Name: Tumor primário e isolamento de células MEF para o Estudo de metástases pulmonares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Aprenda a preparar células primárias de tumores mamários em camundongos transgênicos e isolar fibroblastos embrionários para estudar metástases pulmonares em modelos de câncer de mama.

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Gostaríamos de agradecer ao NIH, LACaTS e à fundação clínica Ochsner pelo apoio financeiro.

Todos os experimentos foram realizados em ratos de acordo com protocolos aprovados pelo Animal Care Institucional e Comissões de Uso (IACUC) da LSU School of Medicine. Todos os instrumentos devem ser autoclavados antes da dissecção. 1. Preparação de células primárias de tumores de mama mouse <ol><li> Use um modelo de camundongo que foi geneticamente modificada com o mouse mamária Tumor poliomavï¿½us Oriente T-Antigen (mouse MMTV-PyMT-transgênica), que se desenvolvem espontaneamente tumores como descrito anteriormente 6. </li><li> Sacrificar os ratinhos com isoflurano (99,9%) e pulverizar etanol 75% para assegurar um ambiente estéril (Figura 1A). </li><li> Abra a pele a partir da área do orifício uretral para o pescoço com uma tesoura. Pin a pele para baixo para permitir fácil acesso aos órgãos (Figura 1B). </li><li> Isolar o tumor da mama mamária frio e lava-se com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) (pH 7,4) (Figura 1C). </li><li> Transferência do tumor auma placa de cultura de 10 centímetros de tecido estéril e cortá-la com uma lâmina de barbear estéril e tesoura para aproximadamente 1 mm3 peças. Os passos subsequentes devem ser realizados numa câmara de fluxo laminar estéril. </li><li> Incubar o tecido tumoral picada com colagenase dissolvido em meio DMEM isento de soro com uma concentração final de 1 mg / ml num agitador rotativo durante 2 horas a 37 ° C. Centrifugar a suspensão do tecido do tumor durante 3 min a 200 x g. NOTA: A incubação da colagenase é essencial para a dissociação enzimática do tecido. </li><li> Descartar o sobrenadante e lavar o precipitado três vezes com PBS (pH 7,4) por centrifugação durante 3 minutos a 200 x g. Após a lavagem final, decanta-se o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o tecido com 2 ml de EDTA de tripsina durante 5 min a 37 ° C, enquanto de nutação. Centrifugar a suspensão durante 3 minutos a 200 xg e repetir as lavagens. </li><li> Ressuspender o sedimento de tecido em meio de crescimento normal (DMEM, FBS a 10%, 2X pen / strep) numa placa de 10 centímetros. Mudançaa mídia todos os dias para os próximos 3 dias. Células de cultura de células até que o número desejado é obtido. NOTA: Aproximadamente 1x10 7 células serão isoladas a partir deste procedimento. Outros modelos tumorigénese mamário de ratinho, tal como MMTV-neu, dar menor rendimento de células quando comparado com MMTV-PyMT. Quando utilizando modelos que produzem um rendimento inferior, é benéfico para começar com um maior células tumorais e de cultura mais longos. </li></ol> 2. Rato Lung Extração de Visualize Lung Metástase <ol><li> Antes da extração do pulmão, do fígado e remover o diafragma. Desalojar as costelas sem perturbar os pulmões. </li><li> Com um par de tesouras finas, abrir a parte superior da traqueia, que está mais perto da veia jugular. </li><li> Usando um catéter, injectar um agente, tal como 1 ml de Z-fix ou Índia tinta através da traqueia para encher os pulmões (Figura 2A). Incorporar o Z-fix Pulmões em parafina. </li><li> De-manchar os pulmões injetados com nanquim em solução de Fekete(100 ml de álcool a 70%, 10 mL de formalina a 10% tamponada, e 5 ml de ácido acético glacial), durante 5 min. Definir nódulos tumorais em locais secundários com um ≥ 0,5 mm de diâmetro, determinar os nódulos como metástase. NOTA: Devido ao bloqueio brônquios e bronquíolos pelo tumor, nódulos tumorais não pode absorver 15% da tinta da Índia, e, assim, tecido pulmonar normal será em preto e nódulos tumorais será na cor branca 7. Isto irá permitir a visualização de nódulos tumorais individuais (Figura 2B). </li></ol> 3. Preparar mouse embrionárias fibroblastos (MEFs) a partir de embriões de camundongos <ol><li> Sacrifício camundongos grávidas com isoflurano (99,9%) e spray de etanol de 75% para garantir um ambiente estéril. </li><li> Abra a pele a partir da área do orifício uretral para o pescoço com uma tesoura e isolar os embriões do útero. </li><li> Tenha cuidado para não perturbar os embriões ao abrir a pele. </li><li> Remova os cornos uterinos e enxaguá-los em ste friorile PBS (pH 7,4). </li><li> Separa-se a partir de embriões placenta sua muito cuidadosamente e embriões lugar numa placa de 10 centímetros contendo PBS gelado (pH 7,4). </li><li> Remover a cabeça, fígado e intestino a partir do embrião e colocar a parte restante em uma placa de cultura de tecidos de 12 poços contendo PBS (pH 7,4). </li><li> Transferir o corpo do embrião para uma outra placa de 12 poços contendo EDTA de tripsina e cortados em pedaços pequenos (~ 1 mm3) utilizando uma lâmina de barbear esterilizada e tesoura. Incubar o material cortado com 5 ml de EDTA de tripsina durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Inactivar a tripsina por adição de 1 ml de Soro Fetal Bovino (FBS) para os embriões picados. Centrifugar a suspensão a 200 xg velocidade durante 10 minutos, remover o sobrenadante cuidadosamente, ressuspender o sedimento com 1 ml de meio DMEM morno e transferir todo o conteúdo para um prato de 10 centímetros contendo 10 ml de DMEM (com 20% de FBS e 2X de Penicilina / Estreptomicina ). </li><li> Mudar a forma todos os dias durante dois dias. Cultura das células até célula desejadanúmero é alcançado. </li></ol>

<ol><li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Natur%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).</li>
<li>Poste, G., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Natur%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of cancer metastasis.</a> Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).</li>
<li>Wan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Metastasis+Moving+New+Biological+Insights+into+the+Clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic.</a> Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).</li>
<li>Bergers, G., Benjamin, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenesis+and+the+angiogenic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumorigenesis and the angiogenic switch.</a> Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).</li>
<li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mouse+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Maximizing mouse cancer models.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).</li>
<li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene%3A+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).</li>
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<li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Re%22%5BJournal%5D)">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Re. 8 (4), 212(2006).</li>
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</ol>

Os autores não têm divulgações.

Este protocolo é para isolar células primárias de um tumor fresco mouse. Os lisados ​​preparados a partir de este método são úteis para a proteína, ADN e análise de ARN. As células cancerosas de tumor da mama primário frequentemente metastizar para o cérebro, pulmão e osso 1. Inclui-se uma técnica para extrair o pulmão para a detecção de metástases. A coloração do pulmão com uma mancha de tinta vai permitir a visualização dos nódulos tumorais como pode ser visto na Figura 2B. Que fixa os pulm...

A metástase é a etapa final na progressão do câncer de mama 1. Envolve uma série de etapas nas quais as células malignas são liberadas do tumor primário e disseminadas para outros órgãos 2. As células devem ser capazes de intravasar, sobreviver em circulação, extravasar para órgãos distantes e sobreviver nesse novo sistema de órgãos 3. Cada etapa da tumorigênese é rigidamente controlada pelas células por meio de várias alterações genéticas e epigenéticas 4. Para estudar os mecanismos da tumorigênese do câncer de mama, sistemas de modelos de camundongos têm sido utilizados devido à sua curta vida útil, tamanho pequeno e rápido tempo de reprodução. Algumas das principais vantagens do uso de modelos de camundongos na pesquisa do câncer são as semelhanças moleculares e fisiológicas que eles compartilham com os humanos 5. 
Linhagens celulares estabelecidas de camundongos e humanos têm sido amplamente utilizadas na pesquisa do câncer de mama. Embora possamos obter algumas informações sobre as etapas da metástase usando essas células, modelos animais geneticamente manipulados com supressores de tumor / oncogenes fornecerão muito mais informações sobre o desenvolvimento do tumor e metástase a partir do estágio embrionário. Assim, com esses modelos de camundongos, podemos obter regulação genética e de desenvolvimento do crescimento tumoral. Além disso, o microambiente tumoral também desempenha um papel importante na expressão gênica das células tumorais e pode ser difícil mimetizar o mesmo cenário com estudos usando linhagens celulares estabelecidas. Os tumores mamários humanos primários também podem ser usados para estudar a tumorigênese mamária de camundongos. A principal desvantagem do uso de tumores de mama isolados é que esse tumor recém-implantado não possui a vasculatura e o tecido linfático do camundongo. Já os sistemas de modelo genético de camundongos para estudar a tumorigênese mamária nos permitirão monitorar as etapas da metástase, analisar o microambiente tumoral e acessar todo o corpo 5.
O objetivo geral deste protocolo é estudar a tumorigênese mamária em camundongos. Sabe-se que os cânceres de mama geralmente metastatizam para o cérebro, pulmão e osso. Este protocolo permite o isolamento de células tumorais mamárias primárias, bem como o estudo da metástase do câncer de mama para o pulmão. Além disso, outro protocolo para análise de fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) do embrião de camundongo está incluído. Juntas, essas técnicas são úteis no estudo da tumorigênese mamária de camundongos.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td>Armazenar em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Tecnologias de vida</td><td>25300-062</td><td>Armazene em &ndash; 20 & deg; C</td></tr><tr><td>Colagenase Tipo IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>Loja em &ndash; 20 &deg; C</td></tr><tr><td>Hialuronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>Loja em &ndash; 20 &deg; </td></tr><tr><td>C Pen Strep</td><td>Life&nbsp; technologies</td><td>15140-122</td><td>Loja a 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td>Armazene em &ndash; 80 &deg; C</td></tr><tr><td>Z-fix</td><td>ANATECH</td><td>#174</td><td>Store na RT</td></tr><tr><td>India Ink</td><td>Yasutomo</td><td></td><td>Store na RT</td></tr><tr><td>AERRANE (Isoflurano)</td><td>Baxter</td><td>NDC 10019-773-60</td><td>Store na RT</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>EMD</td><td>AX0441-3</td><td>Store na RT</td></tr></tbody></table>

tumor primário e isolamento de células mef para o estudo de metástases pulmonares

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

Na tumorigênese mamária, o estágio metastático da doença representa a maior ameaça para o indivíduo afetado. Células mamárias normais com genótipos alterados agora possuem a capacidade de invadir e sobreviver em outros tecidos. Neste protocolo, os tumores mamários de camundongos são removidos e as células primárias são preparadas a partir dos tumores. As células isoladas deste procedimento estão então disponíveis para experimentos de perfil genético. Para uma metástase bem-sucedida, essas células devem ser capazes de intravasar, sobreviver em circulação, extravasar para órgãos distantes e sobreviver nesse novo sistema de órgãos. Os pulmões são o alvo típico da metástase do câncer de mama. Foi descoberto um conjunto de genes que medeia a seletividade da metástase para o pulmão. Aqui descrevemos um método de estudo de metástase pulmonar a partir de um modelo de camundongo geneticamente modificado. Além disso, outro protocolo para análise de fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) do embrião de camundongo está incluído. As células MEF do mesmo tipo animal fornecem uma pista da expressão gênica de células não cancerígenas. Juntas, essas técnicas são úteis no estudo da tumorigênese mamária de camundongos, seus mecanismos de sinalização associados e vias das anormalidades em embriões.

A fase de progressão do tumor em que a sacrificar o animal depende do estudo particular e orientações IACUC. Na Figura 1A, um velho C57BL / 6 do mouse 100 dias com o mouse mamária Tumor poliomavï¿½us Oriente T-Antigen (MMTV-PyMT) foi sacrificado em três meses. A pele foi aberta a partir da área do orifício uretral para o pescoço com as tesouras e a pele foi fixado para baixo para permitir o fácil acesso a órgãos como mostrado na Figura 1B. Isto permitiu um fácil acesso ao tumor que foi ...

O objetivo deste protocolo é estudar a tumorigênese mamária. Com esta técnica, os tumores mamários de camundongos são removidos e as células primárias são preparadas a partir dos tumores. Um protocolo de extração pulmonar está incluído para estudar metástases pulmonares. Além disso, outro protocolo para análise de fibroblastos embrionários de camundongo do embrião de camundongo está incluído.

Tumor primário e isolamento de células MEF para o Estudo de metástases pulmonares

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar a oncogênese tumoral de câncer de mama em camundongos. Primeiro, demonstra-se o preparo de células primárias a partir de tumores mamários de camundongos. Em seguida, apresenta-se como extrair o pulmão do camundongo para visualizar metástases pulmonares.Por fim, é apresentada a preparação de fibroblastos embrionários de camundongo a partir de embriões de camundongo, já que esses métodos demonstram que camundongos transgênicos para o antígeno T médio do poliomavírus do vírus do tumor mamário de camundongo podem ser utilizados para investigar a oncogênese do câncer de mama. Embora este método possa fornecer informações sobre o câncer de mama, ele também pode ser aplicado à investigação de outros tumores sólidos. A demonstração visual deste método é fundamental, pois é importante isolar apenas os tumores e nenhum outro tecido durante as etapas de dissociação tumoral. Comece utilizando uma tesoura para abrir a pele desde a abertura uretral até o pescoço de um camundongo transgênico para o antígeno T médio do poliomavírus do vírus do tumor mamário de camundongo.Em seguida, fixe a pele e isole o tumor mamário. Lave o tumor in situ com PBS frio e coloque o tumor em uma placa estéril de cultura de tecidos de 10 centímetros. A seguir, transfira a placa para uma câmara de fluxo laminar estéril e use uma lâmina de barbear estéril e uma tesoura para cortar o tumor em pedaços de um milímetro cúbico.Incube os fragmentos com colagenase em um agitador a 37 graus Celsius. Após duas horas, centrifugue a suspensão resultante de tecido tumoral. Lave o pellet mais três vezes em PBS Resus, ressuspendendo o pellet em dois mililitros de tripsina EDTA após a última lavagem durante cinco minutos a 37 graus Celsius com agitação.Em seguida, lave as células mais três vezes e re-suspenda-as em meio de crescimento normal. Por fim, incube as células em uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros, trocando o meio diariamente durante os próximos três dias até obter o número desejado de células. Antes de extrair o pulmão, remova o fígado e o diafragma e solte as costelas.Em seguida, abra a parte superior da traqueia, próxima à veia jugular, e use um cateter para injetar o agente apropriado através da traqueia para preencher os pulmões, remova os pulmões e, em seguida, se estiver usando Z fix, incorpore o tecido em parafina. Se estiver usando tinta nanquim, mantenha o tecido na solução inec por cinco minutos; o tecido pulmonar normal aparecerá com coloração preta, enquanto os nódulos tumorais aparecerão brancos. Classifique como metástases quaisquer nódulos tumorais visualizados em sítios secundários com diâmetro maior ou igual a 0,5 milímetros para gerar fibroblastos embrionários de camundongo.Primeiro, abra a pele de um camundongo grávido da abertura uretral até o pescoço, conforme acabou de ser demonstrado, tomando cuidado para não perturbar os embriões. Em seguida, remova os cornos uterinos e lave-os em PBS estéril. Depois, separe cuidadosamente os embriões da placenta, um por vez.Coloque cada embrião em uma placa de cultura de 10 centímetros contendo PBS gelado. Após remover a cabeça, o fígado e o intestino, lave a porção restante do embrião em um poço de uma placa de cultura de tecidos de 12 poços contendo PBS e corte o corpo em pedaços de um milímetro cúbico. Transfira para outro poço contendo cinco mililitros de tripsina-EDTA e incube o tecido a 37 graus Celsius.Após cinco minutos, adicione um mililitro de SBF para inativar a digestão. Em seguida, centrifugue a suspensão celular resultante e ressuspenda o pellet. Em um mililitro de DMEM aquecido, transfira finalmente as células para uma placa de cultura de 10 centímetros contendo 10 mililitros de DMEM suplementado com antibióticos e cultive as células até obter o número desejado de células.O estágio de progressão tumoral no qual o animal deve ser sacrificado depende do estudo específico e das diretrizes do I-A-C-U-C. Por exemplo, este camundongo FVB de 100 dias de idade, portador do vírus do tumor mamário murino com antígeno T médio do poliomavírus, foi sacrificado três meses após o isolamento de um tumor, conforme demonstrado no exemplo de mama de camundongo. Foram obtidas células tumorais primárias.Como muitos genes mediam a metástase do câncer de mama para o pulmão, os pulmões também foram extraídos, conforme acabou de ser demonstrado, para estudar o processo metastático. Em seguida, os pulmões foram inflados com Z fix e corados com tinta nanquim para visualizar os nódulos tumorais. Aqui, são mostrados fibroblastos de embriões de camundongo, isolados de embriões de camundongos da linhagem FVB.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células tumorais primárias de camundongo e fibroblastos embrionários de camundongo, bem como extrair o pulmão de camundongo. Não se esqueça de que trabalhar com flúor ISO pode ser extremamente perigoso, exigindo precauções rigorosas, como o uso de capela química de classe F, que deve estar sempre ligada enquanto você realiza este procedimento.

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Considerações práticas em estudar a colonização de pulmão metastático em osteossarcoma usando o ensaio de metástase pulmonar

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Este artigo tem como objetivo fornecer um protocolo para o isolamento e cultura de fibroblastos primários associados ao câncer a partir de um modelo de murina síngênica de câncer de mama triplo-negativo e sua aplicação para o estudo pré-clínico de novas nanopartículas projetadas para atingir o microambiente tumoral.

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