Name: Instrumentação de Perto prazo Sheep Fetal para multivariadas crônicas não-anestesiados Recordings (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Aprenda a instrumentação de fetos de ovelha não anestesiados para monitoramento fisiológico crônico multivariado. Este modelo permite acesso vascular e registro bioelétrico in vivo.

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autores agradecem o apoio financeiro da Molly Towell Perinatal Research Foundation, Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e Fonds de Recherche du Québec – Santé (FRQS) (para MGF) e CIHR-Quebec Training Network in Perinatal Research (QTNPR) (para LDD).
Os autores agradecem a Esther Simard, Marco Bosa, Carl Bernard e Carmen Movila pela assistência técnica.

Cuidados com os animais seguiu as diretrizes do Canadian Council on Animal Care e da aprovação pelo Conselho de Montréal Université on Animal Care (protocolo nº 10 Rech-1560). Informações pormenorizadas sobre materiais e os métodos utilizados são fornecidas na Tabela 1. 1. Anestesia <ol><li> Inserir um cateter de lúmen único numa veia jugular. </li><li> Sedar o ovelha utilizando acepromazina (Atravet 10 mg / mL) por via intravenosa de 2 mg cerca de 30 minutos antes da indução da anestesia, a fim de reduzir o stress associado com o procedimento que por sua vez reduz os níveis de cortisol. </li><li> Administrar o diazepam (diazepam 5 mg / mL) 20 mg, cetamina (Ketalar 100 mg / mL), 4-5 mg / kg e de propofol (10 mg de propofol / mL) 0,5 a 1 mg / kg por via intravenosa para induzir a anestesia geral. </li><li> Inserir um cateter para a permuta das vias aéreas na traqueia usando um laringoscópio com uma lâmina tipo de Wisconsin (extra-longa 350 mm canhoto Blade) para ajudar com a intubação. Deslize o tubo endotraqueal de silício (diâmetro de 9 a 12 milímetros Inner) fora do cateter de permuta das vias aéreas e na traquéia. Esta técnica facilita o processo de intubação. Inflar o manguito do tubo endotraqueal com cuidado para evitar a ulceração induzida pela pressão da traqueia e fixar o tubo na cabeça da ovelha. </li><li> Conecte o tubo endotraqueal para o circuito respiratório do aparelho de anestesia e começar a ventilação mecânica imediatamente. Ajuste as configurações do ventilador para manter um P a CO 2 dentro dos limites normais de 35 a 45 mmHg. </li><li> Inserir um cateter na artéria auricular (22 a 20 g; 1 em [0,9 x 25 mm] de 1,16 em [1,1 x 30 mm]) e ligar a tubagem não conforme a monitorar a pressão sanguínea arterial directa. </li><li> Use um monitor multi-parâmetro fisiológico para gravar o eletrocardiograma, pressão arterial direta sangue, saturação de oxigênio (SpO2), capnografia (P ET CO 2) e temperatura a cada 5 minutos. Transferir todos physiologic dados através de um cabo serial para um computador de coleta de dados fisiológicos central. Manter a temperatura corporal normal, usando um cobertor de água circulante. </li><li> Administrar uma solução de poli-iónico equilibrada em 10 mL / kg para a primeira hora de anestesia geral e, em seguida, reduzir até 5 ml / kg / h. </li><li> Administrar trimetoprim-sulfadoxina 5 mg / kg IV da ovelha imediatamente antes da incisão da pele como profilaxia antibiótica. </li><li> Use técnicas assépticas standard, com todas as manipulações cirúrgicas do ewe e do feto. </li><li> Barreira enfermeira das ovelhas em todos os momentos. Isso inclui também o pessoal não-cirúrgicos. Isso irá minimizar o potencial enzoótica para, por exemplo, Coxiella burnetii. Use luvas e máscaras N-95 (tipo) em todos os momentos. </li></ol> 2. Visão geral do procedimento cirúrgico <ol><li> Faça uma incisão na linha média 20 centímetros através da parede abdominal inferior imediatamente cranial ao úbere através da linha alba para minimizar o dano muscular abdominal. <ol><li> Retract omento maior cranial e os cornos uterinos são apalpadas manualmente. Palpe cada trompa do corpo do útero para a ponta do corno de notar o número de feto e a sua dimensão. Se houver mais do que um feto, escolher o feto maior avaliando manualmente o tamanho da cabeça e a largura entre as órbitas. </li><li> Segure a cabeça do feto escolhido firmemente através do útero parcialmente exteriorizado. Executar um 10 centímetros hysterotomy na grande curvatura com uma tesoura Metzenbaum. Colocar imediatamente sobre a cabeça uma luva cirúrgica de látex não-estéril cheio com uma solução salina esterilizada, como se fosse uma mão. Como alternativa, use 4x4 umedecido para manter a cabeça fetal úmido. Prenda o útero para a parede abdominal. <ol><li> Exteriorizar a direita e esquerda membros torácicos e puxe delicadamente o feto fora do útero até o processo xifóide. </li></ol></li><li> Insira cateteres de polivinilo na veia direita e braquial esquerda e artérias utilizando uma técnica de corte-down padrão. Insira another polivinil cateter na cavidade amniótica fixando sua extremidade para o esterno do feto. <ol><li> Utilize apenas cateteres estéreis. Recomendamos a esterilização de gás em sua instalação padrão. Prenda cada cateter para uma agulha e a agulha de uma torneira de passagem dupla para permitir a coleta de sangue mais tarde ou monitoramento de pressão. </li></ol></li><li> Suturar eletrodos de aço inoxidável para o manúbrio, apêndice xifóide e para cada ponto do ombro para monitorar o eletrocardiograma (ECG). </li><li> Retorne o feto no útero. Todos os cateteres e eletrodos de saída através de uma pequena incisão no flanco esquerdo. </li><li> Feche a incisão laparotomia usando um encerramento de três camadas. Sutura da parede abdominal com uma sutura absorvível monofilamentos sintéticos USP 2 de forma contínua simples. Feche o espaço subcutâneo com uma sintética trançada fio absorvível USP 0 de forma contínua simples. Use grampos aço inoxidável cirúrgico para fechar a incisão na pele. </li></ol></li><li&gt; Descrição detalhada do procedimento cirúrgico <ol><li> Remover lã raspando o processo xifóide até a glândula mamária e ao longo da dobra do flanco de cada lado com uma lâmina # 40. Limpe o abdômen ventral depois completamente, com um gluconato de clorexidina 4% e uma escova macia para 3 min. <ol><li> Execute um matagal estéril padrão com gluconato de clorexidina 4% a partir do centro do abdômen e progredir de forma centrífuga para 3 min. Pour salina esterilizada sobre o abdómen para remover o sabão desinfectante. Para o passo final da preparação cirúrgica, executar três passagens alternadas de solução de gluconato de clorexidina a 2% e álcool isopropílico a 70%. </li></ol></li><li> Garantir a profundidade da anestesia é adequada antes da incisão. Faça uma incisão de laparotomia padrão a partir do umbigo para apenas craniano para o úbere através da linha alba para minimizar o dano muscular abdominal. </li><li> Insira uma longa pinça de esponja no abdome ao longo da parede esquerda para cima abdominalpara o local de saída prevista para cateteres na região paracostal. <ol><li> Empurre as pontas das pinças contra a parede até que um assistente pode localizá-lo e confirmar o local apropriado. Abra ligeiramente (1 cm) das garras da pinça e deixar o assistente de fazer um 2 cm incisão de espessura total. </li><li> Exteriorize as pontas das pinças através da incisão, abrir de novo, suavemente e agarrar os cateteres com os fórceps que finalmente é puxado para fora do abdómen através da incisão abdominal ventral. De nota, alguns grupos implantar os cateteres e, em seguida, exteriorizar-los. Isto tem a desvantagem de que a monitorização do ECG fetal intracirúrgico não é possível. </li></ol></li><li> Palpar o útero para determinar a posição fetal e números. Determine o maior feto usando a distância inter-aural. Inciso parede uterina na grande curvatura ao longo do dorso da cabeça, evitando-se os cotilédones. <ol><li> Inserir uma cânula de extremidades cegas através das membranas da placenta para obter um amamostra de fluido niotic livre de hemorragia. Inciso as membranas da placenta, utilizando uma tesoura. </li></ol></li><li> Exteriorizar a metade craniana do feto através dessa incisão. Coloque uma luva cirúrgica de látex não estéril cheio com solução salina estéril a 37 ° C ao longo da cabeça do feto para ajudar a manutenção da temperatura. <ol><li> Durante a remoção da parte superior do corpo do feto a partir do útero, têm o assistente realizar-se da Babcock para evitar a perda de líquido amniótico. Em seguida, novamente usando uma pinça Babcock, fixar as membranas fetais e a parede uterina para a pele para evitar a contaminação abdominal com líquido amniótico. </li><li> Expor apenas as partes do corpo fetal que precisam ser instrumentada e manter as partes restantes dentro do útero ou coberto por panos esterilizados húmidos e quentes (37 ° C), respectivamente. </li></ol></li><li> Abduzir ambos os membros torácicos para facilitar a exposição à artéria e veia braquial bilateralmente. Inciso ao longo do aspecto medial de ambos antebraço e cuidadosdissecar completamente em torno da artéria braquial e veia. </li><li> Insira cateteres de polivinilo na direita e artéria braquial esquerda ea veia braquial esquerda utilizando uma técnica de corte-down padrão. <ol><li> Livre o navio a ser cateterizada a partir de tecido adjacente mais de 1 cm. Ligadura da porção distal do vaso com uma sutura absorvível sintético trançado USP 2-0. Preplace uma ligadura no aspecto proximal da embarcação, mas mantê-lo desatado. <ol><li> Com uma tesoura de Castroviejo, cortar transversalmente o recipiente a aproximadamente 30% do seu diâmetro. Pare o fluxo sanguíneo parcialmente, puxando o fio de sutura proximal. Inserção do cateter numa direcção proximal. </li></ol></li><li> Insira o cateter de polivinil até 8 cm proximal ou até resistência é detectada e, em seguida, puxe ligeiramente para trás. Temporalmente fixar o aspecto proximal do cateter utilizando uma pinça vascular. Coloque um outro fio de sutura em torno de ambas as extremidades proximal e distal do cateter. Um assistente é continuamente aspirating e lavagem do cateter para assegurar a desobstrução do catéter. </li><li> Feche a pele fetal usando um USP 2-0 trançado fio absorvível sintético, com um padrão de sutura contínua. </li></ol></li><li> Para a direita e ombro esquerdo, manubrium e apêndice xifóide, fixar um eléctrodo de aço inoxidável isolado para facilitar o acompanhamento do ECG fetal. </li><li> Suturar a pressão amniótico e cateter de amostragem para o esterno. Este cateter é fenestrado na sua extremidade. </li><li> Proteger todos os cateteres no dorso do feto utilizando um material de sutura absorvível trançado sintético USP 2-0. </li><li> Antes da substituição do feto de volta para o útero, administrar clenbuterol 30 ug IV lentamente durante 15 minutos para evitar a hipotensão e para proporcionar relaxamento uterino. </li><li> Suturar as membranas fetais utilizando USP 4-0 material de sutura absorvível sintético trançado com um padrão contínuo. Incorpore apenas um cateter ou eletrodo de cada vez para os closure para garantir um fecho estanque. Use um padrão de camada dupla Cushing respeitando princípios Halsted para fechar a camada muscular do útero usando um USP 0 trançado material de sutura absorvível sintético. Enterrar os nós cirúrgicos cuidadosamente. </li><li> Usando um padrão de sutura em bolsa, proteger todos os cateteres e cabos de ECG como eles saem da incisão paracostal esquerda. </li><li> Usando um monofilamentos sintéticos materiais USP 2 sutura absorvível garantir a linha alba com um padrão contínuo. Feche os tecidos subcutâneos usando USP 2-0 trançado material de sutura absorvível sintético com um padrão contínuo. Fixe a camada de pele com grampos cirúrgicos. </li><li> Administrar 250 mg de ampicilina por via intravenosa, e mais uma vez através do cateter para dentro da cavidade amniótica amniótico. Repor os líquidos perdidos com soro fisiológico amniótico quente. </li><li> Coloque todos os cateteres exteriorizados e eletrodos de ECG em um saco de lugar para manter a esterilidade. Coloque uma meia ao redor do tronco da ovelha para garantir toda a uma cateteresd eléctrodos ao corpo de ovelha. </li><li> Pare de anestesia geral, e extubação a ovelha uma vez reflexos de laringe ter retornado ao normal. </li><li> Retorne a ovelha para uma gaiola metabólica, uma vez que ela é estável após anestesia geral. A ovelha residirá na gaiola metabólica para a duração da experiência. A ovelha deve ser capaz de ficar de pé, deitar-se e comer ad libitum enquanto monitora o feto não-anestesiados sem sedativo a mãe. </li><li> Para os três dias seguintes, administrar antibióticos prof ilacticamente para a ovelha (Trimetoprim sulfadoxina 5 mg / kg) e o feto (250 mg de ampicilina por via intravenosa, e mais uma vez através do cateter amniótico). </li><li> Avaliar o estado metabólico de ambos ovelha e feto utilizando análises de sangue de gás. </li><li> Lave todos os cateteres com o volume mínimo de solução salina heparinizada possível. Cuidado - não exceder a dose diária de heparina e fluidos admissível para o feto. É possível ao fluido sobrecarregar o feto. Lave lentamente uma vezum dia ~ 5 mL de NaCl por linha após profilaxia antibiótica. </li></ol></li><li> Gravação e análise de dados <ol><li> Durante a cirurgia, opcionalmente, gravar os ECG e coração taxas maternas e fetais, assim como a pressão arterial materna e pressão nas vias aéreas (Paw) continuamente (Figura 1). Use a janela do monitor de vida para adquirir todos os dados maternos, exceto ECG. Alimentar estes dados em conversor analógico-digital, juntamente com sinais de ECG fetais e maternos; passar ECG materno e fetal pela primeira vez em 1901 pré-amplificador. Gravar e exibir todos os dados no software do fabricante. </li><li> Tome um mL da amostra arterial 1 simultaneamente a partir da ovelha e do feto para gasometria arterial, lactato, glicose e do excesso de bases determinação (no plasma) no início da cirurgia fetal (imediatamente após a inserção do primeiro cateter arterial), após o encerramento do útero . </li><li> Durante a recuperação pós-operatória, dê uma amostra de 3 ml de sangue fetal para medir a IL-6 e TNF-α inflammperfis Atory. Centrifugar o plasma a 4 ° C (4 min, 4000 xg), decanta-se o plasma e armazena-se a -80 ° C para subsequente ensaio ELISA. Nota: Para a finalidade de os resultados representativos relatados, seis dias após a cirurgia, os animais foram sacrificados com uma injecção intravenosa de pentobarbital de sódio a 20 mL. Crescimento fetal foi avaliada por corpo, do cérebro, fígado e pesos maternos. A duração do período experimental irá obviamente variar, dependendo do desenho escolhido para a questão de pesquisa particular e pode atingir ~ 6 semanas. </li></ol></li><li> Análises de citocinas (etapa opcional) <ol><li> Determinar as concentrações de citocinas (IL-6, TNF-a) no plasma utilizando um sanduíche específicas de ovinos ELISA. Anticorpos anti-ovelha monoclonais Pré-revestimento de ratinho (anticorpo de captura da IL-6) ou um rato anticorpo monoclonal anti-bovino (TNF-α) a uma concentração de 4 ug / ml em placas de ELISA a 4 ° C para S / N, depois 3 vezes lava-se com tampão de lavagem (0,05% de Tween 20 em PBS, PBST). </li><li>Bloquear as placas durante 1 h com 1% de BSA em PBST. Lavam-se as placas com tampão de lavagem 3 vezes. </li><li> Use proteínas recombinantes ovinos (IL-6, TNF-a) como padrão de ELISA, preparar uma série de diluições de padrão 1 variar de 2,000 ng / ml a 7 padrão de 31,25 pg / ml. </li><li> Carga de 50 ul de padrões de proteína diluídas em série e as amostras por poço e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente, lavar as placas 3 vezes. Execute todos os padrões e amostras em duplicata. </li><li> Aplicar 50? L de anticorpos policlonais anti-ovelha de coelho (anticorpo de detecção de IL-6) ou anticorpo policlonal de coelho anti-bovino (TNF-a), a uma diluição de 1: 250 em poços e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Lavam-se as placas com tampão de lavagem 5 vezes. </li><li> Adicionar 50 ul de cabra anti-IgG de coelho-HRP conjugado (diluição 1: 5000) durante 30 min. </li><li> Incubar com 50 ul de solução de substrato TMB por poço. </li><li> Parar a reacção de desenvolvimento de cor no momento desejado, com 25 ul de ácido sulfúrico 2N. </li><li> Leia o plates de ELISA leitor de placas a 450 nm, com uma correção de comprimento de onda de 570 nm. Nota: Nos nossos ensaios, a sensibilidade de IL-6 ELISA foi de 16 pg / ml, a sensibilidade de ELISA foi de 13,9 pg / ml, respectivamente TNF-a. Para todos os ensaios, os intra-ensaio e inter-ensaio coeficientes de variância foi &lt;5% e &lt;10%, respectivamente. </li></ol></li><li> analises estatística Nota: Os métodos estatísticos exatos dependerá da questão de pesquisa. Aqui relatamos os métodos utilizados para testar quaisquer diferenças significativas nos gases sanguíneos relatados na Tabela 2. <ol><li> Teste distribuição normal dos dados através do teste de Kolmogorov-Smirnov seguido por testes paramétricos ou não paramétricos com ajuste para múltiplas comparações, conforme o caso. </li><li> Use K-significa análise de cluster para identificar os fetos na coorte que foram espontaneamente hipóxica e determinar as respectivas pO 2 e O 2 valores Sat (considere PO 2 &lt;20 mmHg ou O 2 Sat &lt;55% como fetal hipoxia). 44-48 </li><li> Use o software estatístico SPSS, como para as análises. </li><li> Apresentam dados como média ± SD com diferença estatística em p &lt;0,05 considerado significativo. </li></ol></li></ol>

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O anestésico e procedimentos cirúrgicos que são apresentados são necessários para o estabelecimento de um modelo animal para o estudo da fisiologia e patofisiologia fetal: as ovelhas não anestesiados fetal cronicamente instrumentadas. Quatro passos críticos no âmbito do protocolo deve ser enfatizada. Em primeiro lugar, passando os cateteres e eletrodos através do flanco materno: é importante que isso seja feito de uma só vez para evitar quaisquer lesões em órgãos internos. Em segundo lugar, ...

Uma variedade de modelos animais existem para o estudo de ambas as gravidezes normais e comprometidos, incluindo roedores de laboratório, primatas não humanos e animais domésticos. 1,2,3,4,5 As ovelhas cronicamente instrumentadas grávida tem sido amplamente utilizado há 50 anos como um modelo de desenvolvimento fetal humano e respostas a estímulos fisiopatológicos como lipopolissacarídeo (LPS). 6-10 As lesões após exposição LPS imitar exatamente o que é visto em prematuros com leucomalácia periventricular, que é devido a um perfil de maturação similar de ambas as espécies. 11, 12 Outras complicações na gravidez também têm sido estudadas em grande detalhe, como a descoberta de que os glicocorticóides pré-natais promover o desenvolvimento pulmonar 13-15 e compreender o impacto da restrição de crescimento intra-uterino (CIUR) sobre o feto 16,17. O uso extensivo do modelo de ovelha fetal é devido ao unique receptividade da ovelha fetal não-anestesiado para a colocação cirúrgica e manutenção de cateteres e eletrodos, permitindo a amostragem de sangue repetitivo, registro da atividade bioelétrica, aplicação de estimulação elétrica e em imagens do cérebro vivo. 18 Telemetry também é possível, embora utilizado com menos freqüência Ainda, devido à maior sofisticação para configurar, bem como o custo inicial e de manutenção. 19 Além disso, o modelo de fetos de ovelhas é muito versátil como muitas variações de instrumentação são possíveis, dependendo das medidas de interesse. Por exemplo, é possível gravar mais de dias a semanas sinais multivariados em tempo real, tais como movimentos fetais de respiração, a atividade elétrica do cérebro, as respostas cardiovasculares, eletrocardiograma, o fluxo sanguíneo regional para uma gama de órgãos usando sondas de fluxo ou microesferas, etc. Graças a Esta versatilidade, uma ampla gama de estudos têm sido realizados, incluindo o desenvolvimento da cardisistema ovascular 20,21, hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) 22, o desenvolvimento do cérebro e desenvolvimento 23 estados do sono, em particular, 24, os efeitos da hipoxia / asfixia 25, a hipotermia terapêutica 26, inflamação 11/06, combinação de ambos, 27 de glicocorticóides 28,29, anti-depressivos 30, displasia bronco-pulmonar (BPD) 31,32, 33,34,35,36,37,38,39 programação fetal ou desenvolvimento de novas modalidades de monitorização fetal antes e durante o parto, para citar apenas algumas áreas de investigação 40,41,42,43. O objetivo geral do método apresentado é mostrar implementação básica deste modelo versátil. Ele permite estabelecer uma ampla variedade de protocolos experimentais agudas e crónicas estudo da fisiologia e patofisiologia fetal no integrativa, órgão, níveis celular e molecular.

<table><tbody><tr><td>ACE Fonte de luz</td><td>Schott-Fostec</td><td>A20500</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060 - 11</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação angular</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006 - 09</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de bisturi</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003 - 12</td><td>ferramenta de dissecação alternada</td></tr><tr><td>Lâminas de bisturi curvas #12</td><td>Fine Science Tools</td><td>10012 - 00</td> ferramentas <td>de dissecação alternadas</td></tr> da <tr>ciência <td>fina das</td><td>tesouras</td> da ferramenta da ferramenta <td>16044 - 10</td><td></td></tr><tr><td>S & Pinça de sutura em T</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>00272 - 13</td><td></td></tr><tr><td>Pinças Dumont SS - angulares</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>11203 - 25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de seda trançada tamanho 6-0</td><td>Teleflex Medical</td><td>07 - 30&nbsp; - 10</td><td></td></tr><tr><td>Fita Médica</td><td>transpore</td><td>3M</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Cetamina 100 mg/ml</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409 - 2051 - 05</td><td>Final Does é 80 mg/kg</td></tr><tr><td>Tranqui Ved Injection (xilazina 100 mg/ml)</td><td>Vecdo</td><td>NDC 50989 - 234 - 11</td><td>Final Does é 10 mg/kg</td></tr><tr><td>Reactive orange 14</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>R - 8254</td><td></td></tr><tr><td>Ringers Solution Components</td><td></td><td></td><td>A solução é equilibrada com gás com 95% de O2 e 5% de CO2, pH final 7.4</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S7653</td><td>Concentração Final: 118 mM</td></tr><tr><td>de cloreto de potássio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217 - 3</td><td>Concentração Final: 4.7 mM</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79 - 500</td><td>Concentração Final: 2,5 mM</td></tr><tr><td>de fosfato de potássio monobásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>P -285</td><td>Concentração Final: 1,2 mM</td></tr><tr><td>de sulfato de magnésio</td><td>J.T. Baker</td><td>Jan-00</td><td>Concentração Final: 0,57 mM</td></tr> 4<tr><td>-(2-Hidroxietil)piperazina-1-ácido etanossulfônico (HEPES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 310 - 500</td><td>Concentração Final: 5,95 g/L</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>G8270</td><td>Concentração Final: 5,5 mM</td></tr><tr><td>LifeWindow</td><td>Digicare Biomedical Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CED bioamplificador e unidades ADC</td><td>Cambridge Electronic Design Limited, Unidade 4, Science Park, Milton Road, Cambridge CB4 0FE INGLATERRA.</td><td>Bioamp: 1902; ADC: micro1401; Software de aquisição de dados: Spike 2, V7.13</td><td></td></tr><tr><td>Neurolog analog signal bioamplifier</td><td>Digitimer Ltd 37 Hydeway Welwyn Garden City Hertfordshire, AL7 3BE, Inglaterra</td><td>NL108A</td><td></td></tr><tr><td>ABL800Flex</td><td>Radiometer Canada; 200 Aberdeen Dr, London, ON N5V 4N2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5804R</td><td>Eppendorf Canada; 2810 Argentia Road, #2 Mississauga, Ontario, L5N 8L2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de cateterismo jugular Arrow</td><td>International, Inc., 2400 Bernville Road, Reading, PA 19605 USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atravet</td><td></td><td></td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Diazepam</td><td></td><td></td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Ketalar</td><td></td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Propofol</td><td></td><td></td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>SurgiVeT</td><td>Tubos Endotraqueais; Smiths Medical ASD, Inc. St. Paul, MN 55112, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cateter de troca de vias aéreas Cook com adaptadores RAPI-FIT</td><td>Cook Critical Care 750, Bloomington IN 47402-0489 EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ventilador Dispomed</td><td>Dispomed Ltd., 745 Nazaire-Laurin, Joliette, Quebec J6E 0L6</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte-W</td><td>Becton Dickinson, Infusion Therapy Systems Inc., 9450 S State St, Sandy Utah 84070 EUA</td><td></td><td>22 a 20 g; 1 pol [0,9 x 25 mm] a 1,16 pol [1,1 x 30 mm]</td></tr> <tr><td>Edwards Lifesciences Ref: PX272 Kit de monitoramento de pressão com pressão</td><td></td><td></td><td></td>descartável TruWave</tr><tr><td>LifeWindow LW6000</td><td>Digicare Biomedical Technology 107 Commerce Road, Boynton Beach, FL 33426-9365 EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gaymar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Babcock</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cateteres</td> <td>de polivinilSCI (Scientific Commodities Inc.)</td><td></td><td>2 metros</td></tr><tr><td>2-0 Vicryl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo tesoura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>eletrocardiograma (ECG)</td><td>LIFYY, Metrofunk Kabel-Union, Berlim, Alemanha</td><td></td><td>quatro eletrodos de cobre em bainha única, 2 metros</td></tr><tr><td>2-O Vicryl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-0 Vicryl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDS II USP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trimetoprim sulfadoxina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Torneira</td><td>Argônio Médica, Cat&nbsp; 041220001A</td><td></td><td>Torneira dupla de 4 vias com agulhas de trava luer macho</td></tr><tr><td>Agulhas</td><td>Tyco Healthcare 8881202389</td><td></td><td>Monoject de cubo de alumínio sem corte, 22Gx, 0,7 mm x 38,1 mm: para cateteres arteriais e venosos fetais</td></tr><tr><td>Agulhas</td><td>Tyco Healthcare 8881202322</td><td></td><td>Monoject de cubo de alumínio sem corte, 16Gx, 1,6 mm x 38,1 mm: para cateteres amnióticos</td></tr></tbody></table>

instrumentação de perto prazo sheep fetal para multivariadas crônicas não-anestesiados recordings

Instrumentation of Near-term Fetal Sheep for Multivariate Chronic Non-anesthetized Recordings

A ovelha prenhe cronicamente instrumentada tem sido usada como modelo de desenvolvimento fetal humano e respostas a estímulos fisiopatológicos, como endotoxinas, bactérias, oclusões do cordão umbilical, hipóxia e vários tratamentos farmacológicos. As práticas clínicas que salvam vidas do tratamento com glicocorticóides em fetos com risco de parto prematuro e a hipotermia terapêutica foram desenvolvidas neste modelo. Isso se deve à facilidade única do feto ovino não anestesiado à colocação cirúrgica e manutenção de cateteres e eletrodos, permitindo amostragem repetitiva de sangue, injeção de substâncias, registro de atividade bioelétrica, aplicação de estimulação elétrica e imagem de órgãos in vivo. Aqui descrevemos o procedimento de instrumentação cirúrgica necessário para obter um modelo fetal estável de ovelhas não anestesiadas cronicamente instrumentadas, incluindo a caracterização da recuperação pós-operatória dos pontos de vista gasométrico, metabólico e inflamatório.

38 ovelhas datado de tempo grávidas foram instrumentados em 128 ± 2 dias de gestação (DGA, ~ 0,88 gestação, termo 145 DGA) com arterial, venosa e cateteres amniótico e eletrocardiograma (ECG) eletrodos com técnica estéril sob anestesia geral (tanto ovelha e feto ). Em caso de gravidez duplo o feto maior foi escolhido com base na palpação e estimar o diâmetro inter-temporal; alternativamente, o feto deve ser instrumentado podem ser selecionados aleatoriamente para evitar qualquer viés potencial ou ambos os fetos podem se...

O modelo de fetos de ovelhas não-anestesiado cronicamente instrumentados é usado para estudar o desenvolvimento fetal humano na saúde e na doença, pois permite a colocação cirúrgica e manutenção de cateteres e eletrodos, coleta de sangue repetitivo, injeção de substância, a gravação da atividade bioelétrica, e in vivo de imagens. Nós descrevemos os procedimentos necessários para estabelecer este modelo.

Instrumentação de Perto prazo Sheep Fetal para multivariadas crônicas não-anestesiados Recordings

The chronically instrumented pregnant sheep has been used as a model of human fetal development and responses to pathophysiologic stimuli such as ...

O objetivo geral deste procedimento é descrever a instrumentação do feto ovino para monitoramento fisiológico de longo prazo em resposta a qualquer perturbação fisiológica; este modelo de pesquisa permite acesso vascular e monitoramento eletrocardiográfico e de outros sinais bioelétricos do feto não anestesiado in utero. Isso nos fornece uma compreensão das alterações que ocorrem durante uma perturbação fisiológica, como oclusão vascular ou injeção de um mediador pró-inflamatório. Este modelo é clinicamente relevante para o entendimento do desenvolvimento fetal em estados saudáveis e patológicos.Todos os procedimentos com animais descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de Ética para o uso de animais da Universidade de Montreal e seguiram as diretrizes estabelecidas pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais. Este é um experimento não sobrevivencial. O protocolo anestésico descrito aqui tem efeitos mínimos sobre a resposta inflamatória.A adição de uma pequena dose de propofol reduz os reflexos laríngeos, facilitando assim a intubação. Um monitor fisiológico multiparamétrico é utilizado durante todo o período anestésico. Todos os parâmetros fisiológicos maternos medidos podem ser vistos aqui.O eletrocardiograma, a pressão arterial direta, a pressão das vias aéreas, a oximetria de pulso, a capnografia, o nível expirado de anestésico, a temperatura, bem como a análise de gases sanguíneos arteriais são conectados ao monitor materno por meio de um dispositivo eletrônico de aquisição de dados da Cambridge Electronic Design. O uso de um cabo de interface personalizado permite a exibição sincronizada dos dados fisiológicos maternos e fetais. O abdômen da U é preparado utilizando técnicas assépticas padronizadas.O U é inclinado ligeiramente para a direita para permitir a saída dos cateteres vasculares inseridos e do cabo de ECG antes e durante a cirurgia. A profundidade da anestesia é avaliada por meio de diversos reflexos neurológicos, como posição dos olhos, reflexo palpebral, tônus da mandíbula e a resposta à estimulação cirúrgica. Uma incisão mediana é realizada com uma lâmina de bisturi.As técnicas de hemostasia utilizadas neste estudo foram a ligadura dos vasos ou a compressão simples. A veia abdominal subcutânea mediana é ligada. A gordura subcutânea é dissecada com precisão até que o ligamento arqueado seja claramente identificado.O corte linear é cuidadosamente feito ao nível do umbigo. Em seguida, um dedo é inserido por meio dessa pequena incisão para garantir que não haja aderências ou estruturas vitais imediatamente abaixo do corte. O cabo da pinça Nason Brown pode ser usado para proteger a borda cortante da lâmina do bisturi durante a incisão, protegendo assim as estruturas anatômicas subjacentes.Inicialmente, o útero é palpado para identificar os dois cornos uterinos e contar o número de fetos presentes. Trigêmeos são possíveis, e a probabilidade de concluir com sucesso o tratamento é menor. Portanto, não recomendamos o uso de trigêmeos.O feto maior é selecionado utilizando a distância interoral retornada ao abdômen para permitir a inserção dos cateteres vasculares e das pinças hemostáticas com esponja para o cabo de ECG, que são inseridas no lado esquerdo da cavidade abdominal ao longo da parede abdominal, onde são empurradas contra o flanco esquerdo. Uma pequena incisão é feita sobre essas pinças. Os cateteres vasculares e o cabo de ECG são então passados por esta incisão e para fora da incisão abdominal.É importante verificar se você possui todos os cateteres vasculares e o cabo de ECG antes de iniciar o restante da cirurgia. A cabeça do feto é exteriorizada e identifica-se uma área do útero livre de cotilédone. O ponto de captação é identificado ao longo da curvatura maior.Uma pequena incisão é feita inicialmente usando uma lâmina de bisturi. Essa incisão pode então ser estendida sobre a cabeça do feto usando tesoura, tomando cuidado para minimizar o risco de lesão e deixando cuidadosamente o âmnio intacto. O líquido amniótico é coletado usando um cateter de ponta romba antes que o âmnio seja aberto, a fim de minimizar a contaminação com sangue.Esta amostra pode ser utilizada para detectar a presença de alterações inflamatórias. A cabeça é removida das membranas fetais e imediatamente colocada dentro de uma luva cirúrgica. A luva é preenchida com água morna para ajudar a manter a normotermia. Pinças de Babcock são colocadas sobre as membranas fetais, útero e pele para ajudar a reduzir a perda de líquido amniótico e danos ao tônus placentário decorrentes da manipulação cirúrgica.O campo cirúrgico é isolado utilizando campos estéreis. O primeiro passo da instrumentação fetal é a inserção de um cateter arterial. Uma incisão é feita ao longo da face medial do úmero.No ponto médio do úmero, a artéria braquial é dissecada rombamente de dentro, entre os ventres musculares. Um laço de material de sutura absorvível é então passado por baixo da artéria. O laço é então cortado e as duas partes do material de sutura são puxadas para cada extremidade da artéria.A extremidade distal da artéria é ligada. É feito um laço ao redor da extremidade proximal, que é usado para exercer tração sobre a artéria, facilitando a realização de uma pequena incisão na artéria com tesoura RS. Um cateter microcirúrgico de vinil é inserido na artéria utilizando pinça.Uma alternativa ao uso de pin&ccedil;as &eacute; o dilatador de vaso. A ponta do dilatador de vaso pode ser inserida na incis&atilde;o para auxiliar na coloca&ccedil;&atilde;o do cateter. Marcadores graduados no cateter ajudar&atilde;o a garantir que um comprimento adequado do cateter seja inserido.Uma pinça vascular é colocada no cateter entre a ligadura proximal e o local de inserção para evitar vazamento de sangue. A ligadura proximal é então firmemente amarrada ao redor do vaso e do cateter. Agora a pinça vascular pode ser removida.Uma segunda ligadura é colocada ao redor da porção proximal. As extremidades livres da ligadura distal são fixadas ao redor do cateter. Durante todo esse processo, um assistente aspira e irriga continuamente o cateter para garantir sua patência e para verificar se as ligaduras não estão muito apertadas ao redor do cateter.É importante minimizar o volume de soro fisiológico injetado para evitar sobrecarga hídrica no feto. Uma análise gasométrica do sangue fetal pode agora ser realizada para avaliar o estado de saúde do feto. Um cateter venoso pode ser posicionado utilizando exatamente a mesma técnica.A veia cefálica pode ser localizada na região proximal do corte. A veia é estabilizada utilizando duas ligaduras ao redor da veia. A ligadura proximal não é amarrada até que o cateter seja inserido na veia.Novamente, utilizando nossa tesoura, é feito um pequeno orifício no vaso. O cateter é inserido e fixado tanto proximal quanto distalmente ao ponto de inserção. A localização exata da colocação desses cateteres vasculares dependerá das necessidades do modelo de pesquisa e dos órgãos-alvo em estudo.Os cateteres venoso e arterial saem do mesmo local de incisão. A incisão na pele é então fechada usando um padrão de sutura contínua simples em uma única camada. Os cateteres são fixados ao antebraço em vários pontos para permitir a flexão da perna.Na posição normal, os cateteres são fixados no ombro e depois entre as escápulas. Um segundo cateter arterial é colocado no lado contralateral como reserva, permitindo obter pressão arterial e amostragem sanguínea arterial durante o período pós-operatório. Quatro cabos eletrocardiográficos são fixados utilizando uma agulha de calibre 16, que é passada subcutaneamente.Observe a seção descoberta do fio, que eventualmente é posicionada subcutaneamente, e o fio é inserido através do bisel da agulha. A agulha é removida, deixando o fio subcutaneamente. Dois nós quadrados são utilizados para fixar o fio.Após isso, cola de cianoacrilato também é aplicada em cada um dos nós. Um cabo é colocado em cada articulação do ombro, no manúbrio e no processo xifoide. Um cateter fenestrado é fixado ao esterno para permitir a medição da pressão intrauterina e a coleta repetida de líquido amniótico antes de retornar o feto ao útero.Trinta microgramas de clenbuterol. Um agonista beta dois é administrado lentamente por via intravenosa para proporcionar relaxamento uterino. O clenbuterol também reduz o desconforto abdominal potencial devido à manipulação do útero.As quatro patas são cuidadosamente reposicionadas de volta no útero ou os cateteres vasculares e o cabo de ECG são conduzidos até a face dorsal do pescoço, onde são suturados à pele durante toda a cirurgia. É importante banhar o feto com solução salina morna para evitar a dessecação dos tecidos expostos e manter o feto aquecido. A luva cirúrgica é removida no último momento e a cabeça é reposicionada de volta no útero.O fechamento do útero começa agora. Primeiramente, as pinças Babcock são removidas da incisão uterina. Um padrão de sutura contínua simples é utilizado para fechar as membranas fetais com um fio sintético multifilamentar absorvível de número quatro.Cada um dos cateteres e do cabo de ECG é incorporado à sutura separadamente. Isso permite uma sutura mais firme, prevenindo assim qualquer vazamento. Uma sutura em duas camadas do tecido muscular seroso é realizada utilizando um padrão de sutura em Cushing com material de sutura absorvível sintético multifilamento de tamanho O.Esse padrão de sutura invertida, portanto, ajuda a minimizar a formação de aderências e vazamentos. Novamente, os cateteres e o cabo de ECG são incorporados à sutura separadamente. Uma vez que o útero é fechado, solução salina é infundida no útero por meio do cateter amniótico para substituir o líquido amniótico perdido.Durante a cirurgia. O fechamento uterino é então coberto com o grande epíploo. Um fio de polidioxanona é usado para fechar a incisão linear no cotovelo.Utiliza-se um padrão contínuo simples. É importante garantir que a bainha retal abdominal seja incorporada em cada passada da agulha, conforme observado. Neste caso, o cirurgião optou por fechar a incisão linear do cotovelo em duas etapas.Um padrão contínuo simples também é utilizado para fechar os tecidos subcutâneos. Nesta etapa, o cirurgião assistente fará uma sutura em bolsa de tabaco ao redor dos cateteres vasculares e do cabo de ECG conforme eles saem pelo flanco esquerdo. Grampos cirúrgicos são utilizados para o fechamento da pele, o que acelerará o tempo de fechamento.As feridas cirúrgicas são limpas e é colocada uma bandagem não oclusiva sobre os locais. Uma bandagem de malha elástica é colocada sobre o tronco do U. Dentro de uma hora após a cirurgia, o U está de pé, andando e começando a se alimentar novamente de maneira calma e inquisitiva. Buprenorfina e terapia analgésica são administradas durante esse período ao longo de todo o período cirúrgico.Os parâmetros fisiológicos maternos foram registrados usando um monitor fisiológico multiparamétrico. O ECG materno e a pressão das vias aéreas foram sincronizados com os dados fisiológicos fetais por meio de um cabo personalizado conectado ao monitor da Cambridge Electronic Design. As variabilidades da frequência cardíaca fetal e materna podem ser derivadas desses dados.Um exemplo dos dados fisiológicos capturados é mostrado aqui. Foram coletadas amostras pareadas de gases sanguíneos arteriais maternos e fetais em momentos predeterminados durante os períodos cirúrgico e pós-operatório para garantir seu estado de saúde. Os parâmetros do ventilador, a terapia de fluidos e a taxa de perfusão de dobutamina foram todos ajustados com base nesses resultados para assegurar ventilação e perfusão adequadas tanto da mãe quanto do feto, sendo instituída terapia nasal de oxigênio.Uma vez que o U foi extubado, a terapia de fluidos foi mantida. Caso fosse detectada alguma perturbação ácido-base ou eletrolítica, formulamos a hipótese de que a razão para a acidose metabólica leve transitória observada no feto se devia à redução da perfusão uterina associada ao uso de anestesia leve.Para obter mais informações sobre os resultados, consulte o artigo escrito. Em resumo, este modelo descreve a implantação cirúrgica básica de dois cateteres arteriais, um cateter venoso, a colocação de cabos de ECG e um cateter amniótico. Isso permitirá o monitoramento do eletrocardiograma, a coleta de amostras de sangue arterial e venoso para análise da pressão arterial e o monitoramento da pressão hidrostática intrauterina.Desejamos agradecer às seguintes pessoas pelo valioso auxílio prestado neste projeto de pesquisa intensivo. Gostaríamos também de agradecer aos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde. Lafon realiza pesquisa em Quebec com Santi e com a Fundação Twell de Pesquisa Perinatal pelo apoio financeiro a este projeto.

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Research

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