Name: Infecção bacteriana sistêmica e Imune Defesa Phenotypes em Drosophila melanogaster (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprenda a induzir infecções bacterianas em Drosophila melanogaster usando nano injetor ou alfinete séptico. Este método permite quantificar a carga bacteriana sistêmica e medir a expressão de genes de peptídeos antibacterianos para estudar a imunidade inata.

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Gostaríamos de agradecer a todo o laboratório Lazzaro, e especialmente a Susan Rottschaefer, por sua ajuda na revisão e teste desses protocolos. Este é um produto de sua experiência cumulativa. O trabalho no laboratório Lazzaro é apoiado por bolsas R01 AI083932 e R01 AI064950 dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA.

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Nenhum dos autores tem interesses conflitantes ou conflitantes.

O procedimento descrito aqui produz infecção rigorosa e de alta qualidade de Drosophila melanogaster. Os exemplos ilustrados focado principalmente na infecção com Providencia rettgeri e E. coli, mas o protocolo é extremamente adaptável e pode ser aplicada a diversas infecções com bactérias ao longo de um intervalo de condições de criação de acolhimento e de manutenção. Os detalhes de uma abordagem experimental óptimo dependerá da bactéria utilizada para a infecção, o genótipo do hospedeiro e as condições experimentais gerais. É altamente recomendável para teste piloto quaisquer novas condições experimentais antes de iniciar projetos mais ambiciosos. Um bom ponto de partida é testar três doses de infecção ao longo de um intervalo de 100 vezes. Altamente patógenos virulentos são muitas vezes melhor introduzido em doses infecciosas muito baixos, na ordem de 10-100 células bacterianas por mosca. Agentes patogénicos mais moderadas podem ser injectados com doses mais elevadas de cerca de 1.000 bactérias por FLY, e não-patogénicos pode ser injectado em doses tão elevadas como 10.000 bactérias por mosca. Muitas vezes, é instrutivo para definir a cinética de infecções novas, acompanhando carga de patógenos, a mortalidade de acolhimento, e atividade do sistema imunológico através de uma série de tempo longitudinal. Como medida de carga de patógenos e de expressão génica do hospedeiro são ensaios destrutivos, é necessário infectar moscas distintas no início da experiência para cada ponto de tempo que é para ser medida. Ao decidir se quer usar ou picada de agulha de injeção baseada microcapilar, é importante notar que há vantagens e limitações de cada abordagem. Injecção capilar apresenta um volume de líquido para dentro da mosca, que tanto aumenta modestamente a pressão de turgescência e introduz sais ou outras moléculas que estão suspensos ou dissolvidos no veículo. Injeção capilar também exige o acesso a uma instalação de injecção ou compra do equipamento necessário. Alfinetada fossa séptica não requer nenhum equipamento especial e introduzmídia negligenciáveis ​​na mosca, e é normalmente mais eficiente para infectar um grande número de moscas. No entanto, as infecções pinprick não permitem o controlo preciso sobre a dose de infecção que pode ser conseguido com injecção capilar. O presente protocolo focada em um aparelho de injecção que regula mecanicamente volume de injecção, mas também são baseados em sistemas de injecção de pulsos discretos de ar pressurizado. 20,21 Estes são tipicamente mais caro do que o aparelho apresentado aqui e requerem calibração do impulso de ar para cada agulha, a fim de assegurar o volume de injecção consistente. Há um debate considerável, mas muito poucos dados sobre como se tornar sistemicamente moscas infectadas com a bactéria em estado selvagem. Alguns investigadores postulam que a maioria das infecções naturais ocorrem quando Drosophila ingerir bactérias patogénicas e as bactérias são capazes de escapar posteriormente do intestino para estabelecer uma infecção sistémica. No entanto, existem muito few bactérias conhecidas como sendo capazes de atravessar o intestino de D. melanogaster, e aqueles que têm essa capacidade são altamente letal para moscas 22,23. Uma teoria alternativa é que voa regularmente sustentar os ferimentos cuticulares através de fuga de tentativas fracassadas de predação ou o ataque de ácaros ectoparasitas. Esta hipótese é apoiada pela coleta frequente de D. selvagem melanogaster tendo pontos melanização que são indicativos de feridas cicatrizadas (observações não publicadas). Os ácaros foram mostrados para transmitir infecções bacterianas em Drosophila 24 e feridas deixadas por ácaros pode ser secundariamente infectadas por bactérias em abelhas de mel 25. No entanto, a freqüência na natureza da infecção do ácaro-driven ou de outra forma oportunista de D. melanogaster através de violações de cutícula não é conhecido. O protocolo descrito aqui permite introdução de bactérias diretamente na hemolinfa através de injeção quantitativo que ignora quaisquer barreiras epiteliais ou IMMU comportamentaisnidade. Métodos para a alimentação de bactérias patogénicas para D. melanogaster têm sido descritos em Vodovar et al. 22 e Nehme et ai. 23. Muitas bactérias entomopatogênicos representam pouco ou nenhum risco a saúde humana, permitindo aos pesquisadores para trabalhar com eles confortavelmente. Além disso, muito poucas bactérias têm a capacidade de infectar de Drosophila em contacto sem intervenção experimental, de modo que o risco de &quot;epidemia&quot; propagação da infecção bacteriana através de um laboratório através de superfícies contaminadas ou escapou moscas é geralmente muito baixa. No entanto, é aconselhável para assegurar que as medidas de contenção adequados estão no lugar para evitar moscas infectadas de escapar e para recapturar qualquer escapou moscas. O laboratório deve ser equipado com um nível de segurança biológica comensurável com a dos agentes patogénicos que está sendo utilizado, e melhores práticas padrão em microbiologia deve ser empregue. O infecti experimentalno método descrito aqui permite infecções de Drosophila melanogaster com qualquer dose de qualquer bactéria arbitrária. Uma vez que a infecção tenha sido estabelecido, é simples para medir a cinética de proliferação bacteriana ou recarga, para acompanhar a mortalidade hospedeiro, e a ensaio de indução do sistema imunitário do hospedeiro. Moscas infectadas podem facilmente ser submetido a outros ensaios fenotípicos, incluindo testes de funções fisiológicas que podem moldar ou ser moldados pela infecção. Os procedimentos descritos são baratos, requerem relativamente pouco equipamento especializado, e são facilmente aprendido, tornando-os propícios para o uso em diversos projetos através de uma amplitude de laboratórios de pesquisa e de ensino.

A mosca da fruta Drosophila melanogaster é um dos organismos modelo premier para estudar a função e evolução de defesa imunológica. Drosophila são baratos e fáceis de criar, são altamente passíveis de manipulação experimental, e são apoiados por uma extensa comunidade científica que desenvolveu uma ampla conjunto de ferramentas de pesquisa. Muitos aspectos da imunidade inata são conservadas entre insectos e mamíferos, incluindo a transdução de sinal mediada por receptores Toll-like e NF-kB, factores de transcrição da família de sinalização de JAK / STAT, e as respostas das vias JNK. 1,2 A função destes genes e vias lata ser consultado em D. melanogaster usando mutações ou RNAi knockdowns que as actividades de aumento ou diminuição da via. 3 - 6 Além disso, Drosophila pode ser usado para estudar as conseqüências fisiológicas de infecções e doenças, incluindo no contexto da teoria da história de vida evolutiva 7.- 9 Todos esses estudos, no entanto, depender da capacidade de infectar de forma fiável moscas experimentais sob condições de tratamento definidos. O procedimento aqui descrito apresenta um quadro metodológico para a entrega de infecções bacterianas robustos e repetíveis para Drosophila melanogaster e, posteriormente, medindo a gravidade da infecção e quantificar a resposta imune do hospedeiro. Drosophila pode ser natural e experimentalmente infectados por uma grande variedade de parasitas e organismos patogénicos, incluindo bactérias, fungos, vírus, nematóides e vespas parasitóides. O protocolo atual está focada no fornecimento infecção bacteriana sistêmica. Muitas bactérias diferentes podem ser usados ​​para infectar as moscas, e escolha do experimentador deve basear-se nas questões científicas precisas ser perguntado. Por exemplo, isolados clínicos humanos podem ser utilizados para estudar os mecanismos de virulência da bactéria 10, ou ecologicamente isolados relevantes podem ser preferred para o estudo evolutivo 11. Algumas bactérias são patógenos competentes do D. melanogaster, proliferando em cima de infecção e causando doença host ou morte. Outras bactérias são efectivamente controlado pelo sistema imunitário do hospedeiro e aclarado em poucos dias. Nesta demonstração, Providencia rettgeri vai ser utilizado como um agente patogénico proliferativa que pode causar mortalidade hospedeiro e persiste em sobreviventes hospedeiros. Escherichia coli vai ser utilizado como um agente patogénico que não é eliminado pelo sistema imunitário do hospedeiro. Infecção será estabelecido pela introdução de bactérias directamente para dentro da cavidade do corpo da mosca. Esta abordagem ignora barreiras epiteliais e comportamentos de proteção, permitindo a investigação de infecção sistêmica, independentemente do modo natural de transmissão. Existem dois métodos principais para estabelecer experimentalmente infecção sistêmica. Na primeira, uma nanoinjector capilares de vidro e puxado agulhas são utilizadas para injectar um número exacto debactérias na mosca. Este método tem a vantagem de permitir uma grande gama dinâmica de doses de infecção e de ser quantitativamente altamente repetível. A segunda abordagem é a de proporcionar a infecção com uma picada de agulha séptico. Esta abordagem tem as vantagens de ser rápida e não necessitando de equipamento especial. Uma vez estabelecidas as infecções, torna-se possível medir a carga sistêmica do patógeno, a mortalidade de acolhimento, e atividade do sistema imunológico induzível. É claro, qualquer número de fenótipos adicionais podem concebivelmente ser medidos em D. infectada melanogaster, incluindo pós-infecção fecundidade 12, capacidade de aprendizagem 13, estado metabólico 14, ou virtualmente qualquer outro traço que pode ser imaginado.

<table><tbody><tr><td>Incubadora</td><td>Powers Scientific, Inc</td><td>DROS52SD</td><td></td></tr><tr><td>Pincel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 FlyPads</td><td>FlyStuff</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Airgas</td><td>CD FG50</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de criação de Drosophila&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Garrafas de fundo quadrado de 6 oz, polipropileno</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>Nosterile Bolas de Algodão Extra Grandes</td><td>Fisher marca</td><td>Microscópio 22-456-882</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de Drosophila poliestireno</td><td>VWR international</td><td>89092-720</td><td></td></tr><tr><td>Nosterile Large Cotton Balls</td><td>Fisher brand</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>Balão de 2 L</td><td>VWR international</td><td>89000-370</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri com tampas transparentes, cume elevado; 100 x 15 mm;</td><td>VWR international</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller</td><td>Difco</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Innoculing Loop</td><td>VWR international</td><td>80094-488</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Clasic Rainin em vários tamanhos 0.1 &micro; l a 2 &micro; l, 2 &micro; l a 20 &micro; l, 20 &micro; l a 200 &micro; l, 100 &micro; l a 1.000 &micro; l</td><td>Rainin</td><td>PR-2 PR-20 PR-200 PR-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de micropipeta (tamanhos variados)</td><td>VWR international</td><td>30128-376 53503-810 16466-008</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth Base, Miller</td><td>Difco</td><td>241420</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultura descartáveis Vidro de borossilicato</td><td>VWR international</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>S-500 Orbital Agitador</td><td>VWR international</td><td>14005-830</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>VWR international</td><td>37001-300</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 10X</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 Espectrofotômetro</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetes de Semimicrovolume</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9955</td><td></td></tr><tr><td>Extrator Capilar Vertical</td><td>Agulha Kopf Extrator de Pipetas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5'' Capilares de vidro de substituição para Nanojet II</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Óleo Mineral, Branco,</td><td>claro Macron Pinos Fine Chemicals</td><td>6358-10</td><td></td></tr><tr><td>Minutein</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml&nbsp; Tubos de microcentrífuga; Selo Rito</td><td>EUA Scientific Inc.</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>pilão motorizado; Agitador de Laboratório Talboys</td><td>Troemner</td><td>103</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de Alto Rendimento Talboys</td><td>OPS Diagnostics</td><td>930145</td><td></td></tr><tr><td>5/32'' Bolas de Moagem</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 156-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Genie Scientific indurstries inc.</td>Pipetador Multicanal <td>G560</td><td></td></tr><tr><td>(10 &mu; l - 300 &mu; l)</td> <td>Sartorius</td><td>730360</td><td></td></tr><tr><td>WASP2 Whitley Automated Spiral Plater</td><td>Microbiology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProtoCOL contador de colônias automatizado / contador de pratos/ leitor de pratos&nbsp;</td><td>Microbiology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>tubos qPCR; Tiras de 8 tubos de baixo perfil de 0,2 ml</td><td>Bio-Rad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>tampas de qPCR; Tiras Ópticas Planas de 8 Tampas</td><td>Bio-Rad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 DNase Livre de RNase</td><td>Promega</td><td>m610a</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Transcriptase Reversa</td><td>Promega</td><td>m170b</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1240</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; SsoAdvanced SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5260</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Sistema de Detecção de PCR em Tempo Real</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5200</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Ribonuclease Inibidor</td><td>Promega</td><td>N2115</td><td></td></tr></tbody></table>

infecção bacteriana sistêmica e imune defesa phenotypes em<em&gt; drosophila melanogaster</em

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

A mosca da fruta Drosophila melanogaster é um dos organismos modelo premier para estudar a função e evolução de defesa imunológica. Muitos aspectos da imunidade inata são conservadas entre insectos e mamíferos, e uma vez que a Drosophila pode ser facilmente manipulado geneticamente e experimentalmente, que são poderosos para estudar a função do sistema imunitário e as consequências fisiológicas da doença. O processo demonstrado aqui permite a infecção de moscas através da introdução de bactérias directamente na cavidade do corpo, contornando barreiras epiteliais e formas mais passivas de defesa e permitindo que o foco sobre a infecção sistémica. O procedimento inclui protocolos para medir as taxas de mortalidade de acolhimento, carga patógeno sistémica, e grau de indução do sistema imunitário do hospedeiro. Este procedimento de infecção é barato, robusto e quantitativamente reprodutível, e pode ser utilizado em estudos de genética funcional, história de vida evolucionária, e fisiologia.

Esta secção ilustra os resultados que podem ser obtidos após a infecção bacteriana de Drosophila melanogaster. A Figura 1 mostra que a dose de infecção varia com a densidade óptica da suspensão bacteriana utilizada para a injecção, e que a dose administrada pode ser estimado de forma fiável por homogeneização e revestimento voa imediatamente após a injecção . Tal como ilustrado na Figura 2, diferentes agentes patogénicos podem causar diferentes níveis de mortalidade de acolhimento (Figura 2A) e de mortalidade hospedeira pode ser (Figura 2B), dependente da dose. Importante, este protocolo permite que diferentes tipos de infecções a atingir: Providencia rettgeri pode causar uma infecção crónica, sub-letal que persiste durante 20 dias ou mais (Figura 3A). No entanto, outras bactérias como Escerichia coli vai ser maioritariamente apuradas pela mosca acolhimento no prazo de seis horas após a infecção (Figura 3B). A indução dos sys imunesTEM pode ser estimado através do isolamento de ARN e subsequente qRT-PCR de transcritos de péptidos antibacterianos (Figura 4A e B). De forma análoga, mas menos quantitativamente, moscas expressando GFP sob o controlo de promotores de gene de um péptido antimicrobiano pode ser utilizado para visualizar a indução do sistema imunitário (Figura 4C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig1.jpg" /> . Figura 1: Determinação Dose Infecciosa Moscas foram injectados com 50 nl de suspensões bacterianas que cobrem uma gama de densidades ópticas (,0001-,05). As moscas foram imediatamente homogeneizados e plaqueados para determinar o número de bactérias introduzidas por injecção. A carga bacteriana inicial se correlaciona fortemente com o OD inicial injectado (r 2 = 0,96) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2:. A sobrevida após injeção com bacterianas Pathogens Cinco a sete dias homens de idade foram injectados com 50 nl de qualquer suspensão bacteriana ou meios estéreis e monitorados para a sobrevivência. (A), as moscas de tipo selvagem foram injetados com aproximadamente 5.000 bactérias a partir de uma das três espécies diferentes. A taxa de mortalidade do hospedeiro depende fortemente das espécies bacterianas utilizadas para a infecção. (B) Tipo Selvagem moscas foram injectados com três doses diferentes de Enterococcous faecalis - 50, 500, e 5.000 bactérias por mosca. Moscas morrem mais rapidamente quando infectados com doses superiores infecciosas (C) Um mutante sistema imunológico e sua linha de controle isogênica de tipo selvagem foram injetados com aproximadamente 500 Burkholderia cepacia. Uma comparação aos pares de Log-Rank mostra que o de tipo selvagem mosca sobrevive à infecção significativamente melhor do que o mutante (χ 2 = 59,02, df = 1, p &lt;0,0001). Figura 3:. A carga bacteriana após injeção moscas foram injectados com aproximadamente (a) 5000 P. rettgeri (B) 3400 E. coli. A carga bacteriana foi determinada imediatamente após a injecção e em vários pontos de tempo subsequentes. Cada ponto de dados representa a carga bacteriana de uma única mosca. E. coli é rapidamente eliminado do anfitriões desafiados enquanto P. rettgeri persistir para o resto da vida do hospedeiro ,. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig4.jpg" /> Figura 4: Indução de Expressão Gênica imune após a injeção. (A) As moscas foram injectados com 50 nl de P. PBS rettgeri ou estéril tanto no abdómen ou tórax, ou foram deixados de lado unmanipulated de CO <sub&gt; 2 anestesia. Seis horas após a infecção, as moscas foram recolhidas para isolamento de ARN e a expressão do Diptericin Um gene foi determinada por meio de qRT-PCR. (A) Os níveis de expressão são representados graficamente como a razão entre Diptericin A transcrição de rp49 transcrição e dimensionado de tal modo que o controlo de CO 2 é definida como possuindo um nível de expressão 1. As barras representam a média e o erro padrão de rácios de cada condição (n = 4). Níveis (B) de expressão são representadas graficamente como um ΔΔCT 2 com o valor de C T média de CO 2 aesthesia moscas de controle usados ​​como a condição não induzida padrão. As barras representam o erro médio e padrão da ΔΔC T a partir de cada condição (n = 4). Embora não exista uma diferença na indução da transcrição devido ao local de injecção, a comparação dos painéis A e B mostra como o método ΔΔC T pode potencialmente sobrestimar os níveis de indução. (C) Moscas que expressa GFP sob o controle do promotor Diptericin A foram injectados com 50 nl de P. rettgeri (OD = 0,1) e em seguida trabalhada 7 dias mais tarde. O painel GFP mostra a expressão de GFP no corpo de gordura abdominal de moscas infectadas, indicando ativação do Diptericin Um promotor em moscas infectadas por bactérias, mas não controles injecção de mídia. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Gene </td><td> Para a frente </td><td> Reversa </td></tr><tr><td> rp49 (também chamado rpL32) </td><td> 5 &#39;AGGCCCAAGATCGTGAAGAA 3&#39; </td><td> 5 &#39;GACGCACTCTGTTGTCGATACC 3&#39; </td></tr><tr><td> A Diptericin </td><td> 5 &#39;GCGGCGATGGTTTTGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;CGCTGGTCCACACCTTCTG 3&#39; </td></tr><tr><td> Drosomycin </td><td> 5 &#39;CTGCCTGTCCGGAAGATACAA 3 &#39; </td><td> 5 &#39;TCCCTCCTCCTTGCACACA 3&#39; </td></tr><tr><td> Defensina </td><td> 5 &#39;GAGGATCATGTCCTGGTGCAT 3&#39; </td><td> 5 &#39;TCGCTTCTGGCGGCTATG 3&#39; </td></tr><tr><td> A atacina </td><td> 5 &#39;CGTTTGGATCTGACCAAGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;AAAGTTCCGCCAGGTGTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Metchnikowan </td><td> 5 &#39;AACTTAATCTTGGAGCGATTTTTCTG 3&#39; </td><td> 5 &#39;ACGGCCTCGTATCGAAAATG 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Iniciadores de qRT-PCR.

Drosophila melanogaster é um excelente organismo modelo para estudar o sistema imunológico inato e as consequências fisiológicas de infecções e doenças. Este protocolo descreve como fornecer infecções bacterianas robustas e quantitativamente repetíveis a D. melanogaster e como medir subsequentemente a gravidade da infecção e quantificar a resposta imune do hospedeiro.

Infecção bacteriana sistêmica e Imune Defesa Phenotypes em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer infecções bacterianas robustas e repetíveis para drosófila, melanogaster e, em seguida, medir a gravidade da infecção e quantificar a resposta imune do hospedeiro. Isso é feito primeiro entregando a infecção bacteriana nas moscas usando um nano injetor. A pós-mortalidade pode ser rastreada após a infecção ao longo do tempo, e a carga bacteriana sistêmica pode ser determinada a qualquer momento, homogeneizando as moscas infectadas e medindo o número de bactérias presentes.A defesa imunológica do hospedeiro também pode ser quantificada medindo o nível de expressão de genes peptídicos antibacterianos, em última análise, quantificando e caracterizando a infecção bacteriana. Na drosófila, o melanogaster pode ser usado para testar como fatores genéticos e ambientais alteram a competência imunológica da mosca. Este método pode ser usado para abordar questões-chave no campo da imunidade a insetos, como como os fatores genéticos e ambientais do hospedeiro influenciam a capacidade imunológica ou como bactérias distintas variam em sua infecção Cinética, Embora estejamos usando este método para medir a defesa imunológica da drosophila melanogaster contra a infecção bacteriana, ele também pode ser aplicado a outros insetos e pode fazer uso de outros tipos de patógenos, como vírus ou fungos.Um problema comum que as pessoas experimentam quando aprendem esse método pela primeira vez é que elas podem causar muitos ferimentos às moscas, o que pode resultar em mortalidade excessivamente alta, mesmo em controles. A demonstração visual desse método é fundamental para aprender a fazer a infecção com o mínimo de danos à mosca. Como nossa espécie hospedeira oph melanogaster é tão pequena, a infecção deve ser feita ao microscópio, o que aumenta a complexidade inicial da técnica.No entanto, acreditamos que uma pequena demonstração da técnica a tornará acessível até mesmo a cientistas que têm experiência limitada com moscas. Para iniciar o experimento, selecione uma única colônia de uma placa mestra previamente preparada e inocule um frasco de meio estéril. Cultive a bactéria durante a noite a 37 graus Celsius até a fase estacionária.Quando a cultura atingir a fase estacionária, pelete suavemente as células de 600 microlitros da cultura em uma centrífuga de mesa por três minutos a 5.000 vezes. G, então descarte o Rena e o Resus. Suspenda as bactérias em 1000 microlitros de solução salina tamponada com fosfato estéril ou PBS.Em seguida, dilua as células ressuspensas em PBS estéril para atingir a absorbância desejada de 600 nanômetros e use essa suspensão para infectar as moscas. Prepare uma agulha de vidro puxando um capilar de vidro de silicato emprestado e use uma pinça para quebrar a ponta da agulha para criar uma abertura de 50 micrômetros de diâmetro. Em seguida, coloque o O-ring do teto e o espaçador branco com a grande covinha voltada para fora no êmbolo de metal do injetor.Encha a agulha de vidro com óleo mineral usando uma seringa com uma agulha de calibre 30. Em seguida, coloque a agulha de vidro cheia através da pinça e coloque o anel de vedação maior em torno de sua base a um milímetro da extremidade romba da agulha. Deslize a agulha no êmbolo de metal e aperte suavemente a pinça até que esteja segura.Dissipe o óleo mineral do injetor, deixando um pequeno volume de óleo na agulha para atuar como uma barreira entre o injetor e a suspensão bacteriana. Certifique-se de que não haja bolhas de ar dentro do óleo mineral, suspensão bacteriana ou entre os dois líquidos. Em seguida, ajuste o injetor para o volume desejado para injeção.Insira cuidadosamente a ponta da agulha capilar em um tubo de PBS estéril e pressione o botão de enchimento no injetor para encher a agulha injetora para gerar controles de ferimento. Injete moscas anestesiadas com PBS estéril no abdômen anterior na superfície lateral ventral, coloque as moscas injetadas em frascos novos com novos meios e coloque os frascos de lado para evitar que as moscas grudem na comida antes de se recuperarem da anestesia. Em seguida, ejete o meio estéril restante do injetor e reabasteça a mesma agulha com a suspensão bacteriana.Repita o procedimento e injete as moscas com a suspensão bacteriana. Alternativamente, a infecção pode ser transmitida por uma picada séptica. Para preparar o pino infectante, derreta a extremidade de uma ponta de micropipeta de 200 microlitros e insira um pino de mnuchin de inseto de 0,15 milímetro no plástico fundido.Deixe o plástico solidificar para que o pino seja mantido no lugar com 0,5 centímetros de pino estendendo-se do plástico, anestesiar as moscas com dióxido de carbono e picar as moscas na placa pleural esternal do tórax com a agulha, evitando os locais de fixação das asas e das pernas. Remova as moscas do pino de minúcia usando uma pinça macia. Certifique-se de mergulhar o pino na suspensão bacteriana entre picar cada mosca.Coloque as moscas picadas em um frasco novo com novo meio de mosca, colocando o frasco de lado até que todas as moscas tenham se recuperado da anestesia. Coloque um subconjunto das moscas infectadas em tubos de microcentrífuga individuais no gelo. Adicione 250 microlitros de PBS a cada tubo e use um pilão para homogeneizar as moscas.Em seguida, coloque o homogeneizado em um aerado LB usando um prato em espiral. Alternativamente, para chapear o homogeneizado por diluição serial. Transfira cada homogeneizado de mosca para a primeira linha de um 96.Poço e encha cada poço das fileiras restantes com 90 microlitros de PBS usando uma pipeta multicanal. Pegue 10 microlitros da primeira fileira contendo homogenato de mosca e dispense o homogeneizado na segunda fileira. Canalize para cima e para baixo pelo menos 10 vezes para misturar bem o homogeneizado.Em seguida, pegue 10 microlitros do homogeneizado e transfira-o para a próxima linha. Repita este procedimento usando as linhas restantes a partir da linha inferior. Use a pipeta multicanal para retirar 10 microlitros de cada poço e depositá-los em uma placa LB.Certifique-se de que as amostras sejam dispensadas como pontos discretos que não se toquem. Repita esta etapa até que todos os alvéolos tenham sido amostrados de cada linha, dispensando-os em ordem decrescente de diluição na placa LB. Qualquer que seja o método de revestimento usado, tome cuidado para não crescer demais nas placas para que as colônias permaneçam pequenas e discretas.Remova a placa da incubadora. Uma vez que as bactérias experimentais tenham crescido colônias visíveis, mas antes das colônias da drosófila, a microbiota intestinal torna-se visível aproximadamente 24 horas depois para as placas espirais. Conte as colônias que crescem usando um contador de colônias automatizado que pode estimar a carga bacteriana por mililitro de homogeneizado com base no número e na posição das colônias na placa.Para placas pontuais, conte manualmente as colônias para cada mosca de qualquer diluição que contenha 30 a 300 colônias e calcule o número de bactérias por mililitro de homogeneizado original. As moscas foram injetadas com 50 nanolitros de suspensões bacterianas cobrindo uma variedade de densidades ópticas e a dose de infecção imediatamente homogeneizada e plaqueada varia com a densidade óptica da suspensão bacteriana usada para injeção. As cargas bacterianas iniciais se correlacionam fortemente com a DO inicial injetada.Este protocolo permite a observação de diferentes tipos de infecções. As moscas foram infectadas com providencia rei, que pode causar uma infecção subletal crônica que persiste por 20 dias ou mais. As moscas infectadas com coli eliminam a infecção em seis horas. Pós-infecção.A indução do sistema imunológico pode ser estimada por meio do isolamento de RNA e subsequente Q rtpcr R do transcrito do peptídeo antibacteriano de forma análoga, mas de forma menos quantitativa as moscas que expressam GFP sob o controle do peptídeo antimicrobiano. Os promotores de genes podem ser usados para visualizar a indução do sistema imunológico Uma vez dominado. Essa técnica pode permitir a infecção de centenas de moscas por hora.Qualquer número de fenótipos pode ser medido nas moscas depois de infectadas, incluindo capacidade de aprendizado de fity, estado metabólico ou praticamente qualquer outra característica que possa ser imaginada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como administrar infecções bacterianas robustas e repetíveis a drosófilas, melanogaster e como medir subsequentemente a gravidade da infecção e quantificar a resposta imune do hospedeiro. Não se esqueça de que certas bactérias podem representar riscos à saúde humana.Certifique-se de que os procedimentos de biossegurança adequados sejam seguidos e que medidas de contenção adequadas estejam em vigor para evitar que as moscas infectadas escapem. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

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Immunology and Infection

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Este vídeo demonstra uma técnica para infectar Drosophila introduzindo uma bactéria patogênica diretamente em sua cavidade corporal. Este método contorna as barreiras epiteliais e outros mecanismos de defesa passiva, permitindo a indução de infecção sistêmica. Após a infecção, a resposta imune resultante é avaliada monitorando a mortalidade por moscas e realizando ensaios a jusante.

Uma técnica de picada séptica para introduzir infecção bacteriana sistêmica em moscas

Neste vídeo, demonstramos uma técnica para medir a carga bacteriana de E. coli após a injeção de E. coli no tórax de Drosophila melanogaster.

Medindo a carga bacteriana de E. coli em Drosophila melanogaster após infecção por E. coli

Um método para a criação de Drosophila melanogaster sob condições axénicas e gnotobióticos é apresentada. embriões voam são dechorionated em hipoclorito de sódio, transferidos assepticamente à dieta estéril, e criados em recipientes fechados. Inoculando dieta e embriões com bactérias leva a associações gnotobióticos e presença de bactérias é confirmada por plaqueamento de corpo inteiro de Drosophila homogeneizados.

Elevando a mosca da fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sob axênicas e gnotobióticos Condições

Este método demonstra como visualizar a invasão do patógeno em células de inseto com modelos tridimensionais (3D). Hemócitos de larvas de Drosophila foram infectados com patógenos virais ou bacterianos, ou ex vivo ou no vivo. Hemócitos infectados foram, em seguida, fixa e manchados para a imagem latente com um microscópio confocal e subsequente reconstrução celular 3D.

Extração de hemócitos de larvas de Drosophila melanogaster para infecção microbiana e análise

Este protocolo descreve métodos para oralmente expor e infectar a mosca de fruta Drosophila melanogaster com patógenos bacterianos e para medir o número de bactérias infecciosas galpão após infecção do intestino. Ainda mais, descrevemos o efeito de mutantes imunes na mosca sobrevivência após infecção bacteriana oral.

Infecção bacteriana e oral Shedding em Drosophila melanogaster.

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Avaliar a resposta imune celular de mosca da fruta, Drosophila melanogaster, usando um ensaio de fagocitose em Vivo

Este protocolo descreve um ensaio in vivo da fagocitose utilizado para avaliar e quantificar a capacidade dos hemócitos de melanogaster de Drosophila jovens e envelhecidos para bactérias fagocitose..

Avaliando a Habilidade Fagocítica Específica da Idade dos Hemócitos de Melanogaster Drosophila Adulto usando um Ensaio de Faagocitose In Vivo

As moscas adultas de Drosophila melanogaster têm sido amplamente utilizadas como organismos modelo para investigar os mecanismos moleculares subjacentes às respostas imunes inatas antimicrobianas e estratégias de infecção microbiana. Para promover o estágio da larva D. melanogaster como um sistema modelo adicional ou alternativo, uma técnica de injeção larval é descrita.

Melanogaster drosophila Protocolo de injeção de larvas

Aprenda a induzir infecções bacterianas em Drosophila melanogaster usando nano injetor ou alfinete séptico. Este método permite quantificar a carga bacteriana sistêmica e medir a expressão de genes de peptídeos antibacterianos para estudar a imunidade inata.

Infecção bacteriana sistêmica e Imune Defesa Phenotypes em

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