Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados
March 3rd, 2015
Aqui descrevemos um ensaio de gene repórter baseado em células como uma ferramenta valiosa para rastrear bibliotecas químicas em busca de compostos que modulam os mecanismos de controle pós-transcricional exercidos por meio de 3' UTR.
Este experimento examina bibliotecas químicas em busca de compostos que modulam os mecanismos de controle pós-transcricional por meio das três principais regiões não traduzidas dos transcritos. Primeiro, identifique as três principais regiões de interesse não traduzidas no gene alvo. Clone este UTR de três primos no plasmídeo repórter de controle de luciferase El para criar El luciferase três transcritos quiméricos UTR primos.
Então de forma estável. Integre os dois plasmídeos em uma linhagem celular relevante para a doença semeie as células que carregam o transcrito quimérico em 96. As placas de poços os tratam com uma biblioteca de compostos por 24 horas e, em seguida, identificam as moléculas que afetam a atividade da luciferase.
Escolha as moléculas selecionadas para triagem de validação adicional e, em seguida, trate as células de controle e as células que carregam a luciferase três transcritos quiméricos UTR primários com um subconjunto de biblioteca escolhido a dedo. Os resultados diferenciarão se o efeito de um composto é mediado pelas três regiões primárias não traduzidas ou por outras sequências vetoriais. Ao contrário da maioria dos ensaios de triagem baseados em repórteres.
Ensaios que se concentram na regulação da transcrição, estes relatam que o ensaio baseado em células se concentra na identificação de compostos que modulam os níveis de transcrição de mRNA por meio de três regiões principais e traduzidas. Colha as células de neuroblastoma transfectadas de forma estável por tripsina asiática. Diluir as células até uma concentração de duas vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro.
Em RPMI contendo 10%FBS e 1%L-glutamina para 27 placas. Prepare pelo menos 250 mililitros de suspensão celular, levando em consideração o manuseio de líquidos, os volumes mortos e as etapas repetidas de pipetagem. Em seguida, despeje a suspensão da célula em um reservatório estéril e coloque-a na mesa do robô.
Carregue nove barras brancas planas. Placas inferiores de 96 poços e uma caixa de ponteiras de pipeta estéreis de 200 microlitros na mesa do robô. Misture a suspensão celular e dispense 75 microlitros de células em cada poço de nove placas.
Cubra as placas e deixe as células sedimentarem no fundo do poço por 30 minutos para minimizar os efeitos nas bordas. Em seguida, coloque todas as nove placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e incube por 24 horas. Da mesma forma, prossiga com as placas restantes nove de cada vez.
Descongele as placas da biblioteca composta à temperatura ambiente. Encha um cocho com PBS estéril e outro com 0,5% de DMSO em solução de PBS e coloque-os na mesa do robô. Para cada placa de biblioteca.
Prepare e rotule de acordo. Uma placa de diluição. Agora encha cada poço de colunas, dois a 11 das placas de diluição com 398 microlitros de PBS estéril.
Em seguida, preencha as colunas um e 12 com 50 microlitros de 0,5% DMSO em PBS estéril. Em seguida, carregar as duas placas de diluição. Duas placas de biblioteca, duas caixas de pontas estéreis de 50 microlitros e seis placas de células na mesa do robô.
Agora descubra as placas celulares, pipete dois microlitros da solução estoque de 10 milimolares de uma das duas placas de biblioteca na placa de diluição correspondente e misture bem. Usando o mesmo conjunto de dicas. Transfira três microlitros da diluição de 50 micromolares para as três placas brancas de 96 poços com código de barras contendo as células.
Substitua o conjunto completo de pontas e repita as induções celulares para a segunda placa de biblioteca. Cubra as culturas e incube por 24 horas. Em seguida, repita o processo de diluição do composto e indução celular para as placas de biblioteca restantes.
Equilibre o reagente de luciferase reconstituído de escolha à temperatura ambiente. Coloque o reservatório de luciferase na mesa do robô e despeje o reagente nele. Remova nove placas de culturas induzidas da incubadora.
Coloque-os na mesa do robô, descubra e equilibre à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 50 microlitros do reagente de luciferase por poço entre as placas. Introduza um atraso igual ao tempo de leitura de luminescência de uma placa.
Após uma incubação de 30 minutos. Primeiro registre o código de barras da placa para associá-lo ao arquivo de dados correspondente. Em seguida, coloque a primeira placa no luminômetro e meça a luminescência.
Após uma breve etapa de agitação, repita as leituras de luminescência para todas as placas de indução. Em seguida, colete o reagente de raça de Lúcifer restante e armazene-o a 20 graus Celsius negativos. Uma vez que os dados experimentais da triagem primária são processados, selecione as ocorrências para confirmar a especificidade do composto por uma cereja de contra-triagem.
Escolha as ocorrências selecionadas e crie um layout para a nova placa de filtragem, incluindo posições para controles. Em seguida, a partir das alíquotas armazenadas em tubos com código de barras 2D únicos, crie novas placas HIIT. Seguir o mesmo protocolo é para a triagem.
Preparar 3 placas de 96 poços de cada linhagem celular estável por placa hi. No dia seguinte, trate as células com compostos de biblioteca. Use cada placa hi para tratar três placas de CHP 1 34 micken, três UTR primário e três placas com células de controle em concentração de trabalho de dois micromolares em 24 horas.
Meça a atividade da luciferase em todas as placas CHP 1 34, os três conjuntos primários não traduzidos e controle. Tal como acontece com a análise de dados na triagem primária, normalize os dados experimentais dos poços tratados para a média dos controles tratados com veículos em placa. Em seguida, calcule a média e o desvio padrão sobre as réplicas para cada composto testado.
A mudança de dobra da atividade da luciferase em CHP 1 34 McIn três primos UTR versus CHP 1 34. As células de controle selecionam cortes arbitrários de alteração total superiores a 1,5 e valores de P de significância inferiores a 0,01. Este experimento examinou uma biblioteca de compostos de 2000 para potenciais moduladores de mecanismos de controle pós-transcricional exercidos através dos três UTR principais do mic e do oncogene os resultados dos sinais de luciferase de uma única das 25 placas de biblioteca representativas exibidas como uma porcentagem do veículo tratado.
Os controles mostram que a maioria dos compostos não provocou efeito aparente sobre os três principais UTR. Os acertos foram selecionados onde o valor médio e o desvio padrão foram calculados sobre todos os valores de ensaio compostos que reduzem a atividade da luciferase abaixo de 20% são provavelmente indicativos de toxicidade celular pronunciada do composto. Este gráfico mostra resultados representativos para a contra-triagem de quatro compostos selecionados designados WX, Y e Z. Ambos os compostos W e X resultam em aumento da expressão de luciferase do oncogene três prime UTR reporter, conforme indicado pela diferença de mudança de dobra e teste T Observe que, embora os efeitos de ambos os compostos W e X sejam verdadeiramente dependentes de três compostos UTR primos W não tem efeito significativo na viabilidade celular.
Enquanto o composto X exibe alguma atividade citotóxica, conforme indicado pelo sinal de luciferase normalizado em células de controle CHP 1 34, nem o composto Y nem o composto Z em concentração de dois micromolares exibem um efeito dependente de UTR de três primos nos níveis de luciferase. A diminuição da atividade da luciferase detectada na triagem primária após o tratamento com o composto Y é mais uma consequência da citotoxicidade. No caso do composto Z, o aumento da atividade da luciferase é devido à inespecífica em termos de três principais ativações UTR do promotor viral.
Uma vez que uma regulação positiva equivalente é observada em conjuntos de controle e não traduzidos Neste ensaio de alto rendimento, lembre-se de que validar o calor primário nas células de controle é fundamental para a discriminação dos compostos que atuam verdadeiramente através das três regiões principais não traduzidas daqueles compostos que operam via promotor.
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Visão Geral
Este artigo descreve um ensaio de gene reporter baseado em células projetado para triagem de bibliotecas químicas para compostos que modulam mecanismos de controle pós-transcricional por meio da região não traduzida 3’ (UTR) dos transcritos. A metodologia envolve clonar a UTR 3’ em um plasmídeo reporter controle de luciferase e integrá-lo em uma linha celular relevante.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Expressão gênica
- Farmacologia
Fundamentos
- Mecanismos de controle pós-transcricional desempenham um papel crucial na regulação gênica.
- A UTR 3’ é uma região-chave que influencia a estabilidade do mRNA e a tradução.
- A triagem de bibliotecas químicas pode identificar novos compostos que afetam esses mecanismos.
- Ensaios reporter são ferramentas valiosas para o estudo da regulação gênica.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um ensaio robusto para triagem de compostos que afetam a regulação pós-transcricional.
- Utilizar a UTR 3’ como alvo para modular a expressão gênica.
- Aprimorar a compreensão das influências químicas na regulação gênica.
Métodos Utilizados
- Identificação da UTR 3’ de interesse no gene alvo.
- Clonagem da UTR 3’ em um plasmídeo reporter controle de luciferase.
- Integração estável dos plasmídeos em uma linha celular relevante para a doença.
- Semeadura de células em placas de 96 poços e tratamento com uma biblioteca de compostos.
Principais Resultados
- Identificação de compostos que afetam significativamente a atividade da luciferase.
- Demonstração da eficácia do ensaio na triagem de bibliotecas químicas.
- Insights sobre a modulação dos mecanismos de controle pós-transcricional.
- Aplicações potenciais em descoberta de medicamentos e estudos de regulação gênica.
Conclusões
- O ensaio desenvolvido é uma ferramenta valiosa para a triagem de compostos.
- Ele fornece insights sobre o papel da UTR 3’ na regulação gênica.
- Essa abordagem pode facilitar a descoberta de novos agentes terapêuticos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This assay addresses a critical gap in early drug discovery by enabling the identification of compounds that modulate gene expression through post-transcriptional mechanisms, a regulatory layer often overlooked in transcriptional-focused screens. By linking 3’ UTR activity to luciferase readouts in disease-relevant cells, it provides a mechanistic de-risking step for target validation, helping prioritize compounds with specific modes of action before downstream investment. The approach supports predictive confidence in lead identification by distinguishing UTR-mediated effects from promoter-driven or cytotoxic artifacts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses involving post-transcriptional regulation by linking 3’ UTR activity to compound treatment.
- Operational Value: Uses a luciferase reporter system to quantitatively assess mRNA fate modulation via the 3’ UTR in a stable, disease-relevant cellular context.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by isolating compounds that specifically affect mRNA stability or translation through defined UTR sequences.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces normalized luminescence readouts that enable dose-dependent assessment of compound effects on 3’ UTR-mediated gene regulation.
- Operational Value: Employs a counter-screening strategy to discriminate true 3’ UTR modulators from compounds acting via promoter elements or general cytotoxicity.
- Scientific Value: Generates fold-change and statistical thresholds (e.g., >1.5 fold change, p<0.01) to define hit criteria for follow-up validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant cell lines (e.g., neuroblastoma) to ensure biological context aligns with pathophysiological mechanisms of interest.
- Operational Value: Requires stable integration of the 3’ UTR-luciferase construct, enabling consistent, long-term assay performance across screening campaigns.
- Scientific Value: Facilitates translational continuity by validating hits against endogenous target expression, connecting reporter activity to native gene regulation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation and lead identification by providing mechanistic insight into post-transcriptional gene regulation before significant investment in lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of UTR-dependent gene regulation by measuring luciferase activity as a proxy for mRNA stability and translation.
- Screening: Enables high-throughput evaluation of chemical libraries with built-in counterscreening to reduce false positives from non-specific effects.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized luminescence data with statistical cutoffs to prioritize compounds for secondary validation.
- Translational Research: Connects reporter-based findings to endogenous gene expression, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform where different 3’ UTRs can be swapped to screen for regulators of multiple disease-relevant genes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by confirming compound effects are mediated through the 3’ UTR rather than transcriptional or cytotoxic mechanisms.
- Operational Value: Promotes assay reproducibility through stable cell line integration and standardized liquid handling protocols for compound delivery and detection.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering out promiscuous or toxic compounds early, reducing failure rates in later-stage preclinical studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of hits based on mechanism-specific activity, supporting better go/no-go decisions in target-focused programs.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise to clone and validate the 3’ UTR-luciferase reporter construct.
- Depends on access to high-throughput liquid handling robots and luminometers for automated compound delivery and detection.
- Necessitates cross-team standardization between assay developers, screening technologists, and data analysts to ensure consistent hit calling.
- Involves adaptation considerations when transferring the assay to different cell lines or UTR sequences, including validation of stable integration and signal window.
- Includes practical limitations such as the need to distinguish true UTR effects from artifacts via counter-screening in control cells lacking the 3’ UTR insert.
