Novel Microscopia de Força Atômica bioprospecção Based para Isolamento de Morfologia reagentes específicos contra TDP-43 variantes em Esclerose Lateral Amiotrófica

O objetivo geral deste procedimento é isolar reagentes específicos de morfologia contra a proteína de ligação ao DNA do alcatrão. 43 variantes presentes em um LS utilizando uma tecnologia de panning de rádio baseada em FM de duas fases. Isso é feito submetendo primeiro uma biblioteca diversificada de fagos a várias rodadas de panorâmica negativa contra antígenos fora do alvo usando imunotubos.

A panorâmica negativa é realizada sequencialmente contra albumina sérica bovina, alfa-sinucleína agregada e tecido cerebral humano saudável. A segunda etapa é concluir uma verificação de FM após cada conjunto de panorâmica negativa para garantir a remoção bem-sucedida de todos os fagos indesejados. Neste exemplo de panorâmica negativa, o uso de fagos de alfa-sinucleína agregados são visíveis após uma rodada, mas estão ausentes após a 10ª rodada.

Em seguida, as rodadas de panorâmica negativas restantes são realizadas no MICA devido à disponibilidade limitada de amostras. Os fagos reativos ao TDP 43 imunoprecipitado de demência saudável e frontotemporal ou tecido FTD são removidos sequencialmente. A etapa final é isolar os fagos que se ligam ao imunoprecipitado a LS.

TDP 43 usando fagos ligados à mica são aludidos usando tripsina, trietil, amina e células TG um. Em última análise, a especificidade desses clones potenciais a LS é verificada usando fa eliza indireta e dot blots homogeneizados A-L-S-F-T-D e tecidos cerebrais humanos saudáveis são imobilizados em ambos os ensaios. Maior reatividade a um tecido LS é geralmente detectada em comparação com os outros grupos testados.

A principal vantagem desta técnica sobre o bio panning de fagos convencional é o uso de protocolos exaustivos de panning negativo, conforme verificado por um FM, para garantir o isolamento de reagentes que reconhecem seletivamente variantes de proteínas específicas da doença diretamente de amostras biológicas complexas, mesmo quando presentes em baixas concentrações. Embora um FM possa fornecer informações sobre a investigação de características biomoleculares e as interações, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como monitorar o progresso da bioescrita e confirmar a especificidade de CLOs únicos. Comece este procedimento com a produção de fagos conforme detalhado no protocolo de texto para realizar o movimento panorâmico negativo contra BSA primeiro, adicione quatro mililitros de um miligrama por mililitro.

Solução de BSA em solução salina tamponada com fosfato ou PBS para 12 imunotubos e incubar durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, combine partículas de fagos de cada uma das três bibliotecas, reservando uma pequena quantidade dessa mistura de fagos para verificação futura do processo de panorâmica negativa. Em seguida, descarte a solução de BSA do primeiro tubo e lave o tubo duas a três vezes com PBS para remover qualquer BSA não ligado, adicione as bibliotecas de fagos combinadas a este primeiro tubo, incube por 30 minutos em temperatura ambiente no rotador antes de coletar os fagos não ligados.

Lembre-se de que é importante economizar uma pequena quantidade de fago após terminar as inúmeras rodadas de panorâmica negativa em cada alvo para verificar o sucesso do processo de panorâmica e, em caso de contaminação, repita o processo de panorâmica negativa com os tubos restantes da solução de BSA a cada vez. Use o fago não ligado coletado após a incubação do tubo anterior. Em seguida, verifique a remoção de todos os aglutinantes de fagos BSA usando o procedimento A FM detalhado na próxima seção do vídeo.

Para visualizar a ligação do fago usando um FM, adicione 10 a 20 microlitros do antígeno alvo à mica clivada e incube por cinco a 10 minutos. Lave o MICA cinco vezes com água, adicione 10 a 20 microlitros dos fagos ao MICA e incube por cinco a 10 minutos. Lave a mica mais cinco vezes com água e deixe secar ao ar.

Execute um processo de imagem FM usando um modo de derivação FM com um nano escopo três, um controlador no ar à temperatura ambiente. As sondas de silício a FM têm uma frequência de ressonância de 300 kilohertz e uma constante de mola de 40 newtons por metro. Insira a ponta FM no carregador de pontas.

Conecte o carregador de pontas ao microscópio A FM. Coloque a amostra sob o microscópio A FM. Use os botões para alinhar o laser na ponta A FM.

Defina a taxa de varredura para 3,05 hertz e a resolução de varredura para 512 amostras por linha. Ajuste automático da máquina para otimizar a vibração da sílica. Frequência da ponta, inicie a varredura da amostra.

A ponta fará a varredura da superfície do MICA medindo a altura do fago ligado. Os fagos são as longas linhas brancas que seguem o processo de aquisição das imagens por achatamento básico do fundo para garantir que todos os tamanhos de partículas sejam comparáveis em cada imagem. A largura do fago pode variar de imagem para imagem devido a outros tamanhos de partículas e à área de varredura, mas nunca comprometerá a precisão da ligação ou não do fago ao antígeno.

A imagem é achatada em uma imagem 2D e regiões mal imageadas causadas pela contaminação por PEG são destacadas para remoção de futuras análises de dados. Proteína TDP 43 saudável imunoprecipitada do tecido cerebral humano saudável, conforme descrito no protocolo de texto, devido à menor quantidade de proteína imunoprecipitada. Realize essas rodadas de panorâmica negativa usando MICA primeiro Cortar oito superfícies de MICA para o primeiro MICA a aproximadamente 100 microlitros da proteína imunoprecipitada e incubar por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente após a incubação.

Lave o MICA cinco vezes com solução salina tamponada com fosfato a 0,1% com PBST abreviado tween 20. Em seguida, adicione aproximadamente 100 microlitros de fago após a panorâmica negativa contra o tecido cerebral humano saudável e incube por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente. No meio da incubação, adicione a proteína imunoprecipitada à segunda mica.

Colete o fago do primeiro MICA antes de lavá-lo cinco vezes com 0,1% PBST. Depois de lavar a segunda mica, adicione o fago coletado anteriormente. Repita todo o processo até que o fago seja prejudicado contra todas as oito micas com a proteína imunoprecipitada.

Verifique o sucesso do processo de panning usando o fago após a primeira e oito rodadas de panning negativo com um FM para iniciar a proteína TDP 43 imunoprecipitada do cérebro de indivíduos com LS, conforme descrito no protocolo de texto, clivar três superfícies MICA. Em seguida, adicione 50 microlitros de A LS TDP 43 ao primeiro MICA após uma incubação de cinco minutos em temperatura ambiente. Lave o MICA cinco vezes com 0,1% PBST.

Em seguida, adicione 50 microlitros do fago coletado após panorâmica negativa contra TDP 43 saudável ao MICA e incube por cinco minutos. Colete os fagos soltos. É importante manter todos os fagos coletados nessas etapas de panorâmica separados.

Em seguida, colete os fagos ligados usando três métodos elucianos. Primeiro, adicione 50 microlitros de tripsina a cada MICA e incube por no máximo 10 minutos. Colete a solução e salve.

Em seguida, adicione 50 microlitros de trietilamina 100 milimolar a cada MICA e incube por no máximo 10 minutos. Colete a solução em um volume igual de um tampão molar tris HCL pH 7,4 e guarde o terceiro, adicione 50 microlitros de células TG um diretamente ao MICA e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Além disso, adicione os fagos coletados dos dois primeiros métodos elucianos a 100 microlitros de células TG um na mesma concentração e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, repita esse processo com uma segunda mica. Pegue o fago não ligado coletado usando o primeiro MICA com A LST DP 43 e adicione-o ao segundo MICA com A-A-L-S-T-D-P 43 incube por cinco minutos. Combine as células TG um infectadas com os fagos, aludidas com tripsina de cada A LST DP 43 MICA e placa em todas as placas de trado luria burani com ampicilina ou placa LBA.

Repita o mesmo processo para os fagos aludidos a trietilamina e TG um dos dois conjuntos de A LS TDP 43 MICA para um total de três placas. Repita todas as etapas com uma terceira mica A LS, no entanto, neste caso, use o fago coletado após duas rodadas de panorâmica negativa contra a demência frontotemporal. T DP 43 plaquea as células TG infectadas em três placas LBA e incuba durante a noite a 37 graus Celsius.

No dia seguinte. Conte o número de colônias nas seis placas LBA com um potencial clone de LS. Deve haver menos colônias nas três placas LBA da terceira A LS MICA em comparação com as três placas LBA após as duas rodadas de panning positivo utilizando o fago após panning negativo contra TDP 43 saudável produzir fagos e fragmentos de anticorpos de domínio variável de cadeia única solúveis ou s cvs desses clones e analisar usando diferentes imunoensaios para verificar a especificidade para um tecido LS.

Uma imagem FM é usada para monitorar as etapas de panorâmica negativa em relação aos vários alvos para garantir que todos os fagos reativos sejam removidos. Os resultados de FM mostraram ligação de fagos após uma rodada de panning negativo contra a alfa-sinucleína agregada e nenhuma ligação após oito rodadas. A panorâmica negativa contra o tecido cerebral humano saudável foi realizada para remover o fago que liga os muitos antígenos presentes no homogeneizado do cérebro humano saudável.

Aqui é mostrada a ligação do fago ao tecido saudável após uma rodada de panorâmica negativa e nenhum fago deixado de ligação após 10 rodadas de panorâmica negativa. Depois de preparar o fago e o SCFE solúvel a partir de clones potenciais, eles foram testados em Eliza indireta quanto à especificidade para um tecido LS. Quase todos os fagos mostraram preferência por um tecido LS em vez de tecido saudável.

Resultados semelhantes são obtidos ao comparar a ligação do fago a um LS com demência frontotemporal ou tecido FTD. A comparação da ligação do SCFV a um tecido LS em tecido saudável e FTD novamente mostrou ligação seletiva a um tecido LS em quase todos os clones. O imunoensaio dot blot foi usado para verificar ainda mais a ligação a um tecido LS e também para determinar quais clones são reativos em outras aplicações imunológicas.

Aqui, o clone dois, uma ligação a um tecido LS, é mostrado. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como aplicar uma panorâmica de biop baseada em FM para isolar reagentes contra doenças, alvo específico de interesses, reagentes, que podem servir como possíveis ferramentas diagnósticas e/ou terapêuticas.