Manchas de sangue seco - preparação e processamento para uso em imunoensaios e em técnicas moleculares

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um protocolo padronizado para preparar e processar manchas de sangue seco para serem posteriormente usadas em imunoensaios e em técnicas moleculares. Isso é feito primeiro pegando sangue capilar e transferindo-o para um cartão de filtro. O segundo passo é secar manchas de sangue durante a noite e obter punções de seis milímetros dos círculos do cartão do filtro.

Em seguida, o sangue seco dos punções é obtido por imersão em tampão em um agitador por um mínimo de quatro horas. As EITs hemolíticas são então liberadas de detritos por centrifugação. A etapa final é analisar os EITs liberados para marcadores sorológicos e moleculares de infecções pelos vírus da hepatite B, hepatite C e imunodeficiência humana por imunoensaios e técnicas moleculares disponíveis comercialmente.

A ideia de usar o enredo coletado em um cartão de filtro feito de celular surgiu há um século. No entanto, as pessoas que usam esse método pela primeira vez muitas vezes lutam até hoje porque toda a fase pré-analítica, que compreende a preparação e o processamento de manchas de sangue seco para sua análise final, não foi padronizada para quase todas as aplicações de testes de manchas de sangue seco. Dado esse pano de fundo, sugerimos um protocolo passo a passo padronizado abrangente para a preparação e processamento de manchas de sangue seco a serem posteriormente usadas em ensaios imunológicos e técnicas moleculares.

A demonstração visual dessa metodologia parece ser crucial, pois várias etapas, como a retirada do sangue capilar. Está correto. A transferência para os cartões de filtro ou a preparação de socos apropriados da multidão não são fáceis de aprender e, consequentemente, os indivíduos que estão usando a técnica pela primeira vez, sem dúvida, se beneficiarão da representação visual.

O sangue capilar será retirado do dedo de Nico por um técnico do nosso laboratório demonstrando o procedimento de processamento. As manchas de sangue obtidas serão pelo técnico ko, que já trabalha há muitos anos em nosso laboratório de diagnóstico biológico molecular para punção cutânea. Primeiro coloque um par de luvas de borracha de látex descartáveis.

Antes da punção da pele, o paciente deve aquecer as mãos. O dedo é massageado muito para enriquecer o fluxo sanguíneo em direção ao local da punção superior. Em seguida, limpe a pele do lado Palmer da ponta, falange distal do terceiro ou quarto dedo da mão que não escreve com um desinfetante adequado, perfure a pele com uma lanceta de segurança de uso único.

Os dedos devem ser mantidos em uma posição que a gravidade facilite a coleta de sangue na ponta do dedo. Limpe a primeira gota de sangue com uma gaze, pois pode conter excesso de fluidos teciduais. Depois de massagear o dedo novamente para aumentar o fluxo sanguíneo no local da punção, transfira a gota seguinte para um dos círculos de um cartão de filtro sem tocar na superfície diretamente com a ponta do dedo.

Deixe a próxima grande gota de sangue capilar se formar na ponta do dedo e colete-a no próximo círculo. Continue este procedimento até que todos os círculos necessários sejam preenchidos ou o fluxo sanguíneo pare durante a coleta. Deixe o sangue ser embebido na textura do filtro apenas por forças capilares.

Não aperte ou ordenhe o dedo excessivamente se o fluxo sanguíneo não for suficiente para preencher todos os círculos necessários do cartão do filtro. Se o fluxo sanguíneo parar, coloque um curativo na ponta do dedo, faça uma segunda punção cutânea em outro dedo se for necessário mais sangue para o exame para secar as manchas de sangue, coloque os cartões de filtro em uma toalha de papel limpa em um armário de segurança de risco biológico e deixe-os secar, de preferência durante a noite em temperatura ambiente. Na ausência de qualquer fonte externa de calor, quando o processo de secagem está completo, as manchas de sangue têm uma cor acastanhada uniformemente escura e não há mais áreas vermelhas visíveis para armazenamento.

Coloque o cartão de papel de filtro em um único saco com zíper impermeável a gás contendo um a dois sachês dessecantes para proteger as amostras da umidade. Transfira este saco para um freezer com temperatura de 20 graus Celsius negativos ou inferior o mais rápido possível. Se os freezers não estiverem disponíveis em condições de campo, o armazenamento a menos quatro graus Celsius ou mesmo à temperatura ambiente é viável por até 14 dias.

Perfure um ponto com um dispositivo de seis milímetros de uso único de cada círculo encharcado de sangue da transferência de cartão de filtro de grau 9 0 3, todos os pontos de sangue seco perfurados de um único paciente para um poço dos 12. A placa do poço enche o poço com solução salina tamponada com fosfato contendo 0,05% entre 20 e 0,08% de azida de sódio. Repita essas etapas para obter uma segunda série de EITs de manchas de sangue seco para realizar análises moleculares.

Em seguida, coloque a placa de cultura de células em um agitador de laboratório e deixe as manchas de sangue seco eluirem suavemente por no mínimo quatro horas ou, de preferência, durante a noite. No dia seguinte, as manchas estão quase livres de sangue e sobrenadantes hemolíticos se formaram. Transfira esses EITs para tubos de microcentrífuga e, em seguida, submeta-os à centrifugação por dois minutos a 10.500 vezes G para liberar.

Os sobrenadantes de quaisquer detritos que se formaram durante os EITs centrifugados Ellucian estão agora prontos para serem usados nas análises pretendidas. A primeira série de EITs é transferida para copos para testes sorológicos. A segunda série é transferida para microtubos para análise de PCR.

Investigue os EITs em busca de marcadores de vírus da hepatite B, vírus da hepatite C e infecção por HIV usando ensaios disponíveis comercialmente e siga as instruções do respectivo fabricante cuidadosamente. Finalmente, os resultados do teste sorológico no analisador totalmente automatizado são exibidos na tela do sistema. A eficácia do protocolo sugerido para a preparação e processamento de manchas de sangue seco foi avaliada pela primeira vez analisando 1.762 pares de manchas de sangue seco de soro acoplado em relação às determinações do antígeno de superfície do vírus da hepatite B.

O protocolo de ensaio foi modificado porque, com um valor de corte de 0,05 unidades internacionais por mililitro, 56,2% dos EITs foram reagentes em comparação com os resultados obtidos com Sarah. Isso correspondeu a uma taxa de falsos positivos de 14,7% no teste de antígeno de superfície do vírus da hepatite B. A análise das características operacionais do receptor dos dados indicou que um aumento do limite para 0,15 unidades internacionais por mililitro resultaria em uma separação ideal de antígenos de superfície positivos do vírus da hepatite B dos negativos do antígeno de superfície do vírus da hepatite B ao investigar pares de manchas de sangue seco sérico para a presença de antígeno de superfície do vírus da hepatite B, apenas dois discrepantes foram obtidos.

Os dois Sarah falsamente negativos se originaram de pacientes em tratamento antiviral. A determinação qualitativa de H-B-V-D-N-A por PCR em tempo real de EITs de sangue total rendeu uma sensibilidade de 93%Assim, sete amostras com baixas concentrações séricas de H-B-V-D-N-A não foram detectadas. Apenas quatro resultados anti-HCV falsamente negativos foram determinados a partir de EITs de manchas de sangue seco.

Os respectivos C foram muito provavelmente retirados de pacientes cujas infecções já haviam sido resolvidas há muito tempo. A sensibilidade analítica de 100% para determinações de H-C-V-R-N-A de TIEs de manchas de sangue seco indicou a excelente sensibilidade da abordagem de amplificação mediada por transcrição isotérmica, que foi usada para amplificação de H-C-V-R-N-A. A detecção de anticorpos anti-HIV em EITs de sangue seco com um sistema totalmente automatizado também resultou em uma sensibilidade analítica de 100%Este vídeo mostra que hoje em dia é possível detectar de forma confiável marcadores sorológicos e moleculares de infecções por hepatite B, hepatite C e HIV em todas as manchas de sangue apertado, mesmo quando um volume de eluição comparativamente alto é usado e modificações dos protocolos de ensaio estabelecidos para investigações de soro ou plasma são não mudou consideravelmente.

No entanto, os resultados comunicados também confirmaram os limites inerentes à técnica de manchas de sangue seco. Em alguns casos. O protocolo descrito também foi testado em condições de campo em 534 usuários ativos de drogas nas cidades alemãs de Berlim e Essen durante a fase piloto do estudo drogas e doenças infecciosas crônicas.

Os resultados obtidos levaram a uma pequena modificação do algoritmo de teste para a fase principal do estudo do medicamento em seis grandes cidades alemãs adicionais.