Um Procedimento craneotomia Lateral Grande para Wide-campo Mesoscale imagens ópticas de atividade cerebral

O objetivo geral dessa craniotomia lateral ampla é realizar imagens em tempo real em uma área extensa de um hemisfério cortical. A principal vantagem dessa técnica é que grandes áreas do córtex são expostas para observação e podem ser utilizadas em conjunto com tecnologias como a optogenética. Essa técnica pode fornecer insights sobre a caracterização da dinâmica neural entre células, bem como entre diferentes circuitos cerebrais, em diferentes resoluções temporal e espacial.

A demonstração visual deste método é essencial devido ao aumento do risco de hemorragia e dano cortical, já que a dura-máter geralmente está aderida à superfície cerebral e aos vasos sanguíneos. Este método pode ser aplicado para estudar os mecanismos neurobiológicos subjacentes ao desenvolvimento dos circuitos cerebrais e suas alterações ao longo da vida em resposta a novas experiências ou patologias, como a Doença de Alzheimer ou acidente vascular cerebral. Para iniciar este procedimento, autoclave todos os materiais cirúrgicos e assegure que a esterilidade seja mantida durante toda a cirurgia.

Certifique-se de que há quantidade suficiente de solução encefálica para a cirurgia. Em seguida, transfira um camundongo anestesiado para o suporte do crânio e coloque-o sobre uma plataforma aquecida com regulação térmica ajustada a 37 graus Celsius. Fixe os dentes superiores do camundongo no suporte para dentes.

Em seguida, gire a cabeça em direção ao lado esquerdo aproximadamente 30 graus para expor o lado lateral direito da cabeça. Posteriormente, fixe a cabeça do camundongo com a extremidade romba das hastes auriculares. Em seguida, aplique uma pomada oftálmica para prevenir a secagem da córnea.

Para reduzir o edema cerebral, injete dexametasona a quatro miligramas por quilograma por via intramuscular. Limpe a pele sobre a área cirúrgica com cotonetes embebidos em clorexidina 4% três vezes e, em seguida, com álcool 70% três vezes. Injete lidocaína por via subcutânea sobre o local da craniotomia.

Sob um microscópio estereoscópico, levante a pele a um milímetro à esquerda da linha média logo atrás da orelha com uma pinça e faça uma pequena incisão horizontal com tesoura cirúrgica. Faça um corte lateral de cinco a seis milímetros em direção à orelha direita e, em seguida, corte em direção à extremidade rostral da cabeça. No ponto da incisão inicial, insira a tesoura e corte 10 milímetros em direção rostral.

Em seguida, corte a pele ao redor da orelha direita e próximo ao olho direito para expor o lado direito do crânio e do músculo temporal. Certifique-se de que a parte mais larga da área exposta tenha pelo menos sete milímetros. Depois, retire mais pele se for necessário ampliar a área cirúrgica.

Usando um cotonete, esfregue a superfície do crânio em movimento circular para remover o periósteo do crânio. Certifique-se de que não reste nenhum periósteo e de que o crânio esteja completamente seco, o que é essencial para a fixação bem-sucedida da placa craniana. Em seguida, usando tesoura de mola e pinça, separe o músculo temporal do crânio.

Corte e retrai o músculo lateralmente até alcançar o osso esquamosal. Tenha extremo cuidado para não danificar a veia temporal superficial que percorre o nível do osso esquamosal próximo ao olho, caso contrário pode ocorrer hemorragia. Controle o sangramento com espuma de gel pré-embebida em tampão cerebral.

Para hemorragia grave, utilize um cauterizador térmico. Aplique cola de butil cianoacrilato sobre os locais de sangramento. Para iniciar este procedimento, marque primeiro o bregma para orientar as regiões cerebrais subjacentes, aplique cola de etil cianoacrilato ao redor da borda inferior da placa craniana e fixe a placa sobre a área da craniotomia.

Em seguida, preencha o espaço aberto entre o crânio e a placa craniana com cimento dental, deixando exposta apenas a área da craniotomia. Depois, aguarde o cimento dental secar e endurecer. Posteriormente, delimite a região da janela craniana fazendo pequenos cortes na superfície do crânio com a broca odontológica.

Trace suavemente a broca ao longo do sulco original para aprofundá-lo, garantindo que a broca não penetre através do crânio até o cérebro. Enquanto isso, alterne entre a perfuração e a aplicação na superfície do crânio com tecidos enrolados umedecidos a cada poucos minutos. Esse início muito desafiador exige que os cirurgiões perfurem o crânio envelhecido para soltá-lo e removê-lo sem danificar o córtex subjacente.

Lento é solto, suave é rápido. Durante a perfuração, verifique periodicamente a presença de encurvamento do crânio pressionando-o suavemente com pinça ou com a ponta da broca parada. Quando o osso começar a se encurvar, interrompa a perfuração e imerja completamente a janela em tampão cerebral.

Aguarde pelo menos cinco minutos antes da remoção do crânio para amolecer o osso e reduzir a chance de a dura mater aderir ao osso, facilitando o processo de remoção do crânio. Em seguida, realize a remoção do crânio começando pela borda anterior. Levante suavemente o crânio solto da dura mater utilizando pinça.

Uma vez que o osso esteja solto e flutuando sobre a dura-máter, segure-o firmemente com pinça e levante-o para longe da dura-máter. Certifique-se de que o osso nunca penetre no cérebro. Use pinça e tesoura de mola para rasgar e cortar suavemente a dura-máter.

Deve-se ter cuidado para garantir que o parênquima cerebral e os vasos sanguíneos não sejam danificados. Continue até que toda a dura-máter seja removida do local da janela craniana. Quando realizado corretamente, o cérebro parecerá muito limpo, com vasos sanguíneos bem definidos e sem imperfeições.

Pulverize a lamínula com etanol 70% e use uma lata de ar comprimido para secar suavemente. Certifique-se de que o vidro esteja completamente limpo, sem manchas ou poeira. Em seguida, prepare agarose 1,3% aquecendo 200 miligramas de pó de agarose dissolvidos em 15 mililitros de tampão cerebral.

Coloque um termômetro no agarose quente e resfrie o agarose até logo acima da temperatura de solidificação, cerca de 40 graus Celsius. O resfriamento pode ser acelerado passando água fria sobre o tubo, tomando cuidado para não permitir que água entre em contato com o agar. Agite suavemente com o termômetro enquanto monitora sua temperatura.

Imediatamente antes de aplicar o ágar, remova o tampão do cérebro do poço craniano. Certifique-se de que não haja bolhas ou partículas presentes, pois estas interferirão na obtenção de imagens. Agora, aspire a agarose com uma pipeta de transferência e deixe cair a agarose diretamente sobre o cérebro.

Em seguida, coloque rapidamente a lamínula sobre a superfície e fixe-a com gotas de agarose nas bordas. Aqui é mostrada uma microfotografia da craniotomia unilateral ampla, com o bregma indicado por um círculo branco em cada imagem. Os padrões de ativação cortical são mostrados em um camundongo anestesiado com isoflurano 0,5% após estimulação dos vibrissas contralaterais, estimulação auditiva, estimulação da pata dianteira contralateral, estimulação da pata traseira contralateral e estimulação visual do olho contralateral com um diodo emissor de luz.

Houve ativação da linha média a partir de todas as formas de estimulação sensorial entre 10 e 25 milissegundos após a ativação do córtex sensorial primário. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em três a quatro horas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de minimizar a perda sanguínea e garantir que o córtex não seja danificado.

Utilizando este procedimento, outras técnicas de imagem, como a imagem óptica, podem ajudar a responder perguntas importantes, como a forma como a atividade espontânea influencia a dinâmica neural no cérebro normal e doente. Após seu desenvolvimento, esta técnica ajudou a abrir caminho para pesquisadores na área da neurociência de sistemas explorarem interações e dinâmicas neurais entre regiões corticais amplamente separadas em camundongos. Este vídeo mostra como realizar uma craniotomia lateral ampla em camundongos com perda sanguínea mínima e dano cortical, permitindo coletar os dados necessários para responder suas perguntas científicas mais urgentes.