Infecção bacteriana sistêmica e Imune Defesa Phenotypes em

O objetivo geral deste procedimento é fornecer infecções bacterianas robustas e repetíveis para drosófila, melanogaster e, em seguida, medir a gravidade da infecção e quantificar a resposta imune do hospedeiro. Isso é feito primeiro entregando a infecção bacteriana nas moscas usando um nano injetor. A pós-mortalidade pode ser rastreada após a infecção ao longo do tempo, e a carga bacteriana sistêmica pode ser determinada a qualquer momento, homogeneizando as moscas infectadas e medindo o número de bactérias presentes.

A defesa imunológica do hospedeiro também pode ser quantificada medindo o nível de expressão de genes peptídicos antibacterianos, em última análise, quantificando e caracterizando a infecção bacteriana. Na drosófila, o melanogaster pode ser usado para testar como fatores genéticos e ambientais alteram a competência imunológica da mosca. Este método pode ser usado para abordar questões-chave no campo da imunidade a insetos, como como os fatores genéticos e ambientais do hospedeiro influenciam a capacidade imunológica ou como bactérias distintas variam em sua infecção Cinética, Embora estejamos usando este método para medir a defesa imunológica da drosophila melanogaster contra a infecção bacteriana, ele também pode ser aplicado a outros insetos e pode fazer uso de outros tipos de patógenos, como vírus ou fungos.

Um problema comum que as pessoas experimentam quando aprendem esse método pela primeira vez é que elas podem causar muitos ferimentos às moscas, o que pode resultar em mortalidade excessivamente alta, mesmo em controles. A demonstração visual desse método é fundamental para aprender a fazer a infecção com o mínimo de danos à mosca. Como nossa espécie hospedeira oph melanogaster é tão pequena, a infecção deve ser feita ao microscópio, o que aumenta a complexidade inicial da técnica.

No entanto, acreditamos que uma pequena demonstração da técnica a tornará acessível até mesmo a cientistas que têm experiência limitada com moscas. Para iniciar o experimento, selecione uma única colônia de uma placa mestra previamente preparada e inocule um frasco de meio estéril. Cultive a bactéria durante a noite a 37 graus Celsius até a fase estacionária.

Quando a cultura atingir a fase estacionária, pelete suavemente as células de 600 microlitros da cultura em uma centrífuga de mesa por três minutos a 5.000 vezes. G, então descarte o Rena e o Resus. Suspenda as bactérias em 1000 microlitros de solução salina tamponada com fosfato estéril ou PBS.

Em seguida, dilua as células ressuspensas em PBS estéril para atingir a absorbância desejada de 600 nanômetros e use essa suspensão para infectar as moscas. Prepare uma agulha de vidro puxando um capilar de vidro de silicato emprestado e use uma pinça para quebrar a ponta da agulha para criar uma abertura de 50 micrômetros de diâmetro. Em seguida, coloque o O-ring do teto e o espaçador branco com a grande covinha voltada para fora no êmbolo de metal do injetor.

Encha a agulha de vidro com óleo mineral usando uma seringa com uma agulha de calibre 30. Em seguida, coloque a agulha de vidro cheia através da pinça e coloque o anel de vedação maior em torno de sua base a um milímetro da extremidade romba da agulha. Deslize a agulha no êmbolo de metal e aperte suavemente a pinça até que esteja segura.

Dissipe o óleo mineral do injetor, deixando um pequeno volume de óleo na agulha para atuar como uma barreira entre o injetor e a suspensão bacteriana. Certifique-se de que não haja bolhas de ar dentro do óleo mineral, suspensão bacteriana ou entre os dois líquidos. Em seguida, ajuste o injetor para o volume desejado para injeção.

Insira cuidadosamente a ponta da agulha capilar em um tubo de PBS estéril e pressione o botão de enchimento no injetor para encher a agulha injetora para gerar controles de ferimento. Injete moscas anestesiadas com PBS estéril no abdômen anterior na superfície lateral ventral, coloque as moscas injetadas em frascos novos com novos meios e coloque os frascos de lado para evitar que as moscas grudem na comida antes de se recuperarem da anestesia. Em seguida, ejete o meio estéril restante do injetor e reabasteça a mesma agulha com a suspensão bacteriana.

Repita o procedimento e injete as moscas com a suspensão bacteriana. Alternativamente, a infecção pode ser transmitida por uma picada séptica. Para preparar o pino infectante, derreta a extremidade de uma ponta de micropipeta de 200 microlitros e insira um pino de mnuchin de inseto de 0,15 milímetro no plástico fundido.

Deixe o plástico solidificar para que o pino seja mantido no lugar com 0,5 centímetros de pino estendendo-se do plástico, anestesiar as moscas com dióxido de carbono e picar as moscas na placa pleural esternal do tórax com a agulha, evitando os locais de fixação das asas e das pernas. Remova as moscas do pino de minúcia usando uma pinça macia. Certifique-se de mergulhar o pino na suspensão bacteriana entre picar cada mosca.

Coloque as moscas picadas em um frasco novo com novo meio de mosca, colocando o frasco de lado até que todas as moscas tenham se recuperado da anestesia. Coloque um subconjunto das moscas infectadas em tubos de microcentrífuga individuais no gelo. Adicione 250 microlitros de PBS a cada tubo e use um pilão para homogeneizar as moscas.

Em seguida, coloque o homogeneizado em um aerado LB usando um prato em espiral. Alternativamente, para chapear o homogeneizado por diluição serial. Transfira cada homogeneizado de mosca para a primeira linha de um 96.

Poço e encha cada poço das fileiras restantes com 90 microlitros de PBS usando uma pipeta multicanal. Pegue 10 microlitros da primeira fileira contendo homogenato de mosca e dispense o homogeneizado na segunda fileira. Canalize para cima e para baixo pelo menos 10 vezes para misturar bem o homogeneizado.

Em seguida, pegue 10 microlitros do homogeneizado e transfira-o para a próxima linha. Repita este procedimento usando as linhas restantes a partir da linha inferior. Use a pipeta multicanal para retirar 10 microlitros de cada poço e depositá-los em uma placa LB.

Certifique-se de que as amostras sejam dispensadas como pontos discretos que não se toquem. Repita esta etapa até que todos os alvéolos tenham sido amostrados de cada linha, dispensando-os em ordem decrescente de diluição na placa LB. Qualquer que seja o método de revestimento usado, tome cuidado para não crescer demais nas placas para que as colônias permaneçam pequenas e discretas.

Remova a placa da incubadora. Uma vez que as bactérias experimentais tenham crescido colônias visíveis, mas antes das colônias da drosófila, a microbiota intestinal torna-se visível aproximadamente 24 horas depois para as placas espirais. Conte as colônias que crescem usando um contador de colônias automatizado que pode estimar a carga bacteriana por mililitro de homogeneizado com base no número e na posição das colônias na placa.

Para placas pontuais, conte manualmente as colônias para cada mosca de qualquer diluição que contenha 30 a 300 colônias e calcule o número de bactérias por mililitro de homogeneizado original. As moscas foram injetadas com 50 nanolitros de suspensões bacterianas cobrindo uma variedade de densidades ópticas e a dose de infecção imediatamente homogeneizada e plaqueada varia com a densidade óptica da suspensão bacteriana usada para injeção. As cargas bacterianas iniciais se correlacionam fortemente com a DO inicial injetada.

Este protocolo permite a observação de diferentes tipos de infecções. As moscas foram infectadas com providencia rei, que pode causar uma infecção subletal crônica que persiste por 20 dias ou mais. As moscas infectadas com coli eliminam a infecção em seis horas. Pós-infecção.

A indução do sistema imunológico pode ser estimada por meio do isolamento de RNA e subsequente Q rtpcr R do transcrito do peptídeo antibacteriano de forma análoga, mas de forma menos quantitativa as moscas que expressam GFP sob o controle do peptídeo antimicrobiano. Os promotores de genes podem ser usados para visualizar a indução do sistema imunológico Uma vez dominado. Essa técnica pode permitir a infecção de centenas de moscas por hora.

Qualquer número de fenótipos pode ser medido nas moscas depois de infectadas, incluindo capacidade de aprendizado de fity, estado metabólico ou praticamente qualquer outra característica que possa ser imaginada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como administrar infecções bacterianas robustas e repetíveis a drosófilas, melanogaster e como medir subsequentemente a gravidade da infecção e quantificar a resposta imune do hospedeiro. Não se esqueça de que certas bactérias podem representar riscos à saúde humana.

Certifique-se de que os procedimentos de biossegurança adequados sejam seguidos e que medidas de contenção adequadas estejam em vigor para evitar que as moscas infectadas escapem. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.