Novel Microscopia de Força Atômica bioprospecção Based para Isolamento de Morfologia reagentes específicos contra TDP-43 variantes em Esclerose Lateral Amiotrófica

O objetivo geral deste procedimento é isolar reagentes específicos de morfologia contra a proteína de ligação ao DNA de tar. 43 variantes presentes em um LS utilizando uma tecnologia de panning radioativo baseada em AFM de duas fases. Isso é realizado primeiramente submetendo uma biblioteca diversa de fagos a múltiplas rodadas de panning negativo contra antígenos fora do alvo utilizando tubos imunológicos.

A triagem negativa é realizada sequencialmente contra albumina sérica bovina, alfa sinucleína agregada e tecido cerebral humano saudável. O segundo passo é realizar uma verificação de FM após cada conjunto de triagens negativas para garantir a remoção bem-sucedida de todos os fagos indesejados. Neste exemplo de triagem negativa, utilizando fagos de alfa sinucleína agregada, os fagos são visíveis após uma rodada, mas ausentes após a décima rodada.

Em seguida, os rounds restantes de panning negativo são realizados em MICA devido à disponibilidade limitada da amostra. Os fagos reativos à TDP-43 imunoprecipitada de tecido saudável e de demência frontotemporal ou FTD são removidos sequencialmente. O passo final é isolar os fagos que se ligam à imunoprecipitação de a LS.

Os TDP-43 utilizando fagos ligados à mica são eluídos com tripsina, trietilamina e TG uma células. Em última análise, a especificidade desses potenciais clones de A-L-S é verificada por meio de ELISA indireto e dot blots, nos quais tecidos cerebrais humanos homogenizados de A-L-S-F-T-D e de indivíduos saudáveis são imobilizados em ambos os ensaios. Geralmente, detecta-se uma reatividade maior ao tecido de A-L-S comparado aos outros grupos testados.

A principal vantagem desta técnica em relação ao bioenriquecimento convencional com fagos é o uso de protocolos de enriquecimento negativo exaustivo, verificados por um MF, para garantir o isolamento de reagentes que reconhecem seletivamente variantes proteicas específicas de doenças diretamente em amostras biológicas complexas, mesmo quando presentes em baixas concentrações. Embora um MF possa fornecer subsídios para investigar características biomoleculares e interações, ele também pode ser aplicado em outros sistemas, como no monitoramento do progresso do bioenriquecimento e na confirmação da especificidade de CLOs individuais. Inicie este procedimento com a produção de fagos conforme detalhado no protocolo textual para realizar o enriquecimento negativo contra BSA primeiro, adicionando quatro mililitros de um miligrama por mililitro.

Solução de BSA em salina tamponada com fosfato ou PBS em 12 tubos imunológicos e incubar durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, combinar partículas de fago de cada uma das três bibliotecas, reservando uma pequena quantidade dessa mistura de fago para verificação futura do processo de panning negativo. Em seguida, descartar a solução de BSA do primeiro tubo e lavar o tubo de duas a três vezes com PBS para remover qualquer BSA não ligada, adicionar as bibliotecas de fago combinadas a este primeiro tubo, incubar por 30 minutos à temperatura ambiente no agitador rotativo antes de coletar os fagos não ligados.

É importante lembrar que é fundamental reservar uma pequena quantidade de fago após concluir as várias rodadas de panning negativo contra cada alvo, a fim de verificar o sucesso do processo de panning e, em caso de contaminação, repetir o processo de panning negativo com os tubos restantes de solução de BSA a cada vez. Utilize o fago não ligado coletado após a incubação do tubo anterior. Em seguida, verifique a remoção de todos os ligantes de fago à BSA utilizando o procedimento de A FM detalhado na próxima seção do vídeo.

Para visualizar a ligação do fago usando um MF, adicione 10 a 20 microlitros do antígeno-alvo à micca clivada e incube por cinco a 10 minutos. Lave a micca cinco vezes com água, depois adicione 10 a 20 microlitros dos fagos à micca e incube por cinco a 10 minutos. Lave a micca outras cinco vezes com água e deixe secar ao ar.

Execute um processo de imagem FM utilizando um modo de batida FM com um nanoscópio três, um controlador no ar à temperatura ambiente. As sondas FM de silício possuem uma frequência de ressonância de 300 quilohertz e uma constante de mola de 40 newtons por metro. Insira a ponteira FM no carregador de ponteiras.

Conecte o carregador de ponta ao microscópio A FM. Coloque a amostra sob o microscópio A FM. Use os botões para alinhar o laser sobre a ponta A FM.

Defina a taxa de varredura em 3,05 hertz e a resolução de varredura em 512 amostras por linha. Ajuste automático do equipamento para otimizar a vibração da sílica. Frequência da ponta, inicie a varredura da amostra.

A ponta irá escanear a superfície da MICA medindo a altura do fago ligado. Os fagos são as linhas brancas longas após o processo de aquisição das imagens por nivelamento básico do fundo para garantir que todos os tamanhos de partículas sejam comparáveis dentro de cada imagem. A largura do fago pode variar de imagem para imagem devido a outros tamanhos de partículas e à área de varredura, mas nunca comprometerá a precisão sobre se o fago se liga ou não ao antígeno.

A imagem é aplainada em uma imagem 2D e regiões mal imagiadas causadas pela contaminação por PEG são destacadas para remoção em futuras análises de dados. Imunoprecipite a proteína TDP-43 saudável a partir de tecido cerebral humano saudável conforme descrito no protocolo textual, devido à menor quantidade de proteína imunoprecipitada. Realize essas rodadas de panning negativo utilizando primeiro a MICA – clive oito superfícies de MICA à primeira MICA com aproximadamente 100 microlitros da proteína imunoprecipitada e incube por cinco a 10 minutos à temperatura ambiente após a incubação.

Lave a MICA cinco vezes com solução salina tamponada com fosfato 0,1% com tween 20, abreviada como PBST. Em seguida, adicione aproximadamente 100 microlitros de fago após o panning negativo contra tecido cerebral humano saudável e incube por cinco a 10 minutos à temperatura ambiente. Na metade do tempo de incubação, adicione a proteína imunoprecipitada à segunda mica.

Colete o fago da primeira MICA antes de lavar a MICA cinco vezes com PBST 0,1%. Após lavar a segunda mica, adicione o fago previamente coletado. Repita todo o processo até que o fago seja submetido a panning negativo contra todas as oito micas com a proteína imunoprecipitada.

Verifique o sucesso do processo de panning utilizando o fago após a primeira e a oitava rodada de panning negativo com um FM para iniciar a imunoprecipitação da proteína TDP 43 a partir dos cérebros de indivíduos com uma LS conforme descrito no protocolo textual, clive três superfícies MICA. Em seguida, adicione 50 microlitros de TDP 43 de LS ao primeiro MICA após uma incubação de cinco minutos em temperatura ambiente. Lave a MICA cinco vezes com PBST 0,1%.

Em seguida, adicione 50 microlitros do fago coletado após o panning negativo contra TDP 43 saudável à MICA e incube por cinco minutos. Colete os fagos não ligados. É importante manter todos os fagos coletados nestas etapas de panning separados.

Em seguida, colete os fagos ligados utilizando três métodos de eluição. Primeiro, adicione 50 microlitros de tripsina a cada MICA e incube por não mais de 10 minutos. Colete a solução e guarde.

Em seguida, adicione 50 microlitros de trietilamina 100 milimolar a cada MICA e incube por não mais de 10 minutos. Colete a solução em volume igual de tampão tris HCL 1 molar, pH 7,4 e guarde. Terceiro, adicione 50 microlitros de TG one células diretamente ao MICA e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Além disso, adicione os fagos coletados dos dois primeiros métodos de eluição a 100 microlitros de células TG one na mesma concentração e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, repita este processo com uma segunda mica. Pegue os fagos não ligados coletados usando a primeira MICA com A LST DP 43 e adicione à segunda MICA com A-A-L-S-T-D-P 43, incubando por cinco minutos. Combine as células TG1 infectadas com os fagos, eluídas com tripsina de cada MICA A LST DP 43, e plaque em uma placa de ágar luria-bertani com ampicilina ou placa LBA.

Repita o mesmo processo para a trietilamina e os fagos TG um obtidos a partir dos dois conjuntos de A LS TDP 43 MICA, totalizando três placas. Repita todos os passos com uma terceira A LS mica, porém, neste caso, utilize fagos coletados após duas rodadas de panning negativo contra demência frontotemporal. Plaque as células TG um infectadas em três placas de LBA e incube durante a noite a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, conte o número de colônias nas seis placas de LBA com possíveis clones de LS. Deve haver menos colônias nas três placas de LBA provenientes da terceira MICA de LS comparadas às três placas de LBA após as duas rodadas de panning positivo utilizando o fago após panning negativo contra TDP 43 saudável. Produza fagos e fragmentos solúveis de domínio variável de cadeia simples de anticorpos ou s cvs a partir desses clones e analise utilizando diferentes imunoensaios para verificar a especificidade para tecido de LS.

A imagem FM é utilizada para monitorar as etapas de peneiramento negativo contra os diversos alvos, garantindo a remoção de todos os fagos reativos. Os resultados de FM mostraram ligação de fago após uma rodada de peneiramento negativo contra a alfa-sinucleína agregada e nenhuma ligação após oito rodadas. O peneiramento negativo contra tecido cerebral humano saudável foi realizado para remover fagos que se ligam aos muitos antígenos presentes no homogenato cerebral humano saudável.

É mostrada aqui a ligação de fagos ao tecido saudável após uma rodada de panning negativo e nenhuma ligação de fago restante após 10 rodadas de panning negativo. Após o preparo de ambos os fagos e SCFE solúvel a partir de clones potenciais, eles foram testados em ELISA indireto quanto à especificidade para um tecido LS. Quase todos os fagos mostraram preferência por tecido LS em vez de tecido saudável.

Resultados semelhantes são obtidos ao comparar a ligação de fagos a um LS em tecido de demência frontotemporal ou FTD. A comparação da ligação de SCFV a tecido de LS em tecidos saudáveis e FTD novamente mostrou ligação seletiva ao tecido de LS em quase todos os clones. O ensaio imunoenzimático em dot blot foi utilizado para verificar ainda mais a ligação ao tecido de LS e também para determinar quais clones são reativos em outras aplicações imunológicas.

Aqui, é mostrado o clone dois a ligando-se a um tecido LS. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como aplicar um panning biópico baseado em FM para isolar reagentes contra alvos específicos de doenças de interesse, reagentes que podem servir como ferramentas potenciais de diagnóstico e/ou terapêuticas.