Imagem Ca

O objetivo geral deste procedimento é registrar sinais de cálcio evocados por estímulos luminosos provenientes de fotorreceptores cônicos na retina de camundongo, utilizando um biossensor fluorescente. Isso é realizado isolando a retina de uma linhagem de camundongo transgênico que expressa um sensor genético de cálcio exclusivamente nos fotorreceptores cônicos. O segundo passo é cortar fatias verticais do tecido retiniano.

Em seguida, as fatias retinianas são montadas sobre lamínulas e colocadas sob um microscópio de dois fótons. O passo final é registrar os sinais de cálcio provenientes dos terminais sinápticos individuais dos fotorreceptores cônicos em resposta à estimulação luminosa. Por fim, os sinais de cálcio registrados são analisados offline.

Com este método, podemos registrar a atividade de muitos receptores de alimento simultaneamente com resolução subcelular. Essa é a principal vantagem em relação às técnicas existentes, como os registros elétricos de célula única, que são mais difíceis e demorados. Assim, a questão que gostaríamos de abordar é se e como o cálcio está envolvido na degeneração dos fotorreceptores.

Este método permite-nos determinar se a entrada de cálcio está induzindo a degeneração dos fotorreceptores ou se é um resultado do fato de que a célula está morrendo. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades principalmente porque a sensibilidade à luz da retina precisa ser preservada e, portanto, todas as etapas delicadas, incluindo a dissecação da retina e o corte em fatias, devem ser realizadas sob luz vermelha ou verde. Para iniciar este procedimento, transfira um globo ocular de camundongo para uma placa de Petri contendo uma solução extracelular recém-carbogenada.

Fure o globo ocular em qualquer ponto ao longo da borda entre a córnea e a esclera com uma agulha de injeção afiada. Em seguida, segure o olho pela esclera com um par de pinças e insira suavemente uma lâmina da tesoura no orifício. Corte ao longo da ora serrata para separar a parte anterior do olho da taça ocular.

Posteriormente, corte o copo ocular radialmente na posição da marca de caneta para indicar a posição dorsal na retina. Em seguida, posicione o copo ocular de modo que o corte dorsal aponte para longe. Segure a esclera nos lados esquerdo e direito do copo ocular inserindo as pontas da pinça entre a retina e a esclera.

Posteriormente, desprenda a retina invertendo suavemente a parte escleral do iica. Por fim, corte o nervo óptico para liberar a retina da esclera. Segure a borda da retina com um par de pinças e remova suavemente detritos e corpo vítreo da superfície retiniana usando um segundo par de pinças.

Quando a superfície da retina estiver limpa, faça mais três cortes radiais menores. Agora, imerga lentamente uma lâmina de vidro na solução extracelular próxima ao tecido. Puxe suavemente a retina para a lâmina de vidro com o lado das células ganglionares voltado para cima, segurando pela borda para reduzir danos mecânicos e dobramentos do tecido.

Em seguida, corte um retângulo de aproximadamente um por dois milímetros da região retiniana selecionada usando uma lâmina de bisturi curva, removendo a solução em excesso ao redor do tecido. Depois, coloque a membrana de fibra de nitrocelulose previamente preparada sobre o fragmento de retina, de modo que o lado das células ganglionares adira à membrana. Adicione imediatamente uma gota de meio extracelular sobre a membrana para fixar firmemente o tecido a ela.

Transfira o tecido retiniano montado em membrana para a câmara de corte contendo solução extracelular fresca. Em seguida, corte a retina em fatias verticais com espessura de 200 micrômetros. Usando cola para cortador de tecidos, fixe uma única fatia montada em membrana em uma lamínula de vidro previamente preparada com graxa de alto vácuo.

Mantenha a superfície de vidro abaixo da retina e livre de graxa. Em seguida, adicione uma gota de solução extracelular a cada fatia montada em lamínula na câmara de retenção à temperatura ambiente. Introduza carbogênio na câmara borbulhando um pequeno reservatório de água e mantenha a atmosfera na câmara de retenção umidificada.

Deixe as fatias repousarem na câmara de espera por 10 a 15 minutos antes de transferi-las uma a uma para a câmara de gravação. Transfira uma fatia da câmara de espera para a câmara de gravação e imediatamente inicie a perfusão com uma solução extracelular carbonatada. Mantenha uma taxa de fluxo de perfusão de dois mililitros por minuto e uma temperatura de 37 graus Celsius.

No câmara de gravação. Utilize uma objetiva de imersão em água de 20 x 0,95 NA e uma câmera CCD em combinação com um LED infravermelho abaixo da câmara de gravação. Para localizar o corte retiniano, inicie o sistema de imagem de dois fótons conforme indicado pelo fabricante.

Em seguida, ligue o laser e configure-o para 860 nanômetros. Ligue os dois canais de detecção para a imagem de fluorescência de ECFP e citrina. Em seguida, utilizando o software de aquisição de imagens, controle o microscópio de dois fótons para escanear e selecionar uma fileira de terminais cônicos para gravação, defina a aquisição de imagens para imagens de 128 por 16 pixels ou uma configuração semelhante, restringindo a área escaneada aos terminais cônicos para evitar o branqueamento dos pigmentos fotossensíveis nos segmentos externos.

Ligue o laser. Deixe os cones se adaptarem ao laser de varredura e à luz de fundo do estímulo por 20 a 30 segundos antes de apresentar os estímulos luminosos ou aplicar agentes farmacológicos. Agora, inicie a apresentação dos estímulos arbitrários.

Os estímulos são gerados pela modulação da intensidade dos dois LEDs ao longo do tempo, utilizando uma placa de microprocessador controlada por um software personalizado. Em seguida, inicie a gravação simultânea dos dois canais de fluorescência usando o respectivo software de aquisição de imagens. Os registros foram focados nos terminais sinápticos dos fotorreceptores cônicos em fatias da retina.

Este é um exemplo de uma região gravada com sete terminais individuais. A fluorescência foi registrada usando dois canais, um para o citrino do fre scepter e um para o doador fret ECFP. Apresentam-se aqui as alterações provocadas pela luz nas fluorescências do citrino e do ECFP registradas em uma única região de interesse.

E aqui estão as respostas de cálcio no terminal de um cone a uma série de flashes de luz intensa de um segundo em intervalos de cinco segundos. Esta figura mostra a análise quantitativa exemplar das respostas de cálcio em cones induzidas pela luz. E aqui estão as respostas de cálcio induzidas pela luz provenientes de um único terminal de cone.

Esta figura mostra a determinação da resposta média ao cálcio. O nível de cálcio em repouso representa a linha de base anterior à estimulação luminosa, e o tamanho da resposta é ra, que corresponde à área entre o nível de cálcio em repouso e a amplitude máxima, bem como entre a cinética do início e do término da resposta. Este procedimento pode ser ainda mais estendido.

Por exemplo, os sinais de cálcio nos fotorreceptores podem ser amplamente alterados sob diversas condições farmacológicas e estímulos intensos, permitindo investigar detalhadamente processos como adaptação ou diferentes etapas da transdução fotônica. Esta técnica permite investigar a dinâmica do cálcio em fotorreceptores cônicos sob condições fisiológicas normais. E isso é particularmente relevante para compreender a degeneração primária e secundária dos fotorreceptores cônicos em doenças humanas que causam cegueira, como a acrotopia ou a retinose pigmentosa.