Reforçada Análise Genética de solteiro biopartículas Humanos recuperado por Simplificado micromanipulação de Forensic Evidence 'Toque DNA'

O objetivo geral deste procedimento é recuperar células individuais ou aglomeradas denominadas biopartículas putativas de evidências de DNA de toque forense e obter um perfil de DNA do doador. Durante a prática de um crime violento, um pequeno número de células é transferido de um indivíduo para outro, como quando um agressor agarra o pulso de uma vítima. Para recuperar o pequeno número de células primeiro, use um filme de gel de baixa adesão preso a uma lâmina de microscópio para amostrar a área de contato.

O segundo passo é corar as partículas biológicas transferidas para facilitar a visualização ao microscópio. Em seguida, isole as biopartículas do filme de gel usando micromanipulação. Colete o adesivo solúvel em água na ponta de uma agulha de tungstênio e use-o para remover partículas biológicas de interesse da superfície do filme de gel.

A etapa final é transferir cuidadosamente as biopartículas coletadas individualmente para uma mistura de amplificação de PCR na parte inferior de Uma coleção de PCR para, em última análise, métodos de tipagem de DNA aprimorados são usados para obter um perfil de DNA do doador de vestígios de DNA. Ok, no meu laboratório, nos concentramos na análise genética do pequeno número de células que são transferidas durante a prática de um crime violento contra a pessoa entre um indivíduo e outro indivíduo, ou entre um indivíduo e um objeto. Os métodos tradicionais muitas vezes não conseguem recuperar o perfil de DNA de um número tão pequeno de células.

Aqui desenvolvemos um método simplificado para a recuperação física e análise genética de um número tão pequeno de células, sejam células individuais ou aglomerados de células que podem ser incorporados em qualquer laboratório forense. Demonstrando o procedimento estará Katie Fairish, uma estudante de pós-graduação em meu laboratório. Para iniciar este procedimento, prepare o filme de gel que será usado para coletar biopartículas.

Corte o filme de gel no tamanho desejado apropriado para a lâmina de microscópio de vidro que está sendo usada como suporte sólido. Por exemplo, para uma lâmina de vidro de três polegadas por uma polegada, use o tamanho do filme de gel de duas polegadas por 0,75 polegadas. Remova o suporte branco do filme de gel e prenda o filme de gel na lâmina do microscópio, pressionando firmemente para garantir uma fixação completa.

Observe que há uma camada protetora superior transparente que não deve ser removida para permitir que a pressão seja aplicada ao longo do pedaço de filme de gel sem contaminar a superfície do filme de gel preparada com a camada protetora anexada pode ser armazenada em temperatura ambiente até que seja necessária. Quando estiver pronto para usar o filme de gel, use uma pinça estéril para remover a camada protetora superior transparente. Coloque a superfície do filme de gel em contato direto com um objeto ou superfície tocada desejada.

Por exemplo, pele humana do pulso. Aplique uma pequena quantidade de pressão para garantir a transferência eficiente de biopartículas para o filme de gel. Não aplique muita pressão porque a lâmina de vidro pode quebrar várias amostras do mesmo objeto ou superfície podem ser coletadas no mesmo pedaço de filme de gel Da mesma maneira, as partículas biológicas podem ser coletadas de objetos e itens de vestuário, como o colarinho de uma camisa.

Para confirmar a transferência de biopartículas para o filme de gel, examine a lâmina em um microscópio estéreo usando iluminação trans ou epi. Uma ampliação de aproximadamente 20 x é melhor para visualizar áreas maiores do filme de gel, enquanto uma ampliação de aproximadamente 200 x é melhor para visualizar partículas biológicas individuais. Armazene a lâmina de amostra de filme de gel em temperatura ambiente em uma caixa de lâminas coberta.

Até que estejam prontas para coloração e/ou coleta de biopartículas, as biopartículas podem ser coradas para ajudar na visualização. Para conseguir isso, primeiro coloque a lâmina de amostra de filme de gel preparada conforme mostrado anteriormente em um suporte de coloração deslizante sobre uma pia. Usando uma pipeta de transferência descartável, cubra toda a superfície do filme de gel com a coloração azul trian e incube em temperatura ambiente por um a dois minutos.

Remova o excesso de mancha inclinando a corrediça para permitir que a mancha escorra para a pia, se necessário. A lâmina pode ser enxaguada por inundação suave com água estéril usando uma pipeta de transferência descartável. Depois que a lâmina for arejada e seca, visualize-a usando um microscópio estéreo para garantir a coloração adequada.

A lâmina manchada pode ser armazenada à temperatura ambiente em uma caixa de lâminas coberta. Comece este procedimento colocando o número apropriado de tubos de PCR de 0.2 mililitro em um rack e rotulando os tubos adequadamente. Prepare um volume apropriado de mistura de amplificação STR para o número desejado de amostras.

O vórtice e o mestre se misturam bem e centrifugam brevemente em um caminho PI de mini centrífuga. 3,5 microlitros de amplificação. Misture em cada tubo de 0,2 mililitro e cubra cada tubo frouxamente.

Coloque um pedaço de fita adesiva dupla face diretamente em um bloco de vidro. Isso será usado para manter o tubo de 0,2 mililitro no lugar durante a coleta da amostra. Coloque outro pedaço de fita adesiva dupla face em uma lâmina de microscópio de vidro limpa.

Em seguida, coloque um pedaço de fita adesiva ondulada solúvel em água em cima da fita adesiva dupla face. Prenda a fita na posição aplicando pressão ao longo do comprimento da fita. A camada branca superior protetora pode então ser removida.

Em seguida, coloque o primeiro tubo de 0,2 mililitro na fita adesiva dupla face No bloco de vidro. Deixe este tubo de lado até que a amostra seja coletada. Coloque a lâmina de fita soldado de onda solúvel em água sob o microscópio enquanto visualiza em uma ampliação baixa.

Use a ponta de uma agulha de suporte de língua para raspar suavemente a superfície da fita para coletar a pequena quantidade ou bola de adesivo na ponta da agulha. O tamanho da bola de adesivo dependerá do número de biopartículas a serem coletadas com cuidado. Remova as línguas.

Coloque a agulha com adesivo sob o microscópio sem mexer na ponta da agulha. Coloque a agulha em um rack, se necessário. O aspecto mais crítico do procedimento é a coleta e a transferência das biopartículas.

Para garantir o sucesso, as técnicas devem ser praticadas até que o analista seja proficiente nelas. Coloque uma amostra de filme de gel previamente preparada no microscópio stage usando um bloco de vidro para apoiar a lâmina. Ajuste o foco e a ampliação até que as partículas biológicas possam ser facilmente visualizadas.

Identifique as biopartículas que serão coletadas. Recupere a agulha de tungstênio com a bola adesiva e coloque a agulha sobre a superfície do filme de gel onde as partículas biológicas de interesse estão localizadas. Pressione a ponta da agulha para baixo para que fique em contato com a biopartícula.

Levante a agulha para garantir que a biopartícula foi coletada. Repita este processo até que o número desejado de biopartículas seja coletado. Coloque um tubo de PCR de 0,2 mililitro preparado no microscópio stage.

Ajuste a ampliação para que a parte inferior do tubo que contém a mixagem de amplificação fique em foco. Durante a visualização através do microscópio, insira cuidadosamente a agulha de tungstênio no tubo de PCR de 0,2 mililitro até que a ponta da agulha esteja na mistura de amplificação. Segure a agulha na mistura de amplificação até que o adesivo se dissolva e a liberação de biopartículas na solução seja observada.

Remova a agulha. Coloque o tubo de 0,2 mililitro na vertical e tampe-o frouxamente. Limpe a agulha de tungstênio com um pano pré-umedecido com álcool e repita este procedimento de coleta para amostras adicionais.

Para iniciar o protocolo de amplificação aprimorado para o perfil STR autossômico das biopartículas coletadas, adicione 1,5 microlitros de tampão de lise a cada tubo de 0,2 mililitro contendo a mistura de amplificação e as biopartículas fecham bem as tampas dos tubos. Coloque as amostras no termociclador e amplifique as amostras usando as condições de ciclagem descritas no texto do protocolo Quando a amplificação estiver concluída. Armazene os produtos de amplificação a quatro graus Celsius até que estejam prontos para detecção por eletroforese capilar.

Não são mostradas imagens representativas de biopartículas individuais em uma amostra de colarinho de camisa. As biopartículas coletadas são circuladas. Círculos vermelhos indicam que um perfil foi recuperado.

A porcentagem de recuperação do alelo está incluída. Círculos pretos indicam que um perfil não foi recuperado. Da mesma forma, essas imagens são de biopartículas agrupadas em uma amostra de colarinho de camisa mostrada aqui é o perfil STR obtido de uma das amostras individuais de biopartículas do colarinho da camisa.

Sua precisão foi determinada por comparação com um perfil de referência. Os números dos alelos são designados abaixo de cada pico em cada locus. O eixo x representa o tamanho do fragmento e o eixo Y representa a intensidade do sinal.

Este perfil é de alta qualidade, com alturas de pico interlocus razoavelmente equilibradas e sem abandono alélico. Este próximo perfil é um perfil STR completo obtido de uma das amostras de biopartículas agrupadas da gola da camisa. Por fim, esta figura mostra um exemplo de perfil de DNA malsucedido de uma única biopartícula com uma recuperação de 3% do alelo.

Este método deve promover a recuperação de perfis de DNA de fonte única de agressores em casos de agressão física. Não escapou à nossa atenção que este método também remove alguns dos problemas associados à interpretação e deconvolução de perfis mistos de DNA.