Name: Visualização de Streptococcus pneumoniae Dentro Microle- cardíacas e remodelação cardíaca Subsequente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprenda a visualizar microlesões cardíacas causadas por Streptococcus pneumoniae em camundongos usando técnicas de coloração convencional e imunofluorescência. Este protocolo permite avaliar o remodelamento cardíaco em estágios iniciais e avançados da infecção.

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Este trabalho foi apoiado pela concessão 13IRG14560023 da American Heart Association e NIH concede AI078972 e HL108054 à CJO. O apoio ao AOB foi do NIH National Center for Advancing Translational Sciences, NIH ULTR001120 e F31 A110417701.

NOTA: Todas as experiências com camundongos foram revisadas e aprovadas pelo Animal Care Institucional e Comissões de uso na University of Texas Health Science Center em San Antonio (protocolo nº 13032-34-01C). Cuidados com os animais e os protocolos experimentais aderiram ao Direito Público 89-544 (Animal Welfare Act) e suas alterações, as orientações serviços de saúde pública, e no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA). 1. Infecção <ol><li> Obter ratinhos BALB / c de ambos os sexos com idades entre 10-12 semanas de idade. NOTA: S. pneumoniae sorotipo 4 estirpe TIGR4 é um isolado clínico virulenta que foi seqüenciado 16. </li><li> Cresça TIGR4 em caldo de Todd-Hewitt a 37 ° C em 5% de CO2 até atingirem uma densidade óptica (DO) 620 de 0,5 (correspondendo a 1,0 x 10 8 unidades formadoras de colónias [] CFU / ml). Agregar a cultura de pneumococos por centrifugação durante 10 min a 3, 500 x g e eliminar o sobrenadante usando uma linha de vácuo. Suspender as bactérias e diluir com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) a uma concentração final de 1,0 x 10 4 CFU / mL. </li><li> Utilizando uma câmara de indução, anestesiar ratos com 2,5% de isoflurano vaporizado em oxigênio. Confirme estado de anestesia por pitada toe suave com uma pinça sem corte. <ol><li> Segurando o rato anestesiado pela sua nuca e na vertical com uma mão, injetar cada rato por via intraperitoneal (ip) com 100 mL da S. pneumoniae suspensão utilizando uma seringa com uma agulha de calibre 27-30 (correspondente a uma dose de desafio de 1,0 x 10 3 CFU). Coloque a parte de trás do mouse em sua gaiola. Ratos normalmente despertar 30-40 seg após a injeção. </li></ol></li><li> Permitir que a infecção para continuar por pelo menos 24 (antecipado) ou 30 (avançado) hr. <ol><li> Eutanásia dos ratinhos por asfixia com CO 2. Execute deslocamento cervical para garantir rato tem falecido. A eutanásia é ainda confirmada pela remoçãodo coração no passo 1.6. </li></ol></li><li> Desinfetar a cauda com um algodão embebido em álcool e cortar uma seção de 2-3 mm. Recolhe 2 ul de sangue em série e diluir o sangue de 10 vezes em PBS contendo heparina de sódio 1 U / ml de cinco vezes. Diluições em série de placa sobre uma placa de agar tríptico de soja sangue e incubar durante a noite a 37 ° C em 5% de CO 2. O próximo dia de extrapolar colónia conta o nível de bacteremia. </li><li> Imobilizar o mouse em decúbito dorsal sobre uma plataforma cirúrgica. Pulverizar o peito com etanol 70% e seque. Usando uma tesoura cirúrgica e uma pinça abrir a cavidade torácica, retire a caixa torácica, e transecto o diafragma para expor o coração e os pulmões. Usando uma tesoura cortar os vasos sanguíneos ligados ao coração e extirpar suavemente o coração com cuidado para evitar contusões com uma pinça. </li><li> Lavar o coração com PBS e, em seguida, colocar em cassetes de colheita de amostras de tecidos que tais secções coronais seria obtido durante o corte do tecido. Para inclusão em parafina, place as cassetes em 10% solução tamponada com formalina e no dia seguinte enviar para inclusão em parafina. <ol><li> Alternativamente congelamento flash usando outubro Composto dentro de um cryomold que foi colocado em gelo seco. </li></ol></li></ol> 2. A visualização das lesões cardíacas e pneumococos dentro das lesões <ol><li> Reduzir secções de coração embebidos em parafina de tal forma que os quatro câmaras do coração são visíveis na secção de cada tecido. Cortar as lâminas com uma espessura de 5 mm. </li><li> Desparafinar e mancha slides com hematoxilina e eosina (H &amp; E) usando métodos padrão 17. </li><li> Ver H &amp; E manchada seções cardíacos usando um microscópio de luz em baixa (100X, 200X) e alta (imersão em óleo: 400X, 1000X) ampliações. Caracterizar os corações para a presença de microlesões no miocárdio. Aqui, adquirir H &amp; E imagens usando um microscópio Zeiss Axioskop 2 equipado com um 100X 1,3 numérica objetivo abertura Plan-Neofluar. NOTA: Em fases iniciais l cardíacaesions são discriminados pela sua aparência colorida diferencial e, em alguns casos, a presença de células imunes (monócitos e granulócitos) que parecem ser monócitos. Nas lesões avançadas, particularmente aqueles observados em 30 horas, as células imunológicas são lesões vacuole-como ausentes e grandes são observados em seu lugar. É importante notar que, enquanto o influxo de células imunitárias durante as fases iniciais do desenvolvimento da lesão cardíaca pode ocorrer não parece ser um requisito. </li></ol> 3. Immunofluorescent Microscopia para pneumococos dentro Microle- <ol><li> Seção coração em cryomolds com microtome a uma espessura de 5 seções um e colocar em lâminas de vidro com carga positiva. Permitir secções cardíacas congelados para descongelar e ar seco. Fix secções durante 10 minutos em 10% de formalina tamponada neutra (pH 6,8-7,2 a 25 ° C). </li><li> Lavagem das lâminas (3x) em PBS durante 5 min, para permeabilizar 15 min em 0,2% de Triton X-100 em PBS, em seguida, lavar novamente em PBS. </li><li> Secti tecido Bloco<html> em em lâminas com 10% de soro de cabra em PBS durante 1 hora. </li><li> Lavar as lâminas com PBS, e incubar tampa com secções cardíacos de coelho anti-pneumococos do serotipo 4 anti-soro a 1: 1000 em PBS com 10% de soro de cabra durante 2 horas a 37 ° C. NOTA: Para os controles negativos investigadores devem usar ingênuo anti-soro de coelho </li><li> Após lavagem com PBS, a tampa e incubar secções com 10% de soro de cabra-PBS com cabra anti-coelho FITC anticorpo conjugado a 1: 2000 durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Seguindo as instruções do fabricante, usar DAPI (4 &#39;, 6- diamidino-2-fenilindolo) em 5 mg / ml para a visualização de núcleos eucarióticos. Lave e montar secções de tecido com FluorSave. </li><li> Adquirir imagens fluorescentes utilizando um sistema de microscópio confocal tanto a baixa como alta ampliação. Ajustar a abertura numérica em conformidade para se obter resultados óptimos. Aqui, adquirir imagens fluorescentes usando um sistema confocal com um objetivo abertura numérica 60X 1,42. </li></ol>&quot;&gt; 4. Salvamento Antibiótico de fossa séptica Mice <ol><li> Comece com ratinhos infectados ip com 1,0 x 10 3 CFU de TIGR4 como anteriormente indicado na etapa 1. </li><li> Começando às 30 horas pós-infecção, administrar farmacêutica ampicilina grau ip (80 mg / kg de peso corporal) em 100 ul de solução salina a cada 12 h durante 36 h. Recolha corações no ponto de tempo desejado e processo tal como descrito no passo 1.6 para inclusão em parafina e tecido, o seccionamento. </li></ol> 5. Collagen Detection Deposition <ol><li> Usando xileno e lavagens álcool graduado com água, Desparafinar e tecidos hidrato seções deionizada usando métodos padrão 17. Tratar secções com ácido fosfomolíbdico aquosa a 0,2% durante 5 minutos e lavar com água desionizada durante 5 minutos. </li><li> Secções mancha com 0,1% de vermelho Sirius em ácido pícrico de 2 h à temperatura ambiente. </li><li> Lave os cortes em ácido clorídrico 0,01 N durante 3 min e enxaguar utilizando etanol a 70% durante 1 min. </li><li> Desidrataçãote as seções usando o idêntico, mas a fim de lavagens ao indicado na 5.1 reverter, desidratar seções cardíacas no aumento e classificados concentrações de etanol, em seguida, xileno. </li><li> Cortes de tecido Mount com uma solução de montagem para avaliação microscópica. </li><li> Para identificar as regiões de deposição de colágeno, examinar secções de tecido manchado por áreas de coloração leitura profunda com baixa e alta ampliação usando um microscópio de luz. Qualquer área dentro dos ventrículos do coração, que é o vermelho é uma área onde o colágeno tem sido depositado. Áreas sem essa mancha vermelha são locais de tecido saudável falta deposição de colágeno. Aqui, adquirir Picro Sirius Red imagens coradas utilizando um microscópio equipado com um objetivo abertura numérica 20X 0,5. NOTA: As manchas vermelhas no átrio tecidos saudáveis. </li></ol>

<ol><li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+complications+in+patients+with+community-acquired+pneumonia%3A+incidence%2C+timing%2C+risk+factors%2C+and+association+with+short-term+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: incidence, timing, risk factors, and association with short-term mortality.</a> Circulation. 125, 773-781 (2012).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+bacterial+pneumonia+is+associated+with+the+occurrence+of+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Acute bacterial pneumonia is associated with the occurrence of acute coronary syndromes.</a> Medicine (Baltimore). 88, 154-159 (2009).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+complications+in+patients+with+community-acquired+pneumonia%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+observational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: a systematic review and meta-analysis of observational studies.</a> PLoS Med. 8, e1001048(2011).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+stratification+for+cardiac+complications+in+patients+hospitalized+for+community-acquired+pneumonia.+Mayo+Clin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc%22%5BJournal%5D)">Risk stratification for cardiac complications in patients hospitalized for community-acquired pneumonia. Mayo Clin.</a> Proc. 89, 60-68 (2014).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+11+common+viral+and+bacterial+pathogens+causing+community-acquired+pneumonia+or+sepsis+in+asymptomatic+patients+by+using+a+multiplex+reverse+transcription-PCR+assay+with+manual+%28enzyme+hybridization%29+or+automated+%28electronic+microarray%29+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of 11 common viral and bacterial pathogens causing community-acquired pneumonia or sepsis in asymptomatic patients by using a multiplex reverse transcription-PCR assay with manual (enzyme hybridization) or automated (electronic microarray) detection.</a> Journal Of Clinical Microbiology. 46, 3063-3072 (2008).</li>
<li>Musher, D. M., Rueda, A. M., Kaka, A. S., Mapara, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+pneumococcal+pneumonia+and+acute+cardiac+events%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The association between pneumococcal pneumonia and acute cardiac events.</a> Clin Infect Dis. 45, 158-165 (2007).</li>
<li>Brown, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+translocates+into+the+myocardium+and+forms+unique+microlesions+that+disrupt+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae translocates into the myocardium and forms unique microlesions that disrupt cardiac function.</a> PLoS Pathogens. In press, (2014).</li>
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<li>Flick, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+elimination+of+the+binding+motif+on+fibrinogen+for+the+S.+aureus+virulence+factor+ClfA+improves+host+survival+in+septicemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Genetic elimination of the binding motif on fibrinogen for the S. aureus virulence factor ClfA improves host survival in septicemia.</a> Blood. 121, 1783-1794 (2013).</li>
<li>Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+play+in+four+acts%3A+Staphylococcus+aureus+abscess+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation.</a> Trends Microbiol. 19, 225-232 (2011).</li>
<li>Arenal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+the+spatial+characteristics+of+myocardial+scar+tissue+determine+the+risk+of+ventricular+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Do the spatial characteristics of myocardial scar tissue determine the risk of ventricular arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 94, 324-332 (2012).</li>
<li>Deneke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+histopathology+of+electroanatomic+mapping+after+cooled-tip+radiofrequency+ablation+to+treat+ventricular+tachycardia+in+remote+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Human histopathology of electroanatomic mapping after cooled-tip radiofrequency ablation to treat ventricular tachycardia in remote myocardial infarction.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 1246-1251 (2005).</li>
<li>Bakker, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reentry+as+a+cause+of+ventricular+tachycardia+in+patients+with+chronic+ischemic+heart+disease%3A+electrophysiologic+and+anatomic+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reentry as a cause of ventricular tachycardia in patients with chronic ischemic heart disease: electrophysiologic and anatomic correlation.</a> Circulation. 77, 589-606 (1988).</li>
<li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+successful+ablation+sites+and+the+scar+border+zone+defined+by+substrate+mapping+for+ventricular+tachycardia+post-myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between successful ablation sites and the scar border zone defined by substrate mapping for ventricular tachycardia post-myocardial infarction.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 465-471 (2005).</li>
<li>Wu, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+risk+for+ventricular+tachyarrhythmias+and+sudden+cardiac+death%3A+is+there+a+role+for+cardiac+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Cardiovasc+Imaging%22%5BJournal%5D)">Assessing risk for ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death: is there a role for cardiac MRI.</a> Circ Cardiovasc Imaging. 5, 2-5 (2012).</li>
<li>Tettelin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+a+virulent+isolate+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae.</a> Science. 293, 498-506 (2001).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses neste estudo.

Neste relatório, um método altamente reprodutível para induzir S. pneumoniae mediada microlesões cardíacos em ratos durante IPD e as técnicas para a sua visualização é demonstrada. Os ratinhos são infectados com uma dose de bactérias que ultrapassa o limiar do sistema imunitário para a depuração, que conduz a bacteremia de alto grau, semelhante ao que ocorre durante a sepsia humano, e leva a uma eventual translocação bacteriana no miocárdio. Por razões ainda desconhecidas, S. pneumoniae no coração é ca...

Internação de adultos para pneumonia adquirida na comunidade (PAC) carrega um risco documentado para eventos cardíacos adversos que contribui para a mortalidade 1-4. Em um estudo recente realizado por Corrales-Medina et al. Complicações cardíacas foram encontrados para ser associado com e / ou responsáveis ​​por 27% dos óbitos associados à pneumonia 3. Streptococcus pneumoniae (pneumococo), a causa mais comum de PAC e sepse 5, foi diretamente associada a eventos cardíacos adversos em tantos como 19% dos pacientes adultos internados 6. Eventos cardíacos adversos associados com pneumonia incluem falha nova ou agravada cardíaca congestiva, arritmias e infarto do miocárdio em ordem decrescente de freqüência de 6. Num artigo recente PLoS Pathogens por Brown et al., S. pneumoniae foi encontrado para ser capaz de translocação através do endotélio vascular cardíaca, a entrada no myocardium, e formação de lesões microscópicas não purulentos discretos (microlesões) cheios de bactérias nos ventrículos durante a doença pneumocócica invasiva (DPI) 7. Evidência de formação microlesion cardíaca foi observada em amostras cardíacas a partir de primatas não humanos e os indivíduos que tinham sucumbido à infecção pneumocócica. Da mesma forma, camundongos infectados experimentalmente reproducibly desenvolvido microlesões cardíacos. Em camundongos, o tamanho microlesion e número foi positivamente correlacionada com a duração e gravidade de bacteremia, os níveis de troponina cardíaca em soros e eletrofisiologia cardíaca aberrante. A translocação bacteriana para o coração foi observado que ocorre através dos mesmos mecanismos responsáveis ​​pela translocação do pneumococo através da barreira sangue-cérebro e o desenvolvimento de meningite pneumocócica, ou seja, a proteína de ligação a colina A invasão mediada por células endoteliais vasculares em um receptor de laminina e Plaquetas receptor do fator de -activating forma dependente 8. Microlesformação de iões também exigiu a pneumocócica toxina pneumolisina de formação de poros que foi encontrado para matar cardiomiócitos 7. Microlesões cardíacos pneumocócicas são distintas do soft-tecido purulenta e abcessos cardíacos que são causadas por outras bactérias Gram-positivas, incluindo Staphylococcus aureus. Estes são caracterizados por um único focos das bactérias rodeadas por neutrófilos e a deposição de fibrina 9,10. Microle- formado por S. pneumoniae são menores em tamanho, distribuídos por todo o coração afetado, e carecem de infiltrados de células imunes. Durante as fases iniciais da infecção, microlesões causada por S. pneumoniae aparecem como áreas de tecido danificado ou inflamado reminiscente dos sinais patológicos de cardiomiopatia. Alguns monócitos podem ser observados durante este tempo, no entanto a sua presença é de curta duração e lesões rapidamente tornam-se necróticas na aparência e cheia de bactérias ao mesmo tempo continuar a GRow em tamanho até a morte do animal ou intervenção antimicrobiana. É importante salientar, no prazo de 3 dias de intervenção antibiótico, infiltração de células imunes profusa é observada no antigo local da lesão e isso é acompanhado por deposição de colágeno robusto. Remodelação cardíaca semelhante foi relatado para ocorrer após o infarto, juntamente com consequências duradouras na função cardíaca 11-15. Assim, microlesões são uma possível explicação para os eventos cardíacos adversos que ocorrem durante o IPD e, possivelmente, o aumento da incidência de mortalidade cardíaca relacionada com em indivíduos convalescentes que sobreviveram o episódio da doença. Nisto, a instrução é fornecido no modelo experimental de rato IPD e a formação da lesão cardíaca e visualização de microlesões cardíacas em estágios precoces e tardios da infecção. O protocolo para detecção de deposição de colágeno nos animais que foram salvos pela intervenção antimicrobiana é demonstrada. O objetivo deste artigo é o de facilitate a pesquisa de outros pesquisadores sobre esta patologia pneumocócica importante e romance.

<table><tbody><tr><td>Caldo Todd-Hewitt</td><td>Composto Neogen</td><td>7161A</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T;</td><td>Tecido-Tek (Sakura Finetek)&nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Fisher Scientific (Acros)</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Cabra Normal</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>anti-sorotipo 4 pneumococo anti-soro&nbsp;</td><td>Statens Serum Institut</td><td>16747</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo conjugado FITC anti-coelho para cabras&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-096-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsave</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>S70104</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>ácido fosfomolíbdico 0.2%&nbsp;</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>26357-01</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Sirius Red em ácido pícrico&nbsp;</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>26357-02</td><td></td></tr><tr><td>0.01 N ácido clorídrico&nbsp;</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>26357-03</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio de Aderência de Tecido</td><td>Polysciences, Inc</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>Pomada Paralube Vet</td><td>Dechra</td><td>12920060</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Coloração de Hematoxilina e Eosina</td><td>não especificado&nbsp;</td><td></td><td>padrão</td></tr></tbody></table>

visualização de<em&gt; streptococcus pneumoniae</em&gt; dentro microle- cardíacas e remodelação cardíaca subsequente

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Durante a bacteremia Streptococcus pneumoniae pode translocar através do endotélio vascular para o miocárdio e formar bactérias cheios de lesões microscópicas discretas (microlesões) que são notáveis ​​devido à ausência de infiltrado de células imunitárias. Devido a sua liberação de produtos cardiotóxicos, S. pneumoniae dentro microlesões são pensados ​​para contribuir para a insuficiência cardíaca que é freqüentemente observado durante a doença pneumocócica invasiva fulminate em adultos. Nisto é demonstrado um protocolo para a infecção experimental do rato que leva à formação reprodutíveis microlesion cardíaca dentro de 30 horas. Instrução é fornecida na identificação microlesion em hematoxilina &amp; eosina seções coração manchado e as distinções morfológicas entre microlesões precoces e tardias são realçados. Instrução é fornecida em um protocolo de verificação de S. pneumoniae dentro microlesões usando anticorpos contra polissacarídeo capsular e pneumocócicaA microscopia de imunofluorescência. Por último, um protocolo para a intervenção antibiótico que resgata ratinhos infectados e para a detecção e avaliação da formação de cicatriz no coração dos ratos convalescentes é fornecido. Juntos, esses protocolos irá facilitar a investigação dos mecanismos moleculares subjacentes invasão cardíaca pneumocócica, a morte de cardiomiócitos, remodelação cardíaca como resultado da exposição a S. pneumoniae, e a resposta imune para o pneumococos no coração.

Visualização de microlesões por H &amp; E Microlesões cardíacas foram observadas nos ventrículos de H &amp; E coradas secções cardíacas de ratos com IPD seguintes seu desafio ip com TIGR4. A Figura 1 demonstra o aumento no tamanho das lesões entre 24 e 30 horas pós-infecção (hpi), com maior número de hematoxilina -stained (ie, azul-púrpura) pneumococos visível no interior da lesão. Microle- foram caracterizadas por uma morfologia semelhante vacúolo, mais de...

Streptococcus pneumoniae forma lesões microscópicas discretas e não purulentas no coração. Está delineado o protocolo para um modelo murino de formação de microlesões cardíacas. São fornecidas instruções sobre visualização de microlesões usando microscopia, discriminação entre microlesões precoces e tardias e métodos para detectar remodelação cardíaca em corações de animais convalescentes.

Visualização de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Dentro Microle- cardíacas e remodelação cardíaca Subsequente

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar um protocolo reprodutível para a formação de microlesões cardíacas por ESMO no interior do coração de camundongos infectados. Isso é conseguido infectando-se camundongos com ESMO e permitindo o desenvolvimento de bacteremia, o que dá às bactérias acesso à vasculatura cardíaca, onde podem invadir o miocárdio e formar lesões microscópicas. Em seguida, os corações são incluídos em parafina e corados convencionalmente ou fixados em composto OCT para coloração por imunofluorescência.A avaliação das seções coradas pode revelar microlesões cardíacas distribuídas aleatoriamente pelo miocárdio, depósitos de colágeno e seções de miocárdio em fase de convalescença, bem como cápsulas de pneumococos dentro das microlesões cardíacas, demonstrando o procedimento. Armand Brown é estudante de pós-graduação no meu laboratório? Embora este método possa fornecer informações sobre os efeitos cardíacos deletérios do S. pneumoniae durante a doença pneumocócica invasiva em camundongos.Também pode ser aplicado a amostras cardíacas de outros sistemas, como primatas não humanos ou humanos. Comece cultivando a cepa do sorotipo quatro ESMO Tiger quatro em caldo Todd Hewitt até uma densidade óptica de 0,5 a 620 nanômetros. Quando atingir a densidade correta, centrifugue o cultivo a 3.500 ×g por 10 minutos.Em seguida, remova o sobrenadante utilizando uma linha de vácuo e ressuspenda as bactérias em PBS estéril a 10.000 unidades formadoras de colônia por mililitro. Agora, anestesie camundongos valve C com 10 a 12 semanas de idade e confirme o estado anestesiado com um leve aperto no dedo do pé usando uma pinça romba, aspire a suspensão bacteriana com uma seringa tipo lótus e acople uma agulha de 27 a 30 gauge. Em seguida, segure um camundongo anestesiado pelo pescoço com uma mão enquanto injeta intraperitonealmente 100 microlitros da suspensão usando a outra mão e coloque cada camundongo de volta em sua gaiola.Os camundongos geralmente despertam entre 30 e 40 segundos após a injeção. É fundamental administrar a dose correta de S pneumoniae, caso contrário os camundongos podem se recuperar da infecção ou evoluir para doença pneumocócica invasiva muito rapidamente, impedindo o desenvolvimento de lesões. Como cada linhagem bacteriana apresenta diferentes níveis de virulência, pode ser necessário realizar tentativas sucessivas para identificar a dose adequada.Deixe a infecção progredir por pelo menos 24 horas até um estágio inicial ou por 30 horas para um estágio avançado da infecção. Posteriormente, eutanazie cada camundongo infectado. Primeiro, colete uma amostra de sangue, desinfete a cauda com um cotonete alcoólico e corte uma seção de dois a três milímetros.Colete dois microlitros de sangue do local da incisão. Dilua o sangue sucessivamente em dez vezes em PBS contendo heparina sódica na concentração de uma unidade por mililitro. Plaque cinco níveis de diluição em placas de ágar sangue tripticaseína soja e incube-as durante a noite.No dia seguinte, realize a contagem de colônias. Prossiga com a coleta do coração conforme descrito na próxima seção. Alternativamente, 30 horas após a infecção.Tente resgatar o camundongo administrando ampicilina por via intraperitoneal em 100 microlitros de solução salina. Continue administrando ampicilina a cada 12 horas durante 36 horas e colete os corações nos pontos temporais desejados. Primeiro, retire o coração.Imobilize o camundongo eutanasiado em posição supina sobre uma plataforma cirúrgica e pulverize o tórax com etanol 70%, secando em seguida. Usando tesoura e pinça cirúrgicas, abra a cavidade torácica. Remova a caixa torácica e seccione o diafragma para expor o coração e os pulmões.Em seguida, corte os vasos sanguíneos conectados ao coração e use pin&ccedil;as para excisar suavemente o coração sem causar contus&otilde;es. Lave o coração com PBS e coloque-o em uma cassete de coleta de esp&eacute;cime tecidual para seccionamento coronal. Em seguida, transfira as cassetes para solu&ccedil;&atilde;o de formalina tamponada a 10% e, no dia seguinte, encaminhe para inclus&atilde;o em parafina.Em estágios iniciais, as lesões cardíacas podem ser identificadas pela alteração na aparência da cor e, em alguns casos, pela presença de células imunes. Em lesões avançadas, as células imunes estarão ausentes e serão encontradas lesões semelhantes a VA em seu lugar.Utilizando uma seção cardíaca de cinco mícrons em lâminas de vidro com carga positiva, congele primeiro as seções, depois descongele-as e deixe secar ao ar. Fixe as lâminas em formalina tamponada neutra a 10% por 10 minutos a 25 graus Celsius. Em seguida, remova o fixador com três lavagens com PBS, durante cinco minutos cada lavagem.Em seguida, permeabilize o tecido com Triton X-100 0,2% em PBS por 15 minutos. Remova o detergente com mais três lavagens em PBS puro. Em seguida, bloqueie o tecido com soro normal a 10% em PBS por uma hora após uma lavagem em PBS, cubra o corte com antissoro por duas horas a 37 graus Celsius.Trate os controles negativos com antissoro de coelho ingênuo. Como o tecido cardíaco absorve prontamente a coloração imunofluorescente XI, levando a níveis elevados de fundo, a concentração e o tempo de incubação para diferentes tipos de anticorpos provavelmente precisarão ser otimizados. Duas horas depois, lave o antissoro com PBS. Em seguida, substitua a solução por um anticorpo secundário e deixe as lâminas incubarem a 37 graus Celsius por 30 minutos. Agora, aplique DPI a cinco miligramas por mililitro e lave as lâminas com PBS.Por fim, monte as lâminas em bálsamo, salve e visualize-as por microscopia confocal. Comece removendo a parafina e hidratando as seções de tecido. Utilize lavagens com xilol seguidas por uma série graduada de lavagens com álcool.Em seguida, banhe os cortes em ácido fosfomolíbdico 0,2% por cinco minutos, seguido de uma lavagem com água por cinco minutos; depois, corar com vermelho de sirius a 0,1% e ácido pícrico por duas horas. Em seguida, lave os cortes em ácido clorídrico 0,01 N por três minutos e enxágue-os em etanol 70% por um minuto. Agora, desidrate os cortes invertendo a série de banhos alcoólicos graduados, seguido de lavagens com xilol, monte para microscopia de luz e avalie as lâminas.Camundongos desenvolveram doença pneumocócica invasiva após desafio com o tigre. Foram observadas quatro microlesões cardíacas na região dos ventrículos, e um aumento no tamanho e número de lesões foi notado entre 24 e 30 horas pós-infecção para confirmar que S. pneumoniae estava realmente presente nas lesões. Secções foram coradas para o polissacarídeo capsular do sorotipo quatro produzido pelo Tigre quatro.Isso confirmou a presença de agregados densos e fortemente compactados nos sítios de microlesão. A coloração com vermelho piro sirius foi realizada em cortes cardíacos de camundongos que haviam sido resgatados com ampicilina e controles não infectados. Nos resgates.Houve um aumento acentuado na presença e intensidade da coloração com bandas provenientes do que parecem ser locais anteriores de lesão nos ventrículos. Ao tentar realizar este procedimento, é importante lembrar-se de infectar os camundongos com uma quantidade suficiente de S. pneumoniae para permitir que a infecção prossiga por pelo menos 28 a 30 horas, de modo que a bacteriemia e as microlesões cardíacas tenham tempo suficiente para se formar.

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JoVE Journal

Medicine

Medicina

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Fonte: Brown, A. O., e Orihuela, C. J. Visualização de Streptococcus pneumoniae em Microlesões Cardíacas e Remodelação Cardíaca Subsequente. J. Vis. Exp. (2015)O vídeo demonstra a imunocoloração de seções de tecido cardíaco de camundongos fixadas quimicamente para visualizar bactérias patogênicas localizadas em microlesões induzidas por infecção. O processo inclui lavagem de tecidos, permeabilização de membranas, bloqueio de sítios inespecíficos, marcação de anticorpos, contracoloração nuclear...

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