Baseado-Probe-PCR em tempo real Abordagens para a medição quantitativa de microRNAs

O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar três métodos diferentes de PCR em tempo real baseados em sonda usados para quantificar micro RNA em amostras de plasma e soro. A PCR em tempo real baseada em sonda é obtida por hidrólise e detecção da sonda marcada com fluorescência, que contém um repórter fluorescente e um atenuador. Quando a polimerase aderente se estende do primer a montante e atinge as cinco extremidades principais da sonda, isso leva a uma dissociação física do emissor fluorescente do extintor.

Em seguida, uma única molécula de flúor quatro é liberada, que é registrada pelo detector e apresentada como um aumento incremental no sinal fluorescente dessa reação. Em última análise, a quantidade de produto de PCR gerada pode ser medida com base no aumento da fluorescência, permitindo uma quantificação precisa do alvo amplificado amplifi. Este método está emergindo como um método promissor para descobrir novos biomarcadores para vários tipos de câncer e outras doenças, como diabetes.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a abundância de microRNAs no soro e no plasma, ele também pode ser aplicado a outras amostras, como células e tecidos periféricos. Uma demonstração visual deste protocolo é crítica, pois algumas das etapas envolvidas na vedação da lâmina da matriz de nanofluidos podem ser difíceis de aprender simplesmente lendo o protocolo Para detecção de micro RNA maduro de PCR quantitativo em tempo real baseado em sonda a 4,2 microlitros das misturas individuais de reagentes QPCR para cada poço de uma placa óptica de 96 poços, seguido por 0,8 microlitros da solução de reação de CDNA recém-preparada apropriada. Sele a placa com a tampa óptica apropriada e, em seguida, inicie o QPCR no sistema de PCR em tempo real.

Para preparar um cartão de matriz microfluídica com um a 1000 nanogramas de entrada inicial de RNA total, primeiro descongele o tampão de primers pool A e B, fosfatos de nucleotídeos desoxi, cloreto de magnésio e inibidor de RNAs no gelo. Em seguida, para realizar a transcrição reversa, alíquota de 100 nanogramas de cada amostra de RNA em um tubo do pool A ou do pool B, seguido pela adição do volume apropriado de água livre de nuclease para elevar o volume total em cada tubo para três microlitros. Em seguida, alíquota de 4,5 microlitros do reagente de transcrição reversa apropriado misture nos tubos correspondentes apropriados.

Em seguida, coloque as amostras no termociclador e inicie a transcrição reversa. Enquanto a transcrição reversa está progredindo. Para entradas totais de amostras de RNA entre um e 350 nanogramas, descongele o conjunto predefinido de primers de pré-amplificação no gelo quando as amostras estiverem prontas, alíquota de 22,5 microlitros do reagente de pré-amplificador apropriado.

Misture nos tubos da piscina A e da piscina B e adicione 2,5 microlitros da amostra de CDNA transcrita reversa em cada um. Em seguida, carregue as amostras no termociclador e inicie o ciclo do pré-amplificador. No final do ciclo, adicione 75 microlitros de tampão 0,1 x tris EDTA ao CDNA pré-amplificado para carregar o cartão microfluídico.

Em seguida, adicione 450 microlitros de mistura de reagentes QPCR a nove microlitros do CDNA amplificado PREPL diluído para o cartão A, use o produto amplificado PREPL preparado usando o pool de primers A e adicione 441 microlitros de água livre de nuclease a um volume final de 900 microlitros. Então, quando atingir a temperatura ambiente, remova o cartão de matriz de baixa densidade da embalagem e coloque-o com o lado alumínio voltado para baixo em uma área limpa. Adicione 100 microlitros de reação de PCR.

Misture em cada uma das oito portas de preenchimento do cartão. Gire a placa por um minuto a 331 GS e temperatura ambiente. Em seguida, em um curso lento, constante e único e uniforme, empurre o carro pelo cartão até atingir o ponto final do selador.

Remova o cartão de matriz lacrado e corte os reservatórios. Em seguida, confirme se a tampa aquecida do bloco e o transportador de amostra corretos estão instalados no sistema de PCR em tempo real da matriz microfluídica. Para carregar as matrizes nanofluídicas, descongele o prepl diluído, o CDNA amplificado e o reagente QPCR em tempo real do homem de aderência.

Misture e misture o frasco de reagente QPCR girando. Em seguida, adicione 22,5 microlitros de mistura de reagentes QPCR a 22,5 microlitros de CDNA amplificado prepl diluído. Em seguida, adicione cinco microlitros de cada amostra em oito poços da placa de amostra de 384 poços do fluxo de trabalho da matriz nanofluídica, tendo o cuidado de colocar o pool A e o pool B de cada amostra.

Em oito blocos de poços adjacentes, quando todas as amostras tiverem sido transferidas, cubra cada seção da placa com pedaços de selador de placa de amostra de matriz aberta. Em seguida, descongele a primeira lâmina da matriz nanofluídica à temperatura ambiente após aproximadamente 15 minutos. Confirmado que a tampa de edição de bloco correta e o suporte de amostra estão instalados no sistema de matriz de nano fluídica e, em seguida, afrouxe o êmbolo da seringa de fluido de imersão com um puxão suave.

Remova a tampa, coloque a ponta no lugar e lave o ar da ponta. Em seguida, coloque as pontas do sistema de carregamento dentro do sistema de carregamento. Abra a tampa e coloque a placa de amostra no sistema de carregamento.

Agora coloque um par de luvas bem ajustadas. Abra cuidadosamente a embalagem da lâmina e incline lentamente a lâmina para fora da embalagem sem tocar na parte superior. Coloque o slide no sistema de carregamento com o código de barras à esquerda.

Em seguida, remova o selador da parte da placa de amostra destinada ao carregamento e use o software do sistema de carregamento para inserir a posição da lâmina do código de barras da corrediça, a posição da amostra e a configuração da ponta. Enquanto o slide estiver carregando, remova o plástico transparente e vermelho da parte inferior da tampa do slide. Em seguida, remova e sele cuidadosamente a corrediça dentro de 90 segundos após o final do processo de carregamento.

Coloque a corrediça dentro da placa clamp e a tampa deslizante na corrediça por 30 segundos, confirmando que a tampa está posicionada de forma que o código de barras seja exibido corretamente. Em seguida, posicione a seringa de fluido de imersão dentro da lâmina de forma que a ponta pressione contra a tampa e encha lentamente a lâmina com fluido de imersão, tomando cuidado para que o fluido escorra ao longo da tampa. Quando a corrediça estiver cheia, sele-a com o plugue, girando o parafuso até que a alça se quebre.

Por fim, remova a tampa plástica na parte superior da tampa deslizante e coloque cuidadosamente a lâmina no suporte deslizante do sistema PCR em tempo real. Tome cuidado para apoiar a parte inferior do slide, pois ele está sendo abaixado sem tocar na parte superior do slide. Em seguida, inicialize o sistema de PCR e inicie o programa de PCR quantitativo dentro de uma hora após o carregamento das amostras.

Usando este procedimento, um volume de reação de cinco microlitros pode produzir resultados semelhantes aos obtidos usando um volume de 20 microlitros com uma forte correlação. Até 39 ciclos aqui, gráficos de Altman e correlação brandos são mostrados para todos os 754 micro RN testados na mesma amostra usando cartões de matriz microfluídica, pois os microRNAs recém-demonstrados que têm valores de CT entre zero e 19,99 em ambas as trilhas também exibem expressões semelhantes com um coeficiente de determinação de 98% Além disso, o número de microRNAs com diferenças significativas observadas entre os ensaios aumenta quando os valores de CT entre 30 e 40 são selecionados. Neste gráfico, são mostrados os dados da plataforma nano fluidics array para todos os 754 microRNAs.

É importante examinar as curvas de amplificação para garantir que os resultados sejam indicativos de amplificação verdadeira. MicroRNAs de manutenção, como U six, também devem ser examinados quanto à variabilidade. Por exemplo, neste gráfico, um agrupamento típico de U seis réplicas exibindo baixo desvio padrão é mostrado, indicando a confiabilidade dos dados.

Finalmente, esses dados ilustram o aumento da variabilidade de U seis repetições em uma segunda amostra. Tecnologias baseadas em sonda de alto rendimento, como as matrizes de microfluídica e Nana fluidics, oferecem a facilidade de detectar de forma reprodutível e eficiente a abundância de vários microRNAs em um grande número de amostras em um tempo muito curto. Cada um dos fluxos de trabalho é projetado para atender a diferentes taxas de transferência com base no número de alvos de microRNA e no número de amostras a serem analisadas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar diferentes técnicas de PCR em tempo real baseadas em sonda para aumentar a abundância de micro NA.