Name: Imagem Vertical de Drosophila Câmaras de ovo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Aprenda a técnica de imagem vertical para visualização detalhada dos pólos das câmaras de ovo de Drosophila melanogaster. Este método permite estudar a organização celular e subcelular do epitélio folicular em alta resolução.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a assistência de membros da comunidade de moscas, particularmente da Dra. Denise Montell, Dra. Lynn Cooley e Dra. Pernille Rorth, para reagentes. Agradecemos à Flybase, ao Bloomington Drosophila Stock Center e ao Developmental Studies Hybridoma Bank pelas informações e pelo fornecimento de estoques de moscas e anticorpos, respectivamente. O LM é apoiado pelo Departamento de Educação Grant, Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) bolsa de treinamento (P200A120017) e por uma Iniciativa NIGMS para Maximizar o Desenvolvimento do Aluno Grant (2 R25-GM55036). Uma parte do trabalho de microscopia foi apoiada pela concessão de ressonância magnética da NSF DBI-0722569 e pelo Keith R. Porter Core Imaging Facility. A pesquisa foi apoiada em parte por um NSF CAREER Award (1054422) e um Basil O'Connor Starter Scholar Award da March of Dimes, ambos concedidos ao MSG.

1. Dissecção da ovaríolos <ol><li> Transferir cerca de quinze 2-4 dias de idade moscas fêmeas e alguns machos a uma mosca frasco fresco alimentos com adição de levedura seca activa. Use algodão como um plug para os frascos, e adicione algumas gotas de água para o algodão para manter a umidade alta. </li><li> Coloque o frasco numa incubadora a 25 ° C durante 14-16 h, para maximizar o número de câmaras de 8-10 fase de ovo. NOTA: O tempo de incubação varia dependendo da temperatura e estágio desejado. </li><li> Prepare a mídia de dissecação, 0,1 M KPO 4 e NP40 soluções conforme necessário para o dia seguinte (ver Materiais). </li><li> Anestesiar as moscas usando CO 2, e colocar sob um microscópio de dissecção. Pipet várias gotas de mídia dissecção em cada cavidade no slide depressão vidro. </li><li> Segure fórceps em cada mão em um ângulo de aproximadamente 30 ° para o topo da tabela e orientar uma mosca fêmea com as asas para baixo. Com a mão não-dominante, pegar a fêmea com a pinça, agarrando-a no anterior do abdômen, perto do tórax, e mergulhe-a para a mídia dissecção na depressão de slides (Figura 1A inserção). </li><li> Com o outro par de fórceps, segure o exoesqueleto no ventral posterior do abdômen e perfurar. Agarre os ovários na extremidade posterior, em seguida, puxe-os para fora do abdômen e coloque no meio fresco, do outro lado do slide depressão. (Figura 1A inserção). Evite puxar para além do intestino. Descarte a carcaça. </li><li> Repita o procedimento com as outras moscas fêmeas até que todos os ovários são dissecados. Descartar os machos. </li><li> Com um par de fórceps, segure um ovário na extremidade posterior (perto das maiores câmaras de ovos), e com a outra mão use uma pinça para beliscar uma das câmaras de ovos mais anteriores (germário). (Figura 1A). </li><li> Lenta e progressivamente, puxe uma cadeia ovaríolo fora da bainha de ovário. Continue a dissecar ovarioles individualmente até que todas as câmaras de ovos desejados são removed. </li><li> Repita os passos de 1,7-1,8 para todos os ovários dissecados. </li><li> Uma vez completo, transferir ovarioles a um tubo de 0,6 ml usando uma pipeta de plástico. </li><li> Vamos ovarioles se depositam no fundo do tubo, em seguida, proceder à fixação e coloração etapas. </li></ol> 2. Immunofluorescent (IF) Coloração de ovaríolos <ol><li> Remova cuidadosamente media dissecção de ovarioles com uma pipeta. Cuidado para não remover quaisquer ovarioles ou câmaras de ovo. Deixe aproximadamente 50 l de ovarioles e meios de comunicação de dissecação. </li><li> Adicionar 50 mL de 16% de paraformaldeído para 150 mL de 0,1 M KPO 4 tampão em um tubo, e adicionar solução para câmaras de ovos para corrigi-los. Incubar, enquanto balançando para 10 min. CUIDADO: paraformaldeído é tóxico. </li><li> Remover fixador e lavar duas vezes com 0,5 ml de tampão de lavagem NP40. </li><li> Lavar duas vezes durante 15 minutos cada à temperatura ambiente. </li><li> Consulte o padrão se o protocolo 15 para as etapas subseqüentes. <ol><li> Resumidamente, após a fixação, adicionarOs anticorpos primários nas diluições apropriadas e incubar O / N a 4 ° C. Lavar em várias vezes NP40, em seguida, adicionar anticorpos secundários (1: 200) diluições. </li><li> Lavar várias vezes em NP40, em seguida, adicionar DAPI (1: 1000) durante 10 min, em seguida, repetir lavagens. Uma vez SE protocolo é completa, adicionar 200 ul de glicerol a 50% em PBS para as câmaras de ovos e deixar repousar à temperatura ambiente durante 2 horas. </li><li> Remova a solução, substitua-o por 70% de glicerol em PBS, e cubra com papel alumínio. Coloque amostra em 4 ᵒC até que esteja pronto para a montagem. Enquanto isso, continue com a etapa 3. </li></ol></li></ol> 3. Preparação Prévia de glicerina geléia Slides <ol><li> Medida pelo menos 4 ml de glicerina geléia com uma espátula e encher um tubo de cultura de células de vidro para a marca de meio caminho. Derreter glicerina geleia num banho de água a 55 ° C durante 30 min. </li><li> Verter uma pequena gota de glicerol, cerca de 300 ul, a partir da solução estoque em duas lâminas de microscópio. Utilizando um tecido, de glicerol em espalhar um la finayer através de cada um dos slides. Isto proporciona uma base e permite a fácil remoção de glicerina geleia no passo 5.6. </li><li> Corte a ponta fora de uma pipeta de ponta 1.000 ul filtrada. Use cut ponteira para transferir 1000-1500 ul de warm geléia glicerina lentamente para cada lâmina de microscópio. Tome cuidado para evitar bolhas. </li><li> Vamos lâminas glicerina geléia sentar por 5 min a RT para definir. </li><li> Coloque cada slide glicerina geléia em 60 mm x 15 milímetros placa de petri e cubra com filme plástico. Coloque a 4 ° CO / N. Opcionalmente, loja glicerina lâminas de geléia para até 5 dias a 4 ° C. </li></ol> 4. Montagem ovo Chambers <ol><li> Usando amostras do passo 2.5, pipeta várias gotas 3 ul de câmaras de ovos em 70% de glicerol através de uma glicerina geléia slide. Continue pipetagem 3 gotas ul até que todas as câmaras de ovos estão neste slide. Certifique-se de cada gota contém, pelo menos, dez câmaras de ovo. Enquanto isso, aqueça um tubo de cultura de glicerina geléia em um banho de água a 55 ° C. </li><li> Coloque o slide glicerina geléia com câmaras de ovo sob um microscópio de dissecção. Ajustar ampliação de modo a que apenas uma gota de câmaras de ovo está no campo de visão (figura 1B). </li><li> Usando uma agulha de calibre 30 como uma colher, pegar a câmara fase de ovo desejado. Quando necessárias, as câmaras de ovo desejados separados de uma cadeia ovaríolo utilizando a agulha, como uma faca. </li><li> Para evitar detritos que podem interferir com a imagem, a câmara de transferência de ovo para a segunda lâmina de glicerina geleia, com o anterior virada para a esquerda (Figura 1E -1). Repetir até que não haja, pelo menos, sete câmaras de ovo alinhados em uma coluna (Figura 1C). </li><li> Formar novas colunas de sete até que todas as câmaras de ovos desejados são transferidos para o segundo slide glicerina geléia. </li><li> Rasgue um pequeno pedaço de tecido e torção. Use-o para absorver o excesso de PBS-glicerol das câmaras de ovo levemente tocando cada um. Tome cuidado para não remover câmaras de ovo. </li><li> Corte oponta de uma pipeta de ponta de 200 ul filtrada. Utilize este para transferir 150 mL de glicerina geléia para cobrir todas as colunas de câmaras de ovo. NOTA: A quantidade de geléia glicerina necessário para cobrir as colunas é baseado em etapas da câmara de ovos e número de colunas. Este valor pode ser ajustado. </li><li> Deixe câmaras de ovos montados sentar-se durante 5 min à temperatura ambiente até que a camada superior de glicerina geleia é completamente solidificado (Figura 1D). </li><li> Colocar a lâmina de câmaras de ovos montados em 60 mm × 15 milímetros placa de petri e cubra com filme plástico. Armazenar a 4 ° CO / N para permitir que as camadas glicerina geléia para solidificar juntos (lugar no escuro, se há uma preocupação com a fotodegradação). </li></ol> 5. Preparação de ovo Chambers for Imaging <ol><li> Coloque slides das câmaras de ovos montados sob um microscópio de dissecção. Ajustar ampliação de modo a que apenas uma coluna de câmaras de ovo está no campo de visão. </li><li> Usando um ângulo de 45 ° bisturi miniatura, corte um straight linha ao longo do lado direito da primeira coluna de câmaras de ovo (próxima da face posterior das câmaras de ovo). (Figura 1D-E) </li><li> Em seguida, cortado por cima da primeira câmara de ovo no topo e por baixo da última câmara de ovo na coluna. Neste ponto, a coluna de câmaras de ovo deve ser cortada em três lados. </li><li> Usando um microlanceta, corte ao longo do lado esquerdo da coluna, tão perto quanto possível do lado anterior das câmaras de ovo (Figura 1E) -3. </li><li> Pipetar 100 mL de frio 1X PBT sobre a coluna corte. </li><li> Use uma espátula rodada gumes para remover o excesso de geléia glicerina em torno de três lados da coluna corte de câmaras de ovo e descartar, deixando o resto no slide. </li><li> Insira a espátula no corte feito na face anterior das câmaras de ovos e separar a coluna do bloco de glicerina geléia primária. </li><li> Preparar amostras em posição invertida (5.8.1) ou vertical (5.8.2) de microscopia para qualquer um. <ol><li> Para microscópio invertido: t Transferênciaele coluna de câmaras de ovos para uma lamela com face anterior das câmaras de ovo virado para baixo. Repita os passos 5,2-5,8 até que todas as colunas de glicerina geleia foram removidos e montados. Adicione um par de gotas de 50% PBS-glicerol para cada bloco de câmaras de ovos para evitar que sequem. Câmaras de ovos imagem diretamente sobre lamela. </li><li> Para microscópio vertical: Transferir a coluna de câmaras de ovo para uma lâmina de microscópio com o lado anterior para cima. Repita os passos 5,2-5,9 até que todas as colunas de glicerina geleia foram removidas e montadas em lâminas de microscópio. Adicione um par de gotas de 50% PBS-glicerol para cada bloco de câmaras de ovo e blocos de cobertura com uma lamela ½ # 1. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68 (1), 207-217 (2014).</li>
<li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila oogenesis.</a> Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li>
<li>Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+follicle+cells%3A+morphogenesis+in+an+eggshell%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell.</a> Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).</li>
<li>Bilder, D., Haigo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+morphogenetic+repertoire%3A+perspectives+from+the+Drosophila+egg%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg.</a> Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).</li>
<li>Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+choreography%3A+mechanisms+orchestrating+the+collective+movement+of+border+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).</li>
<li>Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).</li>
<li>Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Border-cell+migration%3A+the+race+is+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Border-cell migration: the race is on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).</li>
<li>Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+JAK%2FSTAT+signaling+throughout+border+cell+migration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila.</a> Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).</li>
<li>Ghiglione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+cytokine+receptor+Domeless+controls+border+cell+migration+and+epithelial+polarization+during+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis.</a> Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).</li>
<li>Denef, N., Schüpbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning%3A+JAK-STAT+signalling+in+the+Drosophila+follicular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium.</a> Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).</li>
<li>Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAK%2FSTAT+pathway+is+required+for+border+cell+migration+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis.</a> Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).</li>
<li>Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((slow+border+cells%2C+a+locus+required+for+a+developmentally+regulated+cell+migration+during+oogenesis%2C+encodes+Drosophila+C%2FEBP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP.</a> Cell. 71 (1), 51-62 (1992).</li>
<li>Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gradient+of+JAK+pathway+activity+patterns+the+anterior-posterior+axis+of+the+follicular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium.</a> Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).</li>
<li>McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+EGFR+ligands+participate+in+guiding+migrating+border+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells.</a> Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).</li>
<li>Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+localisation+of+cytokine+mRNA+is+essential+for+JAK%2FSTAT+activation+during+cell+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness.</a> Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).</li>
<li>Hayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glypicans+regulate+JAK%2FSTAT+signaling+and+distribution+of+the+Unpaired+morphogen%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen.</a> Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).</li>
<li>Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+protein+movement+in+syncytial+Drosophila+follicle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells.</a> J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).</li>
<li>Rørth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+gain-of-function+genetics+in+Drosophila%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Systematic gain-of-function genetics in Drosophila).</a> Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).</li>
<li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies%3A+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).</li>
<li>Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+response+of+protein+localization+and+microtubule+organization+to+nutrient+stress+during+Drosophila+early+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis.</a> Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).</li>
<li>Quiñones-Coello, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+strategies+for+protein+trapping+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Exploring strategies for protein trapping in Drosophila.</a> Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).</li>
<li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carnegie+protein+trap+library%3A+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).</li>
<li>Belu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upright+imaging+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Upright imaging of Drosophila embryos.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li>
<li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-on+imaging%3A+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui nós descrevemos um método para montar e pequena imagem, o desenvolvimento de câmaras de ovos de uma perspectiva end-on. Técnicas comuns para câmaras de ovos de imagem são otimizados para vistas laterais e permitir principalmente a visualização precisa das células do folículo medio-lateral quando coradas com anticorpos fluorescentes. O uso de Z-stacks ou 3-D reconstruções auxilia na visualização de vários planos focais, mas ainda é insuficiente para a resolução de sub-celular dos pólos de câmaras de ovos elípticos <...

Estudo da Drosophila melanogaster tem proporcionado grandes insights sobre a regulação genética de uma ampla gama de fenômenos. Em particular, tem havido uma extensa pesquisa sobre o desenvolvimento do ovo, porque oogenesis fornece uma maneira dócil para investigar vários processos de desenvolvimento diferentes, incluindo padrões de tecidos, alterações de polaridade celular, comutação do ciclo celular, e regulação de translação 1,2,3,4. Um evento morphogenic importante durante oogenesis é a especificação, aquisição de motilidade, e migração de um conjunto de células, chamadas de células de fronteira (revisto em 5). Uma vez que a migração celular é uma característica fundamental da morfogénese dos animais, e porque a regulação genética do presente processo é bem conservada, determinados mecanismos de moscas são susceptíveis de ser importante em outros contextos. Assim, estamos investigando o controle molecular da migração celular fronteira. Para os nossos estudos, desenvolvemos um novo método para observar os pólos anterior de desenvolvimento de ovos,onde surgem as células de fronteira, para examinar como elas se desenvolvem em detalhe. Dentro do ovário, câmaras de ovo em várias fases de desenvolvimento existir ao longo das cadeias chamadas ovarioles, que são envolvidas por uma bainha fina (Figura 1A). Cada câmara ovo vai continuar a formar um ovo. Durante oogenesis, vários tipos de células diferentes deve desenvolver-se de forma coordenada. O D. câmara melanogaster ovo é composto por 16 células germinativas, incluindo um oócito, cercado por uma única camada de epitélio folicular 6. Um pequeno número de células especializadas, chamadas células polares, surgem as anteriores e posteriores pólos do epitélio. As células de fronteira 6-8 originam no epitélio anterior da câmara de ovo, induzida pelas células polares 5,7. Em meados de oogénese (etapa 9), as células de fronteira desanexar das suas vizinhas e migram entre as células de enfermagem para atingir o oócito na parte posterior da câmara do ovo 5,7. Este movimento deve ser realizadoenquanto que as células permanecem na fronteira um cluster circundante duas células polares não-móveis, tornando este um tipo de migração celular colectiva. Migração bem-sucedida do grupo de células de fronteira garante o bom desenvolvimento da micrópila da casca do ovo, que é necessário para a fertilização. As células polares anteriores instruir destino celular fronteira ativando uma cascata de transdução de sinal. Células polares secretar uma citocina, Unpaired (UPD), que se liga a um receptor de membrana, Domeless (DOME), na vizinha células foliculares durante a fase de desenvolvimento do oócito 8 8,9. A ligação da UPD provoca Janus tirosina quinase (JAK) para fosforilar o transdutor de sinal e ativador de transcrição (STAT) 8,10,11. STAT, em seguida, move-se para o núcleo para activar a transcrição. Células de Fronteira lenta (SLBO) é um fator de transcrição que é um alvo direto da transcrição do STAT e também é necessário para a migração celular fronteira 12. Vistas laterais de câmaras de ovos indicam tatividade STAT chapéu é regulada em um gradiente através do epitélio anterior 8,11,13. Células do folículo mais próximos às células polares têm os mais altos níveis de STAT ativado, assim, tornam-se células de fronteira e invadir o tecido germinal adjacente. Para entender como as células de fronteira são especificados dentro e destacar do epitélio, precisamos observar como o tecido é organizado. Se virmos câmaras de ovos de uma perspectiva anterior-on, esperaríamos simetria radial da atividade STAT nas células foliculares que cercam as células polares. Um fim-em vista também mostram mais precisamente as diferenças de proteínas de membrana e interfaces célula-célula antes e durante o descolamento do que comparando células em diferentes planos focais. Porque câmaras de ovo são oblongas e ligados uns aos outros por células pedunculares, estabelecem-se em lâminas lateralmente, tornando-o difícil de observar a arquitectura anterior. Assim, muita informação sobre as células nos pólos da câmara de ovo temsido inferida a partir de vistas laterais. Embora algumas informações podem ser obtidas através de algoritmos reconstruções 3-D de secções ópticas, espalhamento de luz, fotodegradativas e limites mais pobres da resolução no eixo Z tornar essa informação menos detalhada e confiável na ausência de técnicas caras, como microscopia de super-resolução 14 . Outros tipos de imagem baseado em seção (por exemplo, microscopia eletrônica ou microtome seccionamento) exigem extensa manipulação de tecidos, incluindo a desidratação, aumentando a probabilidade de artefatos. Assim, foi desenvolvido um novo método para a imagem D. câmaras melanogaster ovos, enquanto na posição vertical. Este método já provou útil para elucidar como células móveis estão fadados (ver resultados representativos e Manning et al, em revisão), e é provável que seja mais amplamente útil em estudos de outros aspectos da oogenesis.

<table><tbody><tr><td>0,1 M Tampão fosfato de potássio (KPO4 Buffer)</td><td></td><td></td><td>Adicione 3,1 g de NaH2PO4&bull; H2O e 10,9 g de Na2HPO4 (anidro) a H2O destilado para perfazer um volume de 1 L. O pH da solução final será 7,4. Este buffer pode ser armazenado por até 1 mês a 4 graus C.</td></tr><tr><td>Solução aquosa de paraformaldeído a 16%, grau EM</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>15710</td><td>livre de metanol para preservar a fluorescência GFP</td></tr><tr><td>Agulha de 30G x 1/2 polegada&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD305106</td><td>Levedura Seca Ativa de Bisel Regular</td></tr><tr><td></td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td>Para engordar moscas fêmeas</td></tr><tr><td>Albumina de soro</td><td>bovino PAA-cell culture company</td><td>A15-701</td><td>Usado no tampão de lavagem NP40</td></tr><tr><td>Fórceps Dumont #5 Fine</td><td>Science Tools</td><td>11295-10</td><td>Liga Dumostar, ponta biologie; pontas afiadas são essenciais para a dissecção</td></tr> <tr><td>do ovárioDAPI (4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>5 mg/ml solução estoque&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td>Adicionado ao meio de dissecção suplementar (10%)&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de cultura de vidro</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td>14 ml</td></tr><tr><td>Lâminas de Depressão de Vidro</td><td>VWR</td><td>470019-020</td><td>1,2 mm de Espessura,</td></tr><tr><td>Geleia de Glicerina de Cavidade Dupla&nbsp;</td><td>Electron Microsocpy Sciences</td><td>17998-10</td><td>Mídia de montagem</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>IBI Scientific</td><td>IB15760</td><td>70% em PBS</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-500ML(</td><td>intercambiável para Nonidet P-40)&nbsp; Usado em Tampão de Lavagem NP40&nbsp;</td></tr><tr><td>Estereoscópio Fluorescente Leica&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal Leica SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>40x/0.55NA objetiva seca&nbsp;</td></tr><tr><td>Micro espátula&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82027-518 Lâmina de</td> microscópio <td>em aço inoxidável</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td>75x25x1 mm</td></tr><tr><td>NP40 Tampão</td><td></td><td></td> de lavagem <td>50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0,5% Ipegal, 1 mg/ml BSA e 0,02% azida sódica</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina-Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>Adicionado ao meio de dissecção suplementar (0,6X)</td></tr><tr><td>Petrídiche- Poliesterina, estéril</td><td>VWR</td><td>82050-548</td><td>60 W x 15 H mm</td></tr><tr><td>Tampão de Fosfato Salino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td>10 pacotes de fosfato</td></tr><tr><td>de potássio dibásico</td><td>em pó Sigma Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>Usado em 0.1 M KPO4 Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791-500G</td><td>Usado em 0.1 M KPO4 Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[cabeçalho]</td></tr><tr><td>Schneider' s Insect Medium</td><td>Life Technologies</td><td> 11720018</td><td>Com L-glutamina e bicarbonato de sódio</td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>Usado na coloração de anticorpos fluorescentes</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td>Usado no tampão de lavagem NP40</td></tr><tr><td>TRIS-HCl</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70144</td><td>1 M TRIS-HCl, pH 7,4</td></tr><tr><td>Volocidade Imagem 3D Software de análise</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>para processamento de pilhas Z confocais</td></tr></tbody></table>

imagem vertical de<em&gt; drosophila</em&gt; câmaras de ovo

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

A oogênese de Drosophila melanogaster fornece um contexto ideal para estudar processos de desenvolvimento variados, uma vez que o ovário é relativamente simples em arquitetura, é bem caracterizado e é passível de análise genética. Cada câmara de ovo consiste em células germinativas cercadas por uma única camada epitelial de células foliculares somáticas. Subconjuntos de células foliculares sofrem diferenciação durante estágios específicos para se tornarem vários tipos de células diferentes. As técnicas padrão permitem principalmente uma visão lateral das câmaras de óvulos e, portanto, uma visão limitada da organização e identidade das células foliculares. O protocolo de imagem vertical descreve uma técnica de montagem que permite uma nova visão vertical das câmaras de ovos com um microscópio confocal padrão. As amostras são primeiro montadas entre duas camadas de geléia de glicerina em uma posição lateral (horizontal) em uma lâmina de microscópio de vidro. A geléia com câmaras de ovos envoltas é então cortada em blocos, transferida para uma lamínula e virada para posicionar as câmaras de ovos na vertical. As câmaras de ovos montadas podem ser visualizadas em um microscópio confocal vertical ou invertido. Essa técnica permite o estudo da especificação, organização, marcadores moleculares e desenvolvimento de óvulos das células foliculares com novos detalhes e de uma nova perspectiva.

O método de imagem na vertical nos permitiu ver diretamente a organização das células do epitélio folicular anterior na fase 8. Um marcador geral para o destino células do folículo, o Absent Eyes (EJA) de proteínas, bem como o marcador de DNA nuclear DAPI, mostrou ainda expressão através deste campo de células, e demonstrou que todas as células podem ser vistos com intensidades de coloração semelhante (Figura 2B &quot;). As proteínas reguladas, em resposta à UPD citoquina, no entanto, mostraram padrões ...

O método de imagem vertical descrito neste protocolo permite a visualização detalhada dos pólos de um ovo de Drosophila melanogaster em desenvolvimento. Essa visão final fornece uma nova perspectiva sobre os arranjos e morfologias de vários tipos de células no epitélio folicular.

Imagem Vertical de<em&gt; Drosophila</em&gt; Câmaras de ovo

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

O objetivo geral deste procedimento é permitir a obtenção de imagens de alta resolução dos polos das câmaras oocíticas de drosófila. Isso é realizado primeiramente pela dissecação dos ovários e sua coloração com anticorpos fluorescentes. O segundo passo consiste em identificar e separar as câmaras oocíticas de interesse.As amostras selecionadas posteriormente são orientadas e alinhadas, e então embutidas em blocos de gelatina glicerinada. O passo final consiste em cortar e rotacionar os blocos para montar as câmaras ovocitárias de modo que o eixo longo fique na posição vertical. Por fim, a microscopia confocal é utilizada para revelar a organização celular e subcelular nos polos da câmara ovocitária.Epitélio, como arranjos de células de borda, Métodos existentes para visualizar espécimes perpendicularmente ao plano de imagem por meio de seccionamento óptico e reconstrução algorítmica em 3D podem causar fotobranqueamento e dispersão da luz e fornecem resolução inferior, o que resulta em imagens menos precisas. A principal vantagem desta técnica é que ela nos permite montar espécimes em um novo ângulo e visualizá-los diretamente. Utilizamos esta técnica para imagens dos polos de câmaras de ovos em desenvolvimento, o que forneceu informações sobre a organização das células foliculares.A demonstração visual deste método é essencial, pois os passos de preparação e montagem são difíceis de aprender, já que exigem micro manipulação de espécimes corados e reorientação das amostras em relação aos pontos de vista convencionais. A demonstração do procedimento será feita por Lathea Manning, aluna de pós-graduação no meu laboratório. Para iniciar o experimento, obtenha uma lâmina de vidro com cavidade e pipete várias gotas de meio de dissecação em cada cavidade.Anestesie as moscas com dióxido de carbono e coloque-as sob um microscópio de dissecação. Em seguida, posicione uma mosca fêmea com as asas para baixo e a cabeça voltada para a esquerda. Segure a pinça em cada mão em um ângulo de 30 graus em relação à superfície da mesa, utilizando a mão não dominante.Pegue a mosca usando pin&ccedil;as. Segure a mosca na parte anterior do abd&ocirc;men, pr&oacute;xima ao t&oacute;rax, e mergulhe-a no meio de disseca&ccedil;&atilde;o. No l&acirc;mina de depress&atilde;o, use o outro par de pin&ccedil;as.Segure o exoesqueleto na região ventral posterior do abdômen e perfure-o. Agarre os ovários na extremidade posterior, então puxe-os para fora do abdômen e coloque-os no meio fresco do outro lado da lâmina com depressão. Em seguida, segure um ovário pela extremidade posterior, próxima às câmaras ovulares maiores, e com a outra mão, pinçe lentamente e com firmeza uma das câmaras ovulares mais anteriores ou o jammer.Retire uma cadeia de ovários da bainha ovariana e continue a dissecar os ovários individualmente até que todas as câmaras de ovo desejadas sejam removidas. Após a conclusão da dissecação, utilize uma pipeta de transferência de plástico para transferir o ovário para um tubo de 0,6 mililitro e deixe o ovário sedimentar no fundo do tubo. Com o auxílio de uma pipeta, remova cuidadosamente o máximo possível do meio de dissecação do ovário.Tenha cuidado para não remover nenhum ovário ou câmaras de ovos em um tubo novo. Adicione 50 microlitros de paraformaldeído 16% a 150 microlitros de tampão de fosfato de potássio 0,1 molar e adicione esta solução às câmaras de ovos. Incube-as sob agitação por 10 minutos. Após a incubação, remova o fixador.Lave duas vezes com tampão NP-40, depois lave sobre as réplicas duas vezes com 0,5 mililitros de tampão NP-40 durante 15 minutos cada, à temperatura ambiente. Após a fixação e lavagem, adicione os anticorpos primários e incube o tubo durante a noite a quatro graus Celsius ou por três horas à temperatura ambiente após a incubação. Lave as amostras quatro vezes, durante 20 minutos cada, com 0,5 mililitros de tampão NP-40 à temperatura ambiente.Em seguida, adicione anticorpos secundários em uma diluição de 1:200 e incube o tubo por três horas ou durante a noite a quatro graus Celsius. A seguir, adicione DPI em uma diluição de 1:1000 e incube o tubo por 10 minutos. Então, lave as amostras quatro vezes com 0,5 mililitros de tampão de lavagem NP 40, durante 20 minutos por lavagem, em temperatura ambiente.Após a conclusão do protocolo de imunofluorescência ou IF, adicione 200 microlitros de glicerol a 50% em PBS aos câmaras ovulares e deixe repousar à temperatura ambiente por duas horas, protegidos da luz. Remova a solução, substitua por glicerol a 70% em PBS e cubra o tubo com papel alumínio. Armazene as amostras a quatro graus Celsius até o momento de montagem.Para preparar a amostra de gelatina de glicerina, retire uma alíquota da gelatina de glicerina com uma espátula para encher até a metade um tubo de cultura de vidro Pyrex de 15 mililitros; derreta a gelatina de glicerina em banho-maria a 55 graus Celsius por 30 minutos. Enquanto isso, coloque uma gota de 300 microlitros de glicerol da solução estoque sobre duas lâminas de microscópio. Com um papel absorvente, espalhe o glicerol em uma camada fina sobre cada uma das lâminas.Para fornecer uma base que permita a remoção fácil da gelatina de glicerina. Verifique se a gelatina de glicerina está completamente derretida. Em seguida, corte a ponta de uma ponteira de pipeta filtrada de 1000 microlitros e transfira de 1000 a 1.500 microlitros de gelatina de glicerina morna lentamente para cada lâmina de microscópio, tomando cuidado para evitar a formação de bolhas.Deixe as lâminas de gelatina glicerina repousarem por cinco minutos à temperatura ambiente para solidificar cada lâmina de gelatina glicerina. Coloque cada lâmina em uma placa de Petri de 60 milímetros por 15 milímetros. Cubra a placa com filme plástico e armazene as lâminas a quatro graus Celsius durante a noite.Pipete várias gotas de três microlitros de câmaras de ovos das amostras previamente preparadas em glicerol a 70% sobre uma lâmina de gelatina glicerínica. Continue pipetando gotas de três microlitros até que todas as câmaras de ovos estejam sobre a lâmina, certificando-se de que cada gota contenha pelo menos 10 câmaras de ovos. Em seguida, aqueça o tubo de cultura com gelatina glicerínica em banho-maria a 55 graus Celsius, coloque uma lâmina de gelatina glicerínica com câmaras de ovos sob um microscópio estereoscópico e ajuste a ampliação de modo que apenas uma gota de câmaras de ovos fique no campo de visão.Usando uma agulha de 30 como colher, pegue a câmara de ovo do estágio desejado quando necessário. Separe as câmaras de ovo desejadas de uma cadeia ovariana usando a agulha como uma faca, para evitar detritos que possam interferir na obtenção de imagens. Transfira a câmara de ovo para a segunda lâmina de gelatina glicerada.Repita este passo até que haja pelo menos sete câmaras de ovos alinhadas em uma coluna, com os lados anteriores voltados para a esquerda. Remova detritos ou câmaras de ovos indesejadas com a agulha, formando novas colunas de sete, até que todas as câmaras de ovos desejadas sejam transferidas para a segunda lâmina de gelatina de glicerina. Enrole um pequeno pedaço de papel absorvente Kimwipe e, em seguida, absorva o excesso de PBS com glicerol das câmaras de ovos tocando levemente cada uma. Tenha cuidado para não remover nenhuma câmara de ovo.Corte a ponta de uma ponteira de pipeta filtrante de 200 microlitros e transfira 150 microlitros de gelatina glicerinada para cobrir todas as colunas das câmaras de ovos. Verifique ao microscópio se todas as colunas das câmaras de ovos estão cobertas. Deixe as câmaras de ovos montadas em repouso por cinco minutos à temperatura ambiente até que a camada superior da gelatina glicerinada tenha solidificado completamente.Em seguida, coloque uma lâmina com câmaras de ovos montadas em uma placa de Petri de 60 milímetros por 15 milímetros e cubra-a com filme plástico. Armazene a placa a quatro graus Celsius durante a noite para permitir que as camadas de gelatina glicerínica solidifiquem juntas no escuro. Se houver risco de fotodesvanecimento, coloque uma lâmina com as câmaras de ovos montadas sob um microscópio estereoscópico.Ajuste a ampliação para que apenas uma coluna de câmaras de ovos esteja no campo de visão. Usando um escalpelo miniatura em um ângulo de 45 graus, faça uma linha reta ao longo do lado direito da primeira coluna de câmaras de ovos, próxima ao lado posterior das câmaras de ovos.Em seguida, corte acima da primeira câmara de ovo na parte superior e abaixo da última câmara de ovo na coluna, de modo que as câmaras de ovo fiquem agora cortadas em três lados. Use uma microtesoura para fatiar ao longo do lado esquerdo da coluna, o mais próximo possível do lado anterior das câmaras de ovo. Em seguida, pipete 100 microlitros de XPBT frio sobre a coluna cortada com uma placa redonda e sua espátula.Remova o excesso de gelatina de glicerina ao redor dos três lados da coluna cortada de câmaras de ovos e descarte o excesso. Insira a espátula no corte feito no lado anterior das câmaras de ovos e separe a coluna do bloco principal de gelatina de glicerina para montagem em uma lâmina e prossiga com a obtenção de imagens. O método de imagem em posição vertical permite a visualização direta da organização das células no epitélio folicular anterior no estágio oito.Um marcador geral para o sulfato do folículo, a proteína ausente nos olhos ou IA, bem como o marcador de DNA nuclear DPI mostram expressão uniforme em todo este campo de células e demonstram que todas as células podem ser visualizadas com intensidades de coloração semelhantes. A visão convencional de uma câmara de ovo contrasta com a visão obtida por meio de uma reconstrução tridimensional da câmara de ovo. O quadro interno mostra o eixo girado.O eixo x está para baixo. O eixo z está agora voltado para a esquerda, e o eixo y está voltado para o observador. As células individuais estão desfocadas devido à baixa resolução no eixo z.Assim, a nova abordagem representa uma melhoria significativa na imagem. O método de imagem em posição ereta visualiza efetivamente o epitélio anterior em câmaras de ovo no estágio nove. Nesta fase de desenvolvimento, as células de borda se agregam ao redor das células polares.Esses aglomerados compactados são observados com a imagem de endon. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar amostras para permitir novas perspectivas de visualização. Utilizamos esta técnica para imagens dos polos de câmaras de ovos em desenvolvimento em estágios selecionados.Essa técnica geral poderia ser utilizada em outros estágios da drosófila, na oogênese ou em outros tipos de tecidos pequenos.

upright-imaging-of-drosophila-egg-chambers

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Mesoscópica fluorescência tomografia opera além dos limites de penetração de tecido de corte de microscopia de fluorescência. A técnica é baseada na projeção multi-iluminação e uma descrição do transporte de fótons. Demonstramos in-vivo visualização de corpo inteiro em 3D da morfogênese da GFP-expressando asa em discos...

Mesoscópica de fluorescência para Tomografia In-vivo Imaging de desenvolvimento Drosophila</em

Hemócitos Drosophila dispersam sobre a totalidade do embrião em desenvolvimento. Este protocolo demonstra como montar e imagem essas migrações usando embriões com hemócitos fluorescente etiquetado.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Aqui apresentamos um protocolo de montagem para...

Imagem vertical de Drosophila Os embriões

Drosophila Imunohistoquímica Abdomen Pupal

Preparação Individual Drosophila Ovos Câmaras de imagens ao vivo

A imunocoloração é uma técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células e proteínas dentro dos tecidos. Ao utilizar a sonicação, o protocolo descrito aqui alivia a necessidade de dissecar tecidos de Drosophila melanogaster de embriões e larvas em estágio avançado antes da imunocoloração. Fornecemos uma metodologia eficiente para a imunocoloração de larvas de montagem inteira fixadas em formaldeído.

Facilitou-Sonication Imunofluorescência Coloração de Late-estágio embrionário e larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos<em&gt; In Situ</em

Este protocolo apresenta um método eficiente para obter imagens do neuroepitélio do olho pupal de Drosophila vivo. Este método compensa o movimento do tecido e a topologia irregular, melhora a visualização dos limites celulares por meio do uso de várias proteínas de junção marcadas com GFP e usa um equipamento de imagem facilmente montado.

Vivo-imaging da Drosophila Pupal Eye

Este artigo descreve um protocolo adaptável ex vivo para a visualização de Ca2 + durante a ativação do ovo em Drosophila.

Imagens de cálcio na<em&gt; Drosophila</em&gt; At Activation Egg

Este protocolo é projetado para a imagem e análise da dinâmica da orientação celular e crescimento tecidual na epitélia abdominal Drosophila à medida que a mosca-das-frutas sofre metamorfose. A metodologia aqui descrita pode ser aplicada ao estudo de diferentes estágios de desenvolvimento, tecidos e estruturas subcelulares em Drosophila ou outros organismos modelo.

Imagem e Análise da Dinâmica de Orientação e Crescimento tecidual na Epitélia Drosophila em Desenvolvimento durante os estágios pupal

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para realizar imagens ao vivo da divisão assimétrica de células-tronco germinativas (GSCs) no nicho ovariano de Drosophila. Usamos uma linhagem transgênica que expressa de forma ubíqua uma fusão de proteína fluorescente verde (GFP) da proteína do espectrossomo Par-1.

Imagem ao vivo estendida de nichos de células-tronco germinativas de Drosophila melanogaster fêmea

Aprenda a técnica de imagem vertical para visualização detalhada dos pólos das câmaras de ovo de Drosophila melanogaster. Este método permite estudar a organização celular e subcelular do epitélio folicular em alta resolução.

Imagem Vertical de

Explorar mais vídeos