Name: Sincronização de Caulobacter crescentus Para Investigação do Ciclo Celular Bacteriana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprenda a sincronizar células de Caulobacter crescentus usando centrifugação por densidade diferencial. Este método permite isolar células swarmer para estudos bioquímicos e microscopia do ciclo celular bacteriano.

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Os autores agradecem aos membros do laboratório Shapiro e a Erin Schrader pelos comentários sobre o manuscrito. Os autores agradecem o apoio financeiro de: bolsa de pós-doutorado do NIH F32 GM100732 para JMS e NIH concede R01 GM51426 e R01 GM32506 para LS.

1. grande escala Synchrony - Optimal para Western Blot, Microarray / RNA-Seq, e outros ensaios Intensivo de materiais <ol><li> A partir de um estoque congelador ou uma placa, um crescer 5 ml O / N cultura da estirpe NA1000 por agitação a 28 ° C em meio PYE. </li><li> Inocular 0,5 ml de células a partir do passo 1 em 25 ml de M2G (Tabelas 1-2) e agitar a 28 ° C até a cultura atingir uma OD 600 entre 0,5 e 0,6. </li><li> Inocular as células em 1 L de M2G e agitar a 28 ° C. </li><li> Uma vez OD 600 atinge 0.5 a 0.6, confirmar a presença de swarmer células usando microscopia de fase líquida montado. Ponto 1 ml de células em uma lâmina de vidro, cubra com uma tampa de deslizamento e imagem por meio de microscopia de fase. Confirmar a presença de células Swarmer, visualizando as células rapidamente natação na população. </li><li> Girar células durante 15 min a 7 kxg a 4 ° C num rotor JA-10. </li><li> Desprezar o sobrenadante e adicionar 180 ml de frio M2 (Tabelas 1-2) e res delicadamenteuspend todas as células utilizando uma pipeta serológica. Descarte células frouxamente peletizadas; eles são células predivisional e saiu. </li><li> Adicionar 60 ml de solução de sílica coloidal fria (não se esqueça de misturar a suspensão de sílica coloidal bem antes de adicionar às células) e misturar a suspensão de células bem. </li><li> Verter a suspensão de células em oito tubos de 30 ml e girar durante 30 min a 6,4 kxg a 4 ° C num rotor JA-20. NOTA: Deve-se ver duas bandas distintas; a banda swarmer é a banda inferior, enquanto espreitavam / células predivisional estão na faixa superior (Figura 1B). </li><li> Aspirar cuidadosamente a banda superior e retire o líquido a ~ 1 cm acima da banda swarmer (a banda inferior). </li><li> (Crítica) Usando uma pipeta Pasteur, retire cuidadosamente a banda swarmer e coloque em um tubo limpo. Para lavar a sílica coloidal, parte superior do tubo fora com frio M2 e centrifugação durante 10 min a 6,4 kxg a 4 ° C num rotor JA-20. </li><li> Descartar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender oas células em 20 ml de frio M2 e rotação durante 10 min a 6,4 kxg a 4 ° C num rotor JA-20. </li><li> Ressuspender todas as pelotas em 30 ml de frio M2 e medir o OD 600 usando um espectrofotômetro e em branco, utilizando meio M2 frio. Salve 1 ml para a imagem latente fase para verificar se há swarmer células; 90-95% das células devem ser Swarmers. </li><li> Girar as células durante 5 min a 6,4 kxg a 4 ° C num rotor JA-20. Ressuspender as células em meio de 28 ° C de modo que o M2G A 600 é ~ 0,3-0,4 e começar agitação a 28 ° C. NOTA: Os rendimentos típicos são entre 30 e 60 mL de swarmer cultura de células de 1L de células não sincronizadas. </li><li> Comece a tomar pontos no tempo (cultura de tipo selvagem levará aproximadamente 135-140 minutos para dividir) 8,9. Em cada ponto de tempo, medir o OD 600. Verifique se o OD 600 após a divisão é de aproximadamente 2X o OD inicial 600. </li><li> Para blot ou de expressão de genes ensaios ocidentais, retirar alíquotas de 1 mL do cuLTURE nos momentos desejados, girar na velocidade máxima em uma centrífuga de mesa para 30 seg, rapidamente decantar ou aspirar o meio, e flash congelar o pellet celular em nitrogênio líquido. Armazenar as células à temperatura de -80 ° C até à análise a jusante. </li></ol> 2. pequena escala Synchrony - Optimal de Microscopia <ol><li> A partir de um estoque congelador ou uma placa, crescer uma cultura de 5 ml O / N com agitação a 28 ° C em M2G. </li><li> Diluir em 15 ml de M2G (Tabelas 1-2) e crescer até meados de log (OD 600 = 0,5-0,6). </li><li> Rotação em 6,4 kxg durante 10 min a 4 ° C num rotor JA-20, e ressuspender em 1 ml M2 frio (Tabelas 1-2) e transferência para um tubo de microcentrifugação de 2 ml. </li><li> Centrifugação 15 kxg durante 3 min num tubo de microcentrífuga para sedimentar as células, aspirar o sobrenadante, o sedimento colocado em gelo, e ressuspender em 900 ul de frio M2. </li><li> Adicionar 900 ul de PVP frio revestido de sílica coloidal e centrifugação durante 20 min a 15 kxg a 4 ° C num microfonetubo rocentrifuge. </li><li> (Critical) Aspirar ou pipeta fora do topo perseguido banda de células predivisional / e recolher o fundo swarmer banda em um novo tubo de microcentrífuga. </li><li> Lavar as células duas vezes swarmer em 1 ml de frio, enquanto M2 centrifugação a 15 kxg durante 3 min. </li><li> Antes da centrifugação final, mover as células em 1 ml de um tubo de ensaio de vidro pré-gelada e medir a DO 600 das células em comparação com um branco de M2. </li><li> Ressuspender o sedimento celular final a 28 ° C a uma DO M2G entre 0,3-0,4 e agitar células / rolo a 28 ° C. NOTA: Os rendimentos típicos são entre 2 e 4 ml de cultura de células swarmer. </li><li> Para experimentos de microscopia, nos momentos lugar 1 ml de células desejado para uma almofada de agarose M2G para geração de imagens. </li></ol>

<ol><li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-level+design+of+bacterial+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">System-level design of bacterial cell cycle control.</a> FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).</li>
<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+and+conservation+pattern+of+whole-cell+control+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry.</a> J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).</li>
<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacterial+cell-cycle+regulatory+network+operating+in+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space.</a> Science. 301, 1874-1877 (2003).</li>
<li>Ptacin, J. L., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiating+bacterial+mitosis%3A+understanding+the+mechanism+of+ParA-mediated+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation.</a> Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).</li>
<li>Evinger, M., Agabian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Envelope-associated+nucleoid+from+Caulobacter+crescentus+stalked+and+swarmer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells.</a> J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).</li>
<li>Tsai, J. W., Alley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+of+the+Caulobacter+McpA+chemoreceptor+is+cell+cycle+regulated+by+a+ClpX-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway.</a> J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).</li>
<li>Marks, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+laboratory+adaptation+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus.</a> J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).</li>
<li>Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetics of Caulobacter crescentus.</a> Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).</li>
<li>Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClpXP+and+ClpAP+proteolytic+activity+on+divisome+substrates+is+differentially+regulated+following+the+Caulobacter+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division.</a> Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).</li>
<li>Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+control+of+bacterial+DNA+replication+by+a+cell+cycle+regulatory+protein+that+binds+at+the+chromosome+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).</li>
<li>Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+directly+controlled+by+CtrA%2C+a+master+regulator+of+the+Caulobacter+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).</li>
<li>Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+by+an+essential+bacterial+two-component+signal+transduction+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein.</a> Cell. 84, 83-93 (1996).</li>
<li>Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization+of+Escherichia+coli+using+the+stringent+response%2C+with+fluorescence+labeling+assays+for+DNA+content+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication.</a> Methods. 48, 8-13 (2009).</li>
<li>Degnen, S. T., Newton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+replication+during+development+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus.</a> J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).</li>
<li>Bates, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Escherichia+coli+baby+cell+column%3A+a+novel+cell+synchronization+method+provides+new+insight+into+the+bacterial+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle.</a> Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).</li>
<li>Abel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-modal+distribution+of+the+second+messenger+c-di-GMP+controls+cell+fate+and+asymmetry+during+the+caulobacter+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle.</a> PLoS Genet. 9, e1003744(2013).</li>
<li>Johnson, R. C., Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+spontaneously+derived+mutants+of+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus.</a> Genetics. 86, 25-32 (1977).</li>
<li>Britos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+response+to+carbon+starvation+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus.</a> PLoS One. 6, e18179(2011).</li>
<li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+logic+of+stringent+response+regulation+in+Caulobacter+crescentus%3A+starvation+signalling+in+an+oligotrophic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment.</a> Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O ciclo celular bacteriano é um processo fundamental na vida e é importante para o estudo do crescimento e como alvo para antibióticos de próxima geração. Aqui, detalhamos os procedimentos de sincronização rápida para C. crescentus NA1000, um organismo modelo para o estudo do ciclo celular bacteriano e da divisão celular assimétrica. Este método pode ser alterado para western blot, perfil de expressão gênica e ensaios de microscopia de fluorescência para investigar a regulação espaço-temporal do ciclo celular b...

O ciclo celular bacteriana controla a replicação do genoma e a divisão de células filhas. É importante salientar, como a resistência aos antibióticos é uma ameaça crescente para a saúde pública, o ciclo celular bacteriana apresenta um alvo inexplorado para o desenvolvimento de antibióticos. No bactéria Caulobacter crescentus, cada ciclo celular conduz a uma divisão assimétrica, obtendo-se duas células filhas de destinos diferentes (Figura 1A) 1,2. Uma célula filha herda um flagelo e é móvel, enquanto a outra filha herda uma haste e é séssil. Um circuito genético integrado controla a progressão do ciclo celular e destino celular por regulação da transcrição, fosfo-sinalização, e proteólise regulamentado 3. Além disso, a replicação do cromossoma e células filhas segregação de rendimento concomitantes que contêm uma cópia exacta do cromossoma 4. É importante notar que estes dois tipos de células podem ser rapidamente separados por colloidal de partículas de sílica de centrifugação de densidade na estirpe sincronizável NA1000 5-7 permitindo o isolamento das células swarmer do resto da população com rendimentos elevados (Figura 1B). Isolado swarmer células em seguida, proceder de forma síncrona através da divisão celular assimétrica. Aqui, nós detalhe o protocolo utilizado para a sincronização de Caulobacter NA1000 estirpe. Nós fornecemos protocolos e dicas de solução de problemas comuns para ambos de grande e pequena escala sincronizações. Este procedimento experimental proporciona uma ferramenta poderosa para interrogar o controlo espacial e temporal da Caulobacter ciclo celular e o destino celular.

<table><tbody><tr><td>Sílica coloidal revestida com PVP (Percoll)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4937</td><td></td></tr><tr><td>Sílica coloidal (Ludox AS-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>420840</td><td></td></tr><tr><td>JA10 Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>369687</td><td></td></tr><tr><td>JA20 Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>334831</td><td></td></tr><tr><td>Solução de sulfato ferroso quelato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0518</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 30 ml</td><td>Corning</td><td>8445</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>VWR</td><td>BDH9268-500G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Amresco</td><td>0621-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

sincronização de<em&gt; caulobacter crescentus</em&gt; para investigação do ciclo celular bacteriana

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

O ciclo celular é importante para o crescimento, replicação do genoma e desenvolvimento em todas as células. Nas bactérias, os estudos do ciclo celular se concentraram principalmente em células não sincronizadas, dificultando a ordenação dos eventos temporais necessários para a progressão do ciclo celular, replicação e divisão do genoma. Caulobacter crescentus fornece um excelente sistema modelo para o ciclo celular bacteriano pelo qual as células podem ser rapidamente sincronizadas em um estado G0 por centrifugação de densidade. Experimentos de sincronização do ciclo celular têm sido usados para estabelecer os eventos moleculares que governam a replicação e segregação cromossômica, para mapear uma rede regulatória genética que controla a progressão do ciclo celular e para identificar o estabelecimento de complexos de sinalização polar necessários para a divisão celular assimétrica. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para a sincronização rápida de células Caulobacter NA1000. A sincronização pode ser realizada em um formato de grande escala para perfis de expressão gênica e ensaios de western blot, bem como em um formato de pequena escala para ensaios de microscopia ou FACS. A rápida sincronizabilidade e o alto rendimento celular de Caulobacter tornam este organismo um poderoso sistema modelo para estudos do ciclo celular bacteriano.

Sincronização normalmente produz duas bandas de células (Figura 1B): a banda swarmer, que tem uma densidade mais elevada, e uma banda de células perseguido / predivisional de menor densidade. Para garantir controles comuns de sincronização eficiente incluir o acompanhamento da OD 600 e medição dos níveis de proteína CtrA por western blot no ciclo celular momentos distintos. O OD 600 deveria aumentar em cerca de 2 vezes durante o decurso do ciclo celular (Figura 2)....

A sincronização das células bacterianas é essencial para estudos do ciclo e desenvolvimento celular bacteriano. Caulobacter crescentus é sincronizável através de centrifugação por densidade, permitindo uma ferramenta rápida e poderosa para estudos do ciclo celular bacteriano. Aqui fornecemos um protocolo detalhado para a sincronização de células de Caulobacter.

Sincronização de<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Para Investigação do Ciclo Celular Bacteriana

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar células nadadoras de Coob backer com o fim de estabelecer um cultivo celular sincronizado. Isso é realizado primeiramente cultivando um cultivo misto de células de Coob backer e, em seguida, interrompendo brevemente o crescimento ao ressuspender as células em meio frio. O segundo passo consiste em separar as células nadadoras por meio de centrifugação em gradiente de densidade diferencial.O próximo passo é ressuspender as células migratórias em meio aquecido, o que permite que as células entrem no ciclo celular. Por fim, as células migratórias isoladas podem ser acompanhadas ao longo do ciclo celular por meio de ensaios bioquímicos ou microscopia. A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos, como a máquina de células filhas, é que as células podem ser isoladas rapidamente e ampliadas em quantidades suficientes para estudos bioquímicos.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da biologia celular, como o que controla a segregação cromossômica e o ciclo de divisão celular assimétrica. Para começar, inocular cinco mililitros de meio PYE com bactérias de uma placa de cepa colo backer CSIS, NA 1000. Crescer a cultura durante a noite a 28 graus Celsius com agitação; no dia seguinte, transferir 0,5 mililitros da cultura noturna para um frasco contendo 25 mililitros de meio M dois G e agitar o frasco a 28 graus Celsius até que a cultura atinja uma densidade óptica entre 0,5 e 0,6.Em seguida, dilua a cultura em um litro de meio M dois G para obter a densidade óptica inicial desejada e agite o frasco a 28 graus Celsius. Quando a densidade óptica da cultura atingir 0,5, pipete um microlitro da cultura sobre uma lâmina e, em seguida, cubra o líquido com uma lamínula. Obtenha imagens das células por microscopia de contraste de fase para confirmar a presença de células nadadoras em enxame. Transfira a cultura para um tubo de centrífuga estéril e, então, centrifugue as células a 7.000 ×g por 15 minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, descarte as células fracamente pelotizadas ao derramar o sobrenadante e adicione 180 mililitros de meio M dois frio. Utilize uma pipeta serológica para ressuspender suavemente as células. Então, adicione 60 mililitros de solução fria de sílica coloidal à suspensão celular e misture bem.Despeje a suspensão celular em oito tubos de 30 mililitros e centrifugue-os a 6.400 ×g por 30 minutos. Ajuste a 4 graus Celsius. Remova cuidadosamente os tubos da centrífuga e verifique a presença de duas bandas distintas no tubo.A faixa inferior contém as células migratórias, enquanto as células pré-divisão estão na faixa superior. Em seguida, aspire cuidadosamente a faixa superior e o líquido até aproximadamente um centímetro acima da faixa inferior. Utilize uma pipeta de Pasteur para remover a faixa de migração e transferi-la para um tubo limpo.Encha o tubo com meio M dois frio e, em seguida, centrifugue o tubo para remover a sílica coloidal. Depois, descarte cuidadosamente o sobrenadante e re-suspenda as células em 20 mililitros de meio M dois frio. Centrifugue novamente para obter o pellet celular, re-suspenda os pellets em 30 mililitros de meio M dois frio e, então, meça a densidade óptica da suspensão.Coloque um microlitro da suspensão celular em uma lâmina de microscópio e utilize imagem de contraste de fase para verificar a presença de células migratórias. Em seguida, centrifugue as células e re-suspenda-as em meio M dois G até uma densidade óptica entre 0,3 e 0,4. Incube a cultura sob agitação a 28 graus Celsius para ensaios de blot ocidental ou de expressão gênica.Retire alíquotas de um mililitro a cada 10 a 30 minutos durante aproximadamente 140 minutos, até que a densidade óptica do cultivo duplique. Utilize uma centrífuga de bancada para sedimentar as células por 30 segundos e, em seguida, aspire rapidamente o sobrenadante. Congele os pellets celulares em nitrogênio líquido e armazene-os a menos 80 graus Celsius para sincronia em pequena escala. Inocule cinco mililitros de meio M dois G com 1000 células NA e cultive as células durante a noite com agitação a 28 graus Celsius no dia seguinte.Dilua a cultura em 15 mililitros de meio M dois G e cultive as células até que a densidade óptica esteja entre 0,5 e 0,6. Centrifugue as células e, em seguida, ressuspenda-as em um mililitro de meio M dois frio. Transfira as células para um tubo microcentrífuga de dois mililitros, forme o pellet celular por centrifugação e aspire o sobrenadante.Em seguida, coloque o tubo no gelo e ressuspenda o pellet celular em 900 microlitros de meio M dois frio. A seguir, adicione 900 microlitros de sílica coloidal recoberta com PVP fria e centrifugue o tubo por 20 minutos. Aspire cuidadosamente a camada superior de células pré-divisão e, então, colete a camada inferior de células swarmer em um novo tubo de microcentrífuga.Lave as células flutuantes duas vezes em um mililitro de meio M2 frio, centrifugando por três minutos entre cada lavagem, logo antes da centrifugação final. Coloque a suspensão celular em um tubo de ensaio de vidro pré-resfriado de um mililitro e meça a densidade óptica das células. Em seguida, transfira as células para um tubo de microcentrífuga e centrifugue após a centrifugação.Reese, suspenda o pellet final de células em meio M dois G pré-aquecido a uma densidade óptica entre 0,3 e 0,4 e agite as células a 28 graus Celsius. Se desejar microscopia, coloque um microlitro da cultura em um suporte de aeros M dois G nos pontos temporais apropriados. A centrifugação em gradiente de densidade de uma cultura assíncrona produz duas bandas de células.A faixa inferior contém células migratórias, que possuem maior densidade, e a faixa superior contém células estocadas e pré-divisão, que têm menor densidade. A densidade óptica do cultivo aumenta aproximadamente duas vezes durante o ciclo celular. Durante esse período, as células migratórias se diferenciam em células estocadas, que então se replicam e sofrem divisão celular assimétrica.A cada divisão, formando uma nova célula flague-lada e a célula-mãe estocada, um western blot para o regulador mestre do ciclo celular CTRA é um controle útil para verificar a sincronização. O CTRA bloqueia a replicação do DNA em células flague-ladas e é degradado após a replicação do DNA. O CTRA é então sintetizado posteriormente no ciclo celular, impedindo a reativação da replicação do DNA e ativando a transcrição de muitos genes de desenvolvimento. Esse padrão oscilante nos níveis da proteína CTRA indica uma sincronização bem-sucedida.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como sincronizar células de *Caulobacter crescentus* NA1000 para investigar o ciclo celular bacteriano. Este procedimento de sincronização celular pode ser realizado em uma a duas horas, se executado corretamente. Embora a realização deste procedimento, é importante lembrar de trabalhar rapidamente.

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Biologia

Recentemente, relatou uma nova abordagem para a geração de sondas DNAzyme fluorogênicos que podem ser aplicadas para criar um simples, "mistura-e-ler" teste de fluorescência para a detecção bacteriana. Estas sondas de DNA especiais catalisar a clivagem de um cromóforo-modificado substrato DNA-RNA quimérico, na presença de mistura extracelular em bruto (CEM) produzida por uma bactéria específica, assim, traduzindo a detecção de bactérias em geração do sinal de fluorescência. Neste relatório, irá...

Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

A concepção de um operão que codifica tanto o aparelho sintético de secreção e os monómeros estruturais de curli fibras é descrito. A superprodução destas amilóides e polímeros aderentes permite um ganho mensurável de aderência...

Engenharia bactérias aderentes pela criação de um único sintético Curli Operon

Fonte: Murata, K. et. al., Visualização da compactação de DNA em cianobactérias por tomografia crioeletrônica de alta voltagem. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra o cultivo síncrono de cianobactérias sob ciclos claro-escuro para estudar a compactação do DNA regulada pelo circadiano. A microscopia de fluorescência revela DNA condensado em pontos de tempo definidos, confirmando o alinhamento do ciclo celular em toda a população.

Sincronização de cultura de cianobactérias e compactação de DNA impulsionadas por ciclos claro-escuro

Compreender a função dos processos essenciais de bactérias é um desafio. Microscopia de fluorescência com corantes de destino específico pode fornecer insights-chave em progressão de crescimento e ciclo celular de células microbianas. Aqui, a Agrobacterium tumefaciens é usado como uma bactéria modelo para destacar métodos para geração de imagens de células vivas para a caracterização de processos essenciais.

Viver a microscopia de fluorescência da célula para observar os processos essenciais durante o crescimento de células microbianas

As células bacterianas são espacialmente altamente organizadas. Para seguir esta organização ao longo do tempo em crescimento lento Myxococcus xanthus células, foi desenvolvido um set-up para a imagem latente de viver-pilha de fluorescência com alta resolução spatiotemporal ao longo de várias gerações. Usando esse método, pôde ser determinada spatiotemporal dinâmica de proteínas importantes para a segregação de cromossomos e divisão celular.

Imagem latente da Live-pilha fluorescência de completa ciclo vegetativo celular do lento crescimento Social bactéria Myxococcus xanthus

Descrito aqui é um método de análise de expressão gênica bacteriana em tecidos animais em nível celular. Este método fornece um recurso para estudar a diversidade fenotípica ocorrendo dentro de uma população bacteriana em resposta ao ambiente de tecido durante uma infecção.

Um método baseado em fluorescência para estudar o Regulamento de Gene bacteriano em tecidos infectados

Este artigo fornece um guia passo a passo para investigar a dinâmica de localização subcelular de proteínas e monitorar mudanças morfológicas usando microscopia de fluorescência de alta resolução em Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus.

Microscopia de Fluorescência de células vivas para investigar a localização de proteínas subcelulares e alterações da morfologia celular nas bactérias

Este trabalho apresenta um método de microscopia que permite a imagem viva de uma única célula de Escherichia coli para análise e quantificação do comportamento estocástico de circuitos genéticos sintéticos.

Medição contínua do ruído biológico em Escherichia Coli Usando microscopia de lapso de tempo

Muitas bactérias usam motilidade impulsionada por flagela para navegar em seu ambiente e colonizar ambientes favoráveis tanto individualmente quanto como coletivos. Demonstrado aqui é o uso de três métodos estabelecidos que exploram a motilidade como ferramenta de seleção para identificar componentes/caminhos que contribuem para a natação e a motilidade.

Investigando a Motilidade Impulsionada por Flagella em Escherichia coli aplicando três técnicas estabelecidas em uma série

A persistência de antibióticos descreve a capacidade de pequenas subpopulações dentro de uma população isogênica sensível de tolerar transitoriamente altas doses de antibióticos bactericidas. O presente protocolo combina abordagens para caracterizar o fenótipo de persistência do antibiótico em nível molecular e celular após exposição de Escherichia coli a doses letais de ofloxacina.

Análise Populacional e Unicelular da Persistência de Antibióticos em Escherichia coli

Um desafio de analisar experimentos sincronizados de séries temporais é que os experimentos geralmente diferem na duração da recuperação da sincronia e no período do ciclo celular. Assim, as medidas de diferentes experimentos não podem ser analisadas de forma agregada ou facilmente comparadas. Aqui, descrevemos um método para alinhar experimentos para permitir comparações específicas de fase.

Alinhamento de dados sincronizados de séries temporais usando o modelo de caracterização de perda de sincronia do ciclo celular para comparações entre experimentos

Aprenda a sincronizar células de Caulobacter crescentus usando centrifugação por densidade diferencial. Este método permite isolar células swarmer para estudos bioquímicos e microscopia do ciclo celular bacteriano.

Sincronização de

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