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O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar um protocolo reprodutível para a formação de microlesões cardíacas por ESMO no interior do coração de camundongos infectados. Isso é conseguido infectando-se camundongos com ESMO e permitindo o desenvolvimento de bacteremia, o que dá às bactérias acesso à vasculatura cardíaca, onde podem invadir o miocárdio e formar lesões microscópicas. Em seguida, os corações são incluídos em parafina e corados convencionalmente ou fixados em composto OCT para coloração por imunofluorescência.

A avaliação das seções coradas pode revelar microlesões cardíacas distribuídas aleatoriamente pelo miocárdio, depósitos de colágeno e seções de miocárdio em fase de convalescença, bem como cápsulas de pneumococos dentro das microlesões cardíacas, demonstrando o procedimento. Armand Brown é estudante de pós-graduação no meu laboratório? Embora este método possa fornecer informações sobre os efeitos cardíacos deletérios do S. pneumoniae durante a doença pneumocócica invasiva em camundongos.

Também pode ser aplicado a amostras cardíacas de outros sistemas, como primatas não humanos ou humanos. Comece cultivando a cepa do sorotipo quatro ESMO Tiger quatro em caldo Todd Hewitt até uma densidade óptica de 0,5 a 620 nanômetros. Quando atingir a densidade correta, centrifugue o cultivo a 3.500 ×g por 10 minutos.

Em seguida, remova o sobrenadante utilizando uma linha de vácuo e ressuspenda as bactérias em PBS estéril a 10.000 unidades formadoras de colônia por mililitro. Agora, anestesie camundongos valve C com 10 a 12 semanas de idade e confirme o estado anestesiado com um leve aperto no dedo do pé usando uma pinça romba, aspire a suspensão bacteriana com uma seringa tipo lótus e acople uma agulha de 27 a 30 gauge. Em seguida, segure um camundongo anestesiado pelo pescoço com uma mão enquanto injeta intraperitonealmente 100 microlitros da suspensão usando a outra mão e coloque cada camundongo de volta em sua gaiola.

Os camundongos geralmente despertam entre 30 e 40 segundos após a injeção. É fundamental administrar a dose correta de S pneumoniae, caso contrário os camundongos podem se recuperar da infecção ou evoluir para doença pneumocócica invasiva muito rapidamente, impedindo o desenvolvimento de lesões. Como cada linhagem bacteriana apresenta diferentes níveis de virulência, pode ser necessário realizar tentativas sucessivas para identificar a dose adequada.

Deixe a infecção progredir por pelo menos 24 horas até um estágio inicial ou por 30 horas para um estágio avançado da infecção. Posteriormente, eutanazie cada camundongo infectado. Primeiro, colete uma amostra de sangue, desinfete a cauda com um cotonete alcoólico e corte uma seção de dois a três milímetros.

Colete dois microlitros de sangue do local da incisão. Dilua o sangue sucessivamente em dez vezes em PBS contendo heparina sódica na concentração de uma unidade por mililitro. Plaque cinco níveis de diluição em placas de ágar sangue tripticaseína soja e incube-as durante a noite.

No dia seguinte, realize a contagem de colônias. Prossiga com a coleta do coração conforme descrito na próxima seção. Alternativamente, 30 horas após a infecção.

Tente resgatar o camundongo administrando ampicilina por via intraperitoneal em 100 microlitros de solução salina. Continue administrando ampicilina a cada 12 horas durante 36 horas e colete os corações nos pontos temporais desejados. Primeiro, retire o coração.

Imobilize o camundongo eutanasiado em posição supina sobre uma plataforma cirúrgica e pulverize o tórax com etanol 70%, secando em seguida. Usando tesoura e pinça cirúrgicas, abra a cavidade torácica. Remova a caixa torácica e seccione o diafragma para expor o coração e os pulmões.

Em seguida, corte os vasos sanguíneos conectados ao coração e use pinças para excisar suavemente o coração sem causar contusões. Lave o coração com PBS e coloque-o em uma cassete de coleta de espécime tecidual para seccionamento coronal. Em seguida, transfira as cassetes para solução de formalina tamponada a 10% e, no dia seguinte, encaminhe para inclusão em parafina.

Em estágios iniciais, as lesões cardíacas podem ser identificadas pela alteração na aparência da cor e, em alguns casos, pela presença de células imunes. Em lesões avançadas, as células imunes estarão ausentes e serão encontradas lesões semelhantes a VA em seu lugar.

Utilizando uma seção cardíaca de cinco mícrons em lâminas de vidro com carga positiva, congele primeiro as seções, depois descongele-as e deixe secar ao ar. Fixe as lâminas em formalina tamponada neutra a 10% por 10 minutos a 25 graus Celsius. Em seguida, remova o fixador com três lavagens com PBS, durante cinco minutos cada lavagem.

Em seguida, permeabilize o tecido com Triton X-100 0,2% em PBS por 15 minutos. Remova o detergente com mais três lavagens em PBS puro. Em seguida, bloqueie o tecido com soro normal a 10% em PBS por uma hora após uma lavagem em PBS, cubra o corte com antissoro por duas horas a 37 graus Celsius.

Trate os controles negativos com antissoro de coelho ingênuo. Como o tecido cardíaco absorve prontamente a coloração imunofluorescente XI, levando a níveis elevados de fundo, a concentração e o tempo de incubação para diferentes tipos de anticorpos provavelmente precisarão ser otimizados. Duas horas depois, lave o antissoro com PBS. Em seguida, substitua a solução por um anticorpo secundário e deixe as lâminas incubarem a 37 graus Celsius por 30 minutos. Agora, aplique DPI a cinco miligramas por mililitro e lave as lâminas com PBS.

Por fim, monte as lâminas em bálsamo, salve e visualize-as por microscopia confocal. Comece removendo a parafina e hidratando as seções de tecido. Utilize lavagens com xilol seguidas por uma série graduada de lavagens com álcool.

Em seguida, banhe os cortes em ácido fosfomolíbdico 0,2% por cinco minutos, seguido de uma lavagem com água por cinco minutos; depois, corar com vermelho de sirius a 0,1% e ácido pícrico por duas horas. Em seguida, lave os cortes em ácido clorídrico 0,01 N por três minutos e enxágue-os em etanol 70% por um minuto. Agora, desidrate os cortes invertendo a série de banhos alcoólicos graduados, seguido de lavagens com xilol, monte para microscopia de luz e avalie as lâminas.

Camundongos desenvolveram doença pneumocócica invasiva após desafio com o tigre. Foram observadas quatro microlesões cardíacas na região dos ventrículos, e um aumento no tamanho e número de lesões foi notado entre 24 e 30 horas pós-infecção para confirmar que S. pneumoniae estava realmente presente nas lesões. Secções foram coradas para o polissacarídeo capsular do sorotipo quatro produzido pelo Tigre quatro.

Isso confirmou a presença de agregados densos e fortemente compactados nos sítios de microlesão. A coloração com vermelho piro sirius foi realizada em cortes cardíacos de camundongos que haviam sido resgatados com ampicilina e controles não infectados. Nos resgates.

Houve um aumento acentuado na presença e intensidade da coloração com bandas provenientes do que parecem ser locais anteriores de lesão nos ventrículos. Ao tentar realizar este procedimento, é importante lembrar-se de infectar os camundongos com uma quantidade suficiente de S. pneumoniae para permitir que a infecção prossiga por pelo menos 28 a 30 horas, de modo que a bacteriemia e as microlesões cardíacas tenham tempo suficiente para se formar.