Leitor multiplaca <td>Tecan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tecan F200</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de genes post-transcriptionally regulamentados

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Ambos transcrição e regulação pós-transcricional ter um impacto profundo sobre a expressão dos genes. No entanto, comumente adotadas testes de rastreio baseados em células se concentrar em regulação da transcrição, sendo essencialmente por objectivo a identificação de moléculas-alvo do promotor. Como um resultado, os mecanismos de pós-transcrição são em grande parte a descoberto pela expressão de genes de desenvolvimento de drogas específicas. Descrevemos aqui um ensaio de base celular com o objectivo de investigar o papel da &quot;região não traduzida (3 &#39;UTR a 3) na modulação do destino do seu mRNA, e a identificação de compostos capazes de modificar. O ensaio baseia-se no uso de uma construção repórter da luciferase contendo a UTR 3 &#39;de um gene de interesse integrado de forma estável numa linha celular relevante doença. O protocolo é dividido em duas partes, com o foco inicial no rastreio primário destinado à identificação de moléculas que afectam a actividade de luciferase depois de 24 horas de tratamento. A segunda parte do protocolodescreve o contra-rastreio necessário para discriminar compostos que modulam especificamente a actividade da luciferase por meio da UTR 3 &#39;. Em adição ao protocolo detalhado e os resultados representativos, nós fornecemos considerações importantes sobre o desenvolvimento do ensaio e a validação da batida (s) sobre o alvo endógeno. O ensaio do gene repórter baseado em células descrito vai permitir que os cientistas para identificar moléculas que modulam os níveis de proteína através de mecanismos de pós-transcrição dependentes de uma UTR 3 &#39;.

Utilizando a abordagem descrita, que rastreada uma biblioteca de 2.000 composto de potenciais moduladores de mecanismos de controlo pós-transcricional exercida através da 3 &#39;UTR do gene MYCN. A Figura 3 mostra os resultados da despistagem primária exemplificado por uma placa única biblioteca. Sinal da luciferase apresentada como percentagem de controlos tratados com veículo foi obtida por medição da actividade de luciferase em placas em triplicado de células CHP134-mycn3UTR tratados com com...

Aqui descrevemos um ensaio de gene repórter baseado em células como uma ferramenta valiosa para rastrear bibliotecas químicas em busca de compostos que modulam os mecanismos de controle pós-transcricional exercidos por meio de 3' UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Este experimento analisa bibliotecas químicas em busca de compostos que modulam mecanismos de controle pós-transcricional por meio da região não traduzida três prima dos transcritos. Primeiro, identifique a região não traduzida três prima de interesse no gene alvo. Clone esta UTR três prima em um plasmídeo repórter de controle de luciferase El para criar um transcrito quimérico de luciferase El com UTR três prima.Em seguida, de forma estável, integre os dois plasmídeos em uma linhagem celular relevante para a doença, semeie as células que carregam o transcrito quimérico em placas de 96 poços, trate-as com uma biblioteca de compostos por 24 horas e, então, identifique as moléculas que afetam a atividade da luciferase.Selecione cuidadosamente as moléculas escolhidas para triagem adicional de validação e, em seguida, trate tanto as células controle quanto as células portadoras do transcrito quimérico com a região UTR 3' da luciferase com um subconjunto da biblioteca previamente selecionado. Os resultados permitirão diferenciar se o efeito de um composto é mediado pela região não traduzida 3' ou por outras sequências do vetor. Diferentemente dos ensaios de triagem baseados em repórteres mais comuns.Ensaios que focam na regulação da transcrição, esses ensaios baseados em células concentram-se na identificação de compostos que modulam os níveis de transcritos de mRNA por meio da região três prima e da região traduzida. Recolha as células de neuroblastoma estavelmente transfectadas por tripsinização. Dilua as células até uma concentração de duas vezes 10 à quinta células por mililitro.Em RPMI contendo 10% de FBS e 1% de L-glutamina para 27 placas. Prepare pelo menos 250 mililitros de suspensão celular, levando em consideração o manuseio de líquidos, volumes mortos nos reservatórios e etapas repetidas de pipetagem. Em seguida, despeje a suspensão celular em um reservatório estéril e coloque-o sobre a bancada do robô.Carregue nove placas brancas de fundo plano com c&oacute;digo de barras e uma caixa de ponteiras est&eacute;reis de 200 microlitros na bancada do rob&ocirc;. Misture a suspens&atilde;o celular e, em seguida, distribua 75 microlitros de c&eacute;lulas em cada po&ccedil;o das nove placas.Cubra as placas e deixe as células sedimentarem no fundo do poço por 30 minutos para minimizar os efeitos de borda. Em seguida, coloque todas as nove placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e incube por 24 horas. Da mesma forma, prossiga com as placas restantes, nove de cada vez.Deixe descongelar as placas da biblioteca de compostos à temperatura ambiente. Encha um reservatório com PBS estéril e outro com solução de DMSO 0,5% em PBS e coloque-os sobre a bancada do robô. Para cada placa da biblioteca.Prepare e rotule adequadamente. Uma placa de diluição. Agora, preencha cada poço das colunas dois a 11 das placas de diluição com 398 microlitros de PBS estéril.Em seguida, preencha as colunas um e 12 com 50 microlitros de DMSO 0,5% em PBS estéril. Depois, carregue as duas placas de diluição. Duas placas de biblioteca, duas caixas de ponteiras estéreis de 50 microlitros e seis placas de células sobre a bancada do robô.Agora, retire a tampa das placas de células, pipete dois microlitros da solução estoque de 10 milimolares de uma das duas placas da biblioteca para a placa de diluição correspondente e misture bem. Utilizando o mesmo conjunto de ponteiras, transfira três microlitros da diluição de 50 micromolares para as três placas brancas de 96 poços, codificadas por códigos de barras, que contêm as células.Substitua todo o conjunto de ponteiras e repita as induções celulares para a segunda placa da biblioteca. Cubra as culturas e incube por 24 horas. Em seguida, repita o processo de diluição do composto e indução celular para as placas da biblioteca restantes.Equilibre o reagente de luciferase reconstituído de escolha à temperatura ambiente. Coloque o reservatório de luciferase na bancada do robô e despeje o reagente nele. Retire nove placas de culturas induzidas do incubador.Coloque-os na bancada do robô, descubra e equilibre à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 50 microlitros do reagente de luciferase por poço entre as placas. Introduza um atraso igual ao tempo de leitura de luminiscência de uma placa.Após uma incubação de 30 minutos. Primeiro, registre o código de barras da placa para associá-lo ao arquivo de dados correspondente. Em seguida, coloque a primeira placa no luminômetro e meça a luminiscência.Após uma breve etapa de agitação, repita as leituras de luminiscência para todas as placas de indução. Em seguida, recolha o restante reagente Lucifer race e armazene-o a menos 20 graus Celsius. Uma vez que os dados experimentais da triagem primária sejam processados, selecione os hits para confirmar a especificidade do composto por meio de uma triagem complementar tipo cherry-pick.Selecione as colônias positivas e crie um esquema para a nova placa de triagem, incluindo posições para os controles. Em seguida, a partir das alíquotas armazenadas em tubos individuais com códigos de barras 2D, prepare novas placas HIIT. Siga o mesmo protocolo utilizado na triagem.Prepare 3 placas de 96 poços de cada linhagem celular estável por placa hi. No dia seguinte, trate as células com os compostos da biblioteca. Utilize cada placa hi para tratar três placas de CHP 1 34 micken, três UTR primers e três placas com células controle, em concentração de trabalho de dois micromolares por 24 horas.Meça a atividade de luciferase em todas as placas CHP 1 34, bem como nos conjuntos de controle e de região não traduzida três prima. Da mesma forma que na análise de dados na triagem primária, normalize os dados experimentais das poças tratadas com a média dos controles tratados com veículo na mesma placa. Em seguida, calcule a média e o desvio padrão entre as réplicas para cada composto testado.A variação da atividade de luciferase em CHP 1 34 McIn três prime UTR versus células controle CHP 1 34. Selecionou-se arbitrariamente limites de variação superior a 1,5 e valores de significância P inferiores a 0,01. Este experimento analisou uma biblioteca de 2000 compostos em busca de possíveis moduladores dos mecanismos de controle pós-transcricionais exercidos através do três prime UTR do oncogene mic. Os resultados dos sinais de luciferase de uma única placa representativa de 25 placas da biblioteca são exibidos como porcentagem em relação ao tratamento com veículo.Os controles mostram que a maioria dos compostos não provocou efeito aparente no UTR três linhas. Os compostos ativos foram selecionados com base nos valores médios e desvios padrão calculados a partir de todos os valores do ensaio; compostos que reduziram a atividade da luciferase abaixo de 20% provavelmente indicam toxicidade celular acentuada do composto. Este gráfico mostra resultados representativos do ensaio complementar de quatro compostos selecionados designados por W, X, Y e Z. Ambos os compostos W e X resultam em aumento da expressão da luciferase a partir do repórter do UTR três linhas do oncogene, conforme indicado pela diferença na razão de variação e pelo teste T. Observe que, embora os efeitos dos compostos W e X sejam verdadeiramente dependentes do UTR três linhas, o composto W não apresenta efeito significativo sobre a viabilidade celular.Embora o composto X exiba alguma atividade citotóxica, conforme indicado pelo sinal de luciferase normalizado em células controle CHP 134, nem o composto Y nem o composto Z na concentração de dois micromolares exibem um efeito dependente da região UTR três prima sobre os níveis de luciferase. A atividade reduzida de luciferase detectada na triagem primária após tratamento com o composto Y é, na verdade, uma consequência da citotoxicidade. No caso do composto Z, o aumento da atividade de luciferase deve-se à ativação inespecífica, em termos da região UTR três prima, do promotor viral.Como uma superexpressão equivalente é observada tanto nos conjuntos de controle quanto nos não traduzidos neste ensaio de alto rendimento, lembre-se de que a validação do sinal primário nas células de controle é essencial para discriminar os compostos que atuam verdadeiramente através da região não traduzida três prima daqueles que atuam por meio do promotor.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Os métodos para o desenvolvimento e validação de um ensaio quantitativo de fluorescência para medir a actividade de potássio rectificador de entrada (Kir) canais de rastreio de alto rendimento composto é apresentado.

High-throughput screening para pequenas moléculas Moduladores de canais de potássio Interiores retificador

Apresentamos um método de triagem rápida e de baixo custo para a identificação de reguladores de transcrição usando de alto rendimento transfections robóticos e um ensaio de luciferase dual-brilho caseiro. Este protocolo gera rapidamente dados funcionais diretos side-by-side para milhares de genes e é facilmente modificável para atingir qualquer gene de interesse.

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