Análise de Autophagy em

O objetivo deste procedimento é induzir e observar a autofagia em um fungo filamentoso. Isso é realizado primeiramente inoculando pequenos volumes de meio contendo nutrientes com esporos ou pequenos fragmentos de micélio. Na segunda etapa, são preparados suportes de privação nas cavidades de lâminas de microscópio de vidro, e então o inóculo é transferido para os suportes.

No passo final, as placas de privação são incubadas em uma câmara úmida para induzir a autofagia. Em última análise, a autofagia pode ser acompanhada por meio do monitoramento da translocação de proteínas marcadoras fluorescentes de interesse para as vacúolos utilizando microscopia fluorescente. Este método pode auxiliar no estudo de questões fundamentais no campo da biologia celular, como a identificação de novos compostos que modulam o processo de autofagia.

Para se preparar para um experimento de privação alimentar, se a estirpe de P cresa genum de interesse for mantida em arroz verde, coloque inicialmente dois a três grãos de arroz cobertos com micélio em um tubo de microcentrífuga de 1,5 micro, e complete o tubo com 500 microlitros de meio de crescimento com extrato de levedura e glicose ou meio GG amplo. Em seguida, agite o tubo em vórtex por 30 segundos para que os esporos se soltem do arroz e incube o tubo por um dia à temperatura ambiente. No dia seguinte, dilua a suspensão de esporos para uma concentração de um para 50 em água da torneira estéril e misture bem, caso o p criógeno seja mantido em ágar.

Use uma ponteira de pipeta para transferir pequenos pedaços do micélio para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 400 microlitros de água da torneira estéril e aproximadamente 100 miligramas de microesferas de vidro. Em seguida, agite o tubo em vórtex por dois minutos para que os micélios se fragmentem. Para cultivar o genoma PCE em uma placa de privação, aqueça primeiro a placa de aquecimento a aproximadamente 60 graus Celsius.

Em seguida, aqueça dois gramas de aros em 100 mililitros de água da torneira no micro-ondas até que a solução resultante fique completamente transparente, enquanto o aros esfria para aproximadamente 60 graus Celsius. Coloque um tubo microcêntrifugo de 1,5 mililitro por amostra com 400 microlitros de água da torneira estéril ou solução composta. Em seguida, aqueça os tubos e lâminas de microscopia na placa aquecedora por pelo menos 60 segundos.

Transfira 400 microlitros de aros a 60 graus Celsius para todos os tubos, elevando o volume total em cada tubo a 800 microlitros, e vortexe brevemente os tubos; em seguida, coloque os tubos de volta na placa de aquecimento para evitar solidificação prematura. Agora, pipete 140 microlitros da solução apropriada de aros na cavidade de cada lâmina de microscópio. Tendo o cuidado de não formar bolhas, aplane imediatamente o aros com lamínulas e, então, deixe as lâminas em repouso por aproximadamente quatro minutos.

À temperatura ambiente, quando as placas de agarose tiverem solidificado, use o polegar ou o indicador para remover cuidadosamente as lamínulas e coloque as lâminas de microscópio com as placas em uma câmara úmida. Em seguida, pipete cinco microlitros do P er genum previamente preparado no centro da placa de inanição e envolva a câmara úmida em um saco plástico para proteção adicional contra dessecação, tomando cuidado para não mover muito a caixa nem perturbar as culturas. Em seguida, armazene os inóculos à temperatura ambiente por pelo menos 20 horas antes de analisar as amostras.

No dia seguinte, transfira as lâminas para papel-toalha seco e, em seguida, adicione 50 microlitros de água sobre cada suporte de inanição. Utilize uma lamínula para remover o excesso de água, absorvendo-o com papel-toalha fresco. Em seguida, para cada lâmina, utilize uma objetiva de 20 x para obter uma visão geral do crescimento do micélio.

Para avaliar a localização da GFP no Hy-Fi. Abra as imagens com a objetiva de 63 x ou 100 x. Por fim, coloque as lâminas de volta na câmara úmida após cada visualização até o próximo tempo experimental.

Nestas imagens, a linhagem G-F-P-S-K-L-P Creo Genum foi utilizada para avaliar a degradação de peroxissomos após 20 horas de incubação. A GFP não foi observada nos vacúolos, nem esses organelos estavam aumentados. No entanto, após 40 horas de crescimento, vacúolos marcados com GFP puderam ser visualizados em alguns hifas, indicando a ativação da autofagia, com maior evidência de fluorescência da GFP e vacúolos aumentados observada após 60 horas.

Neste experimento, um mutante delta 80 G um de p caressa Genum foi utilizado como controle negativo. Observe a ausência de aumento da vacúolo e de GFP, mesmo após 60 horas de crescimento. Como controle positivo, utilizou-se a droga estimuladora de autofagia rapamicina, conforme observado com a linhagem G-F-P-S-K-L não tratada. Vacúolos marcados com GFP tornaram-se visíveis após 40 horas de crescimento, com o Hy-Fi ficando completamente preenchido por grandes vacúolos contendo GFP após 60 horas.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar a autofagia em fungos mentis.