Sincronização de Caulobacter crescentus Para Investigação do Ciclo Celular Bacteriana
8 de abril de 2015
A sincronização das células bacterianas é essencial para estudos do ciclo e desenvolvimento celular bacteriano. Caulobacter crescentus é sincronizável através de centrifugação por densidade, permitindo uma ferramenta rápida e poderosa para estudos do ciclo celular bacteriano. Aqui fornecemos um protocolo detalhado para a sincronização de células de Caulobacter.
O objetivo geral deste procedimento é isolar as células do enxame de suporte de Coob para estabelecer uma cultura de células sincronizada. Isso é feito primeiro cultivando uma cultura mista de células de suporte de coob e, em seguida, interrompendo brevemente o crescimento por Resus suspendendo as células em meio frio. O segundo passo é separar as células do enxame por meio de centrifugação de densidade diferencial.
O próximo passo é ressuspender as células do enxame em meio quente, o que permite que as células entrem no ciclo celular. Finalmente, as células isoladas do enxame podem ser acompanhadas ao longo do ciclo celular usando ensaios bioquímicos ou microscopia. A principal vantagem dessa técnica sobre outros métodos, como a máquina de células infantis, é que as células podem ser isoladas rapidamente e ampliar quantidades suficientes para estudos bioquímicos.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular, como o que controla a segregação cromossômica e o ciclo assimétrico de divisão celular. Para começar, inocule cinco mililitros de meio PYE com bactérias de uma placa de cepa CSIS de suporte colo, NA 1000. Cultive a cultura durante a noite a 28 graus Celsius com agitação no dia seguinte, transfira 0,5 mililitros da cultura noturna para um frasco contendo 25 mililitros de meio M dois G e agite o frasco a 28 graus Celsius até que a cultura atinja uma densidade óptica entre 0,5 e 0,6.
Em seguida, dilua a cultura em um litro de meio M dois G para obter a densidade óptica inicial desejada e agite o frasco a 28 graus Celsius quando a densidade óptica da cultura atingir 0,5, pipete um microlitro da cultura em uma lâmina e, em seguida, cubra o líquido com uma lamínula. Imagem das células por microscopia de fase para confirmar a presença de células de enxame nadando rapidamente. Transfira a cultura para um tubo de centrífuga estéril e, em seguida, gire as células a 7.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, descarte as células frouxamente peletizadas ao despejar o sobrenadante e adicione 180 mililitros de meio frio M dois. Use uma pipeta sorológica para ressuspender suavemente as células. Em seguida, adicione 60 mililitros de solução fria de sílica coloidal à suspensão celular e misture bem.
Despeje a suspensão celular em oito tubos de 30 mililitros e centrifugue-os a 6.400 vezes G por 30 minutos. Defina quatro graus Celsius. Remova cuidadosamente os tubos da centrífuga e verifique se há duas bandas distintas no tubo.
A banda inferior contém as células do enxame e as células pré-divisionais estão na banda superior. Em seguida, aspire cuidadosamente a banda superior e o líquido até aproximadamente um centímetro acima da banda inferior. Use uma pipeta de paster para remover a banda de enxame e transfira-a para um tubo limpo.
Encher o tubo com meio M two frio e, em seguida, centrifugar o tubo para lavar a sílica coloidal. Em seguida, descarte cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células em 20 mililitros de centrífuga fria M dois meios. Novamente para pellet as células, ressuspenda os pellets em 30 mililitros de meio frio M dois e, em seguida, meça a densidade óptica da suspensão.
Coloque um microlitro da suspensão celular em uma lâmina de microscópio e use imagens de fase para verificar se há células de enxame. Em seguida, centrifugue as células e ressuspenda-as em meio M dois G até uma densidade óptica entre 0,3 e 0,4. Incube a cultura com agitação a 28 graus Celsius para ensaios de plotagem ocidental ou expressão gênica.
Remover alíquotas de um mililitro de 10 a 30 minutos durante cerca de 140 minutos até duplicar a densidade óptica da cultura. Use uma centrífuga de mesa para girar as células por 30 segundos e, em seguida, aspire rapidamente o flash médio. Congele os grânulos celulares em nitrogênio líquido e armazene-os a 80 graus Celsius negativos para sincronia em pequena escala, inocule cinco mililitros de meio M dois G com células NA 1000 e cultive as células durante a noite com agitação a 28 graus Celsius no dia seguinte.
Diluir a cultura em 15 mililitros de meio M dois G e aumentar as células até que a densidade óptica esteja entre 0,5 e 0,6. Centrifugue as células e ressuspenda-as em um mililitro de meio frio M dois. Transferir as células para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros, pulverizar as células por centrifugação e aspirar o alimentador.
Em seguida, coloque o tubo no gelo e ressuspenda o pellet celular em 900 microlitros de meio frio M dois. Em seguida, adicione 900 microlitros de sílica coloidal revestida com PVP frio e centrifugue o tubo por 20 minutos. Aspire cuidadosamente a banda de células pré-divisional superior e, em seguida, colete a banda inferior do enxame em um novo tubo de microcentrífuga.
Lave as células do enxame duas vezes em um mililitro de meio frio M dois enquanto centrifuga por três minutos entre cada lavagem antes da centrifugação final. Coloque a suspensão da célula em um tubo de ensaio de vidro pré-resfriado de um mililitro e meça a densidade óptica das células. Em seguida, transfira as células para um tubo de microfuga e centrifugue após a centrifusão.
Reese, suspenda o pellet celular final em meio Prewarm M two G a uma densidade óptica entre 0,3 e 0,4 e agite as células a 28 graus Celsius. Se a microscopia for desejada, coloque um microlitro da cultura em uma almofada M two G aeros nos pontos de tempo apropriados. A centrifugação de densidade diferencial de uma cultura assíncrona produz duas bandas de células.
A banda inferior contém células de enxame, que têm uma densidade mais alta, e a banda superior contém células estocadas e pré-divisionais, que têm uma densidade mais baixa. A densidade óptica da cultura aumenta aproximadamente duas vezes durante o curso do ciclo celular. Durante esse tempo, as células do enxame se diferenciam em células estocadas, as células estocadas se replicam e sofrem divisão celular assimétrica.
Com cada divisão produzindo uma nova célula de enxame e a célula-mãe estocada, um western blot para o regulador mestre do ciclo celular CTRA é um controle útil para verificar a sincronização, o CTRA bloqueia a replicação do DNA nas células do enxame e é degradado após a replicação do DNA. O CTRA é então sintetizado mais tarde no ciclo celular, impedindo a reiniciação da replicação do DNA e ativando a transcrição de muitos genes de desenvolvimento. Este padrão oscilante dos níveis de proteína CTRA indica uma sincronia bem-sucedida.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como sincronizar o retorno de chamada ou as células NA 1000 para investigar o ciclo celular bacteriano. Este procedimento de sincronização celular pode ser feito em uma a duas horas, se executado corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar rapidamente.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para a sincronização de células de Caulobacter crescentus, essencial para o estudo do ciclo celular bacteriano. O método envolve o isolamento de células swarmer por meio de centrifugação em gradiente de densidade, permitindo que os pesquisadores acompanhem essas células ao longo de seu desenvolvimento.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Biologia Celular
- Ciclo Celular Bacteriano
Antecedentes
- A sincronização de células bacterianas é essencial para estudos precisos.
- Caulobacter crescentus pode ser sincronizado utilizando centrifugação por densidade.
- Este método fornece uma ferramenta rápida para o estudo do desenvolvimento bacteriano.
- Compreender o ciclo celular é fundamental para diversas aplicações em pesquisas biológicas.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer uma cultura sincronizada de células swarmer de Caulobacter crescentus.
- Facilitar ensaios bioquímicos e estudos de microscopia.
- Aprimorar os métodos existentes para o isolamento celular.
Métodos Utilizados
- Cultivo de uma cultura mista de células de Caulobacter.
- Interromper o crescimento ressuspendendo as células em meio frio.
- Separar as células swarmer por centrifugação em gradiente de densidade diferencial.
- Ressuspensão das células swarmer isoladas em meio quente para iniciar o ciclo celular.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de células swarmer para cultura sincronizada.
- Capacidade de acompanhar as células ao longo do ciclo celular utilizando diversas técnicas.
- Demonstração das vantagens deste método em relação às técnicas tradicionais.
- Oferecimento de um protocolo detalhado para que pesquisadores possam replicar o estudo.
Conclusões
- O protocolo permite a sincronização eficiente de Caulobacter crescentus.
- Este método aprimora o estudo dos ciclos celulares bacterianos.
- Ele fornece uma ferramenta valiosa para estudos bioquímicos e de microscopia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A sincronização de Caulobacter crescentus permite a análise temporal precisa de eventos do ciclo celular bacteriano, apoiando a redução de riscos mecanicistas e a validação de alvos na fase inicial de descoberta. Essa abordagem fornece sistemas biológicos de alta confiabilidade e reprodutíveis para dissecar redes regulatórias e a dinâmica de proteínas relevantes para o crescimento e divisão bacterianos. A escalabilidade do método e suas saídas quantitativas o posicionam como uma plataforma reutilizável para investigações abrangentes do ciclo celular bacteriano em todo o portfólio.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de vias regulatórias do ciclo celular e função proteica em populações sincronizadas.
- Apóia a validação funcional de alvos ao permitir perturbações controladas e medição de eventos do ciclo celular.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao esclarecer a sequência e dependência de eventos moleculares.
- Oferece confiança preditiva para estudos posteriores de crescimento e divisão bacterianos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Gera populações celulares validadas e sincronizadas para ensaios bioquímicos quantitativos e microscopia.
- Melhora a reprodutibilidade dos ensaios ao minimizar a variabilidade biológica no estado do ciclo celular.
- Permite a padronização de leituras como oscilação proteica (por exemplo, CTRA) e marcadores de divisão celular.
- Prepara sistemas biológicos robustos para triagem de compostos ou estudos de perturbação genética.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos do ciclo celular bacteriano com pesquisas translacionais sobre divisão celular e replicação do genoma.
- Apoia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica de alvos antibacterianos.
- Oferece uma plataforma para o avanço ajustado ao risco de intervenções moduladoras do ciclo celular.
- Oferece desvio preditivo de riscos para estratégias de inibição do crescimento bacteriano.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de sincronização integra-se na interface entre a descoberta inicial e o desenvolvimento de ensaios, permitindo estudos orientados por hipóteses sobre a regulação do ciclo celular bacteriano e apoiando a identificação de compostos promissores para pesquisas antibacterianas.
- Biologia da Descoberta: Facilita a verificação da hipótese nula e a clarificação de vias ao isolar estágios específicos do ciclo celular.
- Triagem: Fornece populações reprodutíveis e sincronizadas prontas para o desenvolvimento de ensaios quantitativos e triagem.
- Análises: Fornece resultados mensuráveis, como oscilação de proteínas e temporização da divisão celular, para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta insights mecanicistas a modelos pré-clínicos de crescimento e divisão bacteriana.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado e escalável para uso repetido em estudos do ciclo celular bacteriano.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa do ciclo celular bacteriano.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos preparos de células sincronizadas.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper projetos e a eficiência do capital ao permitir a validação robusta de alvos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos antibacterianos e de estratégias moduladoras do ciclo celular.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura bacteriana, centrifugação de densidade e elaboração de ensaios quantitativos.
- Exige acesso a equipamentos de centrifugação, microscopia e plataformas analíticas para análise de expressão gênica e proteica.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de sincronização e ensaios para garantir reprodutibilidade.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes cepas bacterianas ou sistemas modelo.
- A execução rápida é essencial para manter a sincronia e minimizar a variabilidade biológica.
