Tumor primário e isolamento de células MEF para o Estudo de metástases pulmonares

O objetivo geral deste procedimento é estudar a oncogênese tumoral de câncer de mama em camundongos. Primeiro, demonstra-se o preparo de células primárias a partir de tumores mamários de camundongos. Em seguida, apresenta-se como extrair o pulmão do camundongo para visualizar metástases pulmonares.

Por fim, é apresentada a preparação de fibroblastos embrionários de camundongo a partir de embriões de camundongo, já que esses métodos demonstram que camundongos transgênicos para o antígeno T médio do poliomavírus do vírus do tumor mamário de camundongo podem ser utilizados para investigar a oncogênese do câncer de mama. Embora este método possa fornecer informações sobre o câncer de mama, ele também pode ser aplicado à investigação de outros tumores sólidos. A demonstração visual deste método é fundamental, pois é importante isolar apenas os tumores e nenhum outro tecido durante as etapas de dissociação tumoral. Comece utilizando uma tesoura para abrir a pele desde a abertura uretral até o pescoço de um camundongo transgênico para o antígeno T médio do poliomavírus do vírus do tumor mamário de camundongo.

Em seguida, fixe a pele e isole o tumor mamário. Lave o tumor in situ com PBS frio e coloque o tumor em uma placa estéril de cultura de tecidos de 10 centímetros. A seguir, transfira a placa para uma câmara de fluxo laminar estéril e use uma lâmina de barbear estéril e uma tesoura para cortar o tumor em pedaços de um milímetro cúbico.

Incube os fragmentos com colagenase em um agitador a 37 graus Celsius. Após duas horas, centrifugue a suspensão resultante de tecido tumoral. Lave o pellet mais três vezes em PBS Resus, ressuspendendo o pellet em dois mililitros de tripsina EDTA após a última lavagem durante cinco minutos a 37 graus Celsius com agitação.

Em seguida, lave as células mais três vezes e re-suspenda-as em meio de crescimento normal. Por fim, incube as células em uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros, trocando o meio diariamente durante os próximos três dias até obter o número desejado de células. Antes de extrair o pulmão, remova o fígado e o diafragma e solte as costelas.

Em seguida, abra a parte superior da traqueia, próxima à veia jugular, e use um cateter para injetar o agente apropriado através da traqueia para preencher os pulmões, remova os pulmões e, em seguida, se estiver usando Z fix, incorpore o tecido em parafina. Se estiver usando tinta nanquim, mantenha o tecido na solução inec por cinco minutos; o tecido pulmonar normal aparecerá com coloração preta, enquanto os nódulos tumorais aparecerão brancos. Classifique como metástases quaisquer nódulos tumorais visualizados em sítios secundários com diâmetro maior ou igual a 0,5 milímetros para gerar fibroblastos embrionários de camundongo.

Primeiro, abra a pele de um camundongo grávido da abertura uretral até o pescoço, conforme acabou de ser demonstrado, tomando cuidado para não perturbar os embriões. Em seguida, remova os cornos uterinos e lave-os em PBS estéril. Depois, separe cuidadosamente os embriões da placenta, um por vez.

Coloque cada embrião em uma placa de cultura de 10 centímetros contendo PBS gelado. Após remover a cabeça, o fígado e o intestino, lave a porção restante do embrião em um poço de uma placa de cultura de tecidos de 12 poços contendo PBS e corte o corpo em pedaços de um milímetro cúbico. Transfira para outro poço contendo cinco mililitros de tripsina-EDTA e incube o tecido a 37 graus Celsius.

Após cinco minutos, adicione um mililitro de SBF para inativar a digestão. Em seguida, centrifugue a suspensão celular resultante e ressuspenda o pellet. Em um mililitro de DMEM aquecido, transfira finalmente as células para uma placa de cultura de 10 centímetros contendo 10 mililitros de DMEM suplementado com antibióticos e cultive as células até obter o número desejado de células.

O estágio de progressão tumoral no qual o animal deve ser sacrificado depende do estudo específico e das diretrizes do I-A-C-U-C. Por exemplo, este camundongo FVB de 100 dias de idade, portador do vírus do tumor mamário murino com antígeno T médio do poliomavírus, foi sacrificado três meses após o isolamento de um tumor, conforme demonstrado no exemplo de mama de camundongo. Foram obtidas células tumorais primárias.

Como muitos genes mediam a metástase do câncer de mama para o pulmão, os pulmões também foram extraídos, conforme acabou de ser demonstrado, para estudar o processo metastático. Em seguida, os pulmões foram inflados com Z fix e corados com tinta nanquim para visualizar os nódulos tumorais. Aqui, são mostrados fibroblastos de embriões de camundongo, isolados de embriões de camundongos da linhagem FVB.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células tumorais primárias de camundongo e fibroblastos embrionários de camundongo, bem como extrair o pulmão de camundongo. Não se esqueça de que trabalhar com flúor ISO pode ser extremamente perigoso, exigindo precauções rigorosas, como o uso de capela química de classe F, que deve estar sempre ligada enquanto você realiza este procedimento.