Visualização de Streptococcus pneumoniae Dentro Microle- cardíacas e remodelação cardíaca Subsequente

O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar um protocolo reprodutível para a formação de microlesões cardíacas ESMO no coração de camundongos infectados. Isso é conseguido infectando camundongos com ESMO e permitindo o desenvolvimento de bacteremia, dando às bactérias acesso à vasculatura cardíaca, onde podem invadir o miocárdio e formar lesões microscópicas. Em seguida, os corações são parafinas, incorporados e corados convencionalmente ou fixados em composto OCT para coloração imunofluorescente.

A avaliação das seções coradas pode mostrar microlesões cardíacas distribuídas aleatoriamente pelas deposições de colágeno do miocárdio e convalescentes minhas seções cardíacas e cápsulas pneumocócicas dentro da microlesão cardíaca Demonstrando o procedimento. Armand Brown é um estudante de pós-graduação no meu laboratório? Embora este método possa fornecer informações sobre os efeitos cardíacos prejudiciais da pneumonia por S durante a doença pneumocócica invasiva em camundongos.

Também pode ser aplicado a amostras cardíacas de outros sistemas, como primatas não humanos ou humanos. Comece com o crescimento do sorotipo ESMO quatro cepa Tiger quatro em caldo Todd Hewitt para uma densidade óptica de 0,5 a 620 nanômetros. Quando na densidade correta, coloque a cultura em 3.500 G por 10 minutos.

Em seguida, remover o sobrenadante com uma linha de vácuo e ressuspender as bactérias com PBS estéril a 10 000 unidades formadoras de colónias por mililitro. Agora anestesiado 10 a 12 semanas de idade camundongos válvula C e confirmar o seu estado anestesiado com um beliscão suave do dedo do pé de um par de pinças rombas, seringa de lótus com a suspensão bacteriana e anexar uma agulha de calibre 27 a 30. Em seguida, segure um camundongo anestesiado pela nuca com uma mão enquanto injeta 100 microlitros de suspensão intraperitoneal com a outra mão, coloque cada camundongo de volta em sua gaiola.

Os camundongos normalmente acordam 30 a 40 segundos após a injeção. Obter a dose correta de pneumonia por S é fundamental, ou os camundongos podem se recuperar da infecção ou contrair doença pneumocócica invasiva muito rapidamente para que as lesões se desenvolvam. Como cada cepa bacteriana tem diferentes níveis de lente auricular, pode ser necessário tentativa e erro para identificar a dose correta.

Permita que a infecção prossiga por pelo menos 24 horas para um estágio inicial ou para 30 horas para uma infecção em estágio avançado. Mais tarde, eutanasiar cada camundongo infectado. Primeiro, pegue uma amostra de sangue, desinfete a cauda com um cotonete embebido em álcool e corte uma seção de dois a três milímetros.

Colete dois microlitros de sangue do local do recorte. Diluir o sangue dez vezes em PBS contendo heparina sódica a uma unidade por mililitro. Coloque cinco níveis de diluições em placas trípticas de ágar sangue de soja e incube-as durante a noite.

No dia seguinte, faça a contagem das colônias. Prossiga com a colheita do coração conforme descrito na próxima seção. Alternativamente, 30 horas após a infecção.

Tente resgatar o camundongo administrando ampicilina interperitoneal em 100 microlitros de solução salina. Continue fornecendo ampicilina a cada 12 horas por 36 horas e colete corações nos pontos de tempo desejados. Primeiro, colha o coração.

Imobilize o camundongo sacrificado em decúbito dorsal em uma plataforma cirúrgica e borrife o peito com etanol a 70% e seque. Usando tesouras cirúrgicas e fórceps, abra a cavidade torácica. Remova a caixa torácica e corte o diafragma para expor o coração e os pulmões.

Em seguida, corte os vasos sanguíneos conectados ao coração e use uma pinça para extirpar suavemente o coração sem machucar. Enxágue o coração com PBS e coloque-o em um de coleta de amostras de tecido para corte coronal. Em seguida, transfira os para uma solução de formalina tamponada a 10% e, no dia seguinte, envie para inclusão em parafina.

Nos estágios iniciais, as lesões cardíacas podem ser identificadas por sua mudança na aparência da cor e, em alguns casos, pela presença de células imunes. Em lesões avançadas, as células imunes estarão ausentes e grandes. Lesões semelhantes a VA são encontradas em seu lugar.

Usando uma seção cardíaca de cinco mícrons em lâminas de vidro carregadas positivamente, primeiro congele as seções, depois descongele-as e deixe-as secar ao ar. Fixe as lâminas em forma tamponada a 10% neutra por 10 minutos a 25 graus Celsius. Em seguida, remova o fixador com três lavagens e PBS por cinco minutos por lavagem.

Em seguida, permeável o tecido com 0,2% tritton X 100 em PBS por 15 minutos. Remova o detergente com mais três lavagens em PBS direto. Em seguida, bloqueie o tecido com soro de revestimento a 10% em PBS por uma hora após um enxágue em PBS, cubra a seção com anti-soro por duas horas a 37 graus Celsius.

Trate os controles negativos com anti-soro de coelho ingênuo Como o tecido cardíaco absorve prontamente a coloração de imunofluorescência XI, levando a altos níveis de fundo, a concentração no tempo de incubação para diferentes tipos de anticorpos provavelmente precisará ser otimizada Duas horas depois, lave o soro antis com PBS. Em seguida, substitua a solução por um anticorpo secundário e deixe as lâminas incubarem a 37 graus Celsius por 30 minutos. Agora aplique DPI a cinco miligramas por mililitro e lave as lâminas com PBS.

Por fim, monte as lâminas no chão, salve e fotografe-as com microscopia confocal. Comece removendo a parafina e hidratando as seções de tecido. Use lavagens com xileno seguidas de uma série graduada de lavagens com álcool.

Em seguida, banhe as seções em ácido fosfomético a 0,2% por cinco minutos, seguido de um enxágue com água de cinco minutos na próxima mancha com 0,1% de ácido vermelho e rico por duas horas. Em seguida, lave as seções em ácido clorídrico normal 0,01 por três minutos e enxágue-as em etanol 70% por um minuto. Agora desidrate as seções invertendo a série de banhos de álcool graduados, seguida de lavagens com xileno usando montagem de microscopia de luz e avalie as lâminas.

Os camundongos desenvolveram doença pneumocócica invasiva após um desafio com o tigre. Quatro microlesões cardíacas de tensão foram observadas nos ventrículos e um aumento no tamanho e número de lesões foi observado entre 24 e 30 horas após a infecção para verificar se a pneumonia estava de fato dentro das lesões. Os cortes foram corados para o polissacarídeo capsular sorotipo quatro produzido pela Tiger quatro.

Isso confirmou a presença de agregados densos e compactados dentro dos locais das microlesões. A coloração vermelha grave de Piro foi realizada em cortes cardíacos de camundongos que foram resgatados com ampicilina e controles não infectados. Em resgates.

Houve um aumento dramático na presença e intensidade da mancha com bandas fluindo do que parecem ser antigos locais de lesão nos ventrículos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de infectar camundongos com uso suficiente de pneumonia por S para permitir que a infecção prossiga por pelo menos 28 a 30 horas para que a bacteremia e as microlesões cardíacas tenham tempo suficiente para se formar.