Name: EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. Parte III. Detecção de vírus por RT-qPCR (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Aprenda a quantificar enterovírus e norovírus em amostras de água usando RT-qPCR e ultrafiltração centrífuga. Este método padronizado da EPA oferece recuperação média de 20% a 30% para avaliação da qualidade da água.

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Os autores agradecem ao Dr. Eric Rhodes pela preparação dos clones usados no desenvolvimento do reagente de curva padrão, Brian McMinn pela assistência no processamento da amostra, Larry Wymer pela análise estatística, Dr. Mark Borchardt, Departamento de Agricultura dos EUA, Marshfield, WI, por fornecer o sorovírus Sabin poliovírus 3 usado neste estudo e ao Dr. H. W. Virgin, Universidade de Washington, St. Louis, MO, para norovírus murino. Os autores também agradecem a Gretchen Sullivan pela assistência na preparação de reagentes de laboratório de estoque, ao Dr. Mohammad Karim pela propagação de estoques de norovírus murinos e aos proprietários de poços privados locais e concessionárias por nos permitirem coletar amostras de água. Embora este trabalho tenha sido revisado pela EPA e aprovado para publicação, ele pode não refletir necessariamente a política oficial da Agência. A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais não constitui endosso ou recomendação de uso.

Nota: folhas de dados usar para acompanhar todas as etapas do protocolo; folhas exemplo de dados são indicadas nas tabelas de materiais suplementares S2-S4. 1. Preparação da curva Padrão <ol><li> Preparar um estoque de trabalho do reagente de curva padrão (por exemplo, blindado ARN EPA-1615), diluindo-lo a partir da concentração fornecido pelo fabricante para uma concentração de 2,5 x 10 8 partículas / ml (2,5 x 10 8 GC / ml) usando o TSM tampão III. Dividir o estoque de trabalho em 250 mL alíquotas de 1,5 ml utilizando tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C. NOTA: Ver suplementar protocolo materiais Passo S1 para obter instruções sobre como preparar os stocks de trabalho dos vírus e plasmídeos para uso como reagentes alternativos curva padrão. </li><li> Descongelar uma ou mais das alíquotas banco de trabalho. Preparar cinco diluições em série de 10 vezes usando 1,5 ml de tubos de microcentrífuga, dando concentrações de 2,5 x 10 7, 2,5 x 10 6, 2,5 x10 5, 2,5 x 10 4, e 2,5 x 10 3 CG / ml. <ol><li> Preparar a primeira diluição por adição de 25 ul de 2,5 x 10 a 8 GC / ml de estoque de trabalho de 225 ul de tampão TSM III. Misturar durante 5-15 segundos usando um misturador de vórtice. </li><li> Prepara-se o seguinte de diluição por adição de 25 ul de uma diluição preparada no Passo 1.2.1-se 225 ul de tampão TSM III. Misturar novamente e continuar um processo semelhante para preparar os próximos três diluições de 10 vezes. </li></ol></li><li> Extraia o RNA do estoque trabalhando curva padrão e as cinco diluições imediatamente usando o procedimento na Seção 3. </li></ol> 2. Concentração terciária <ol><li> Preparar um concentrador centrífugo (30.000 corte de peso molecular) para cada uma das amostras colhidas por adição de pelo menos 10 ml de PBS 1x, 0,2% de albumina de soro bovino (BSA) para a câmara de amostra superior. Certifique-se de que a solução encheu o compartimento de concentração canal fina, e então segure O / N a 4 ° C. <ol><li&gt; Descartar o fluido. Lavar o concentrador de uma só vez, com, pelo menos, 10 ml de água de grau de reagente estéril para remover o excesso de BSA e em seguida descartar a água. </li></ol></li><li> Adicionar uma quantidade de concentrado de água secundário a partir de cada amostra de ensaio igual a S, o volume de ensaio de amostra em concentradores centrífugos separados. <ol><li> Calcular S usando a Equação 1, <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq1.jpg" /> Onde D é o volume de Original Amostra de Água Analisada, TSV é o volume total da amostra e FCSV é o concentrado de volume amostra final. Ver materiais suplementares S2 para um exemplo do cálculo de S. </li></ol></li><li> Centrifugar cada amostra de teste a 3.000-6.000 x g a 4 ° C num rotor basculante durante 20 - 30 min. Verificar o volume na câmara de canal concentração fina. <ol><li> Se o volume é maior do que 400 ul, de centrifugação novamente durante 20 min ou mais. Continue a centrifugação até que a amostra em the compartimento de concentração canal fina foi reduzido para menos de 400 ul. Não remova o sobrenadante. </li></ol></li><li> Lavar os lados do concentrador centrífugo com 1 ml de fosfato estéril a 0,15 M, pH 7-7,5 de sódio para aumentar a recuperação do vírus. Centrifugar novamente a 3.000-6.000 x g e 4 ° C até a amostra ter sido reduzido para menos de 400 ul. Repita este passo de lavagem uma vez adicional. </li><li> Usando uma micropipeta de 100-200 uL, com cuidado medir e transferir cada amostra concentrada para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (isto é, transferir 200 ul ao tubo de microcentrífuga e depois medir o concentrado restante ajustando a micropipeta até que o líquido remanescente pode ser completamente elaborado na ponta da pipeta). Adicionar fosfato de sódio 0,15 M, pH 7-7,5, para ajustar o volume final para 400 ± 2 ul. </li><li> Extracto de ácido nucleico imediatamente por prosseguir para a etapa 3. Manter as amostras concentradas que não pode ser processed imediatamente a 4 ° C durante não mais do que 24 horas. </li></ol> Isolamento 3. Ácido Nucleico <ol><li> Adicionar 200 ul de tampão de extracção preparado como descrito no passo 3.3 e 200 ul do concentrado terciária de cada amostra de teste a partir do Passo 2.5 ou diluição curva padrão a partir do Passo 1,3 a 1,5 ml separada marcadas tubos de microcentrífuga. Congelar restante concentrados terciárias a ou abaixo de -70 ° C. Extrair os ácidos nucleicos a partir de cada amostra de acordo com as instruções do fabricante do kit de extracção de ácido nucleico de a para o protocolo de centrifugação para amostras de sangue com as seguintes excepções. </li><li> Não adicionar protease para as amostras de água ou usar o tampão de extracção fornecido com o kit de extracção de ácido nucleico. </li><li> Preparar tampão de extracção de RNA com transportador <ol><li> Adicionar 310 ul de tampão de diluição de ARN transportador para um frasco contendo 310 ug de ARN transportador. Misture para dissolver e depois dividir em 6 alíquotas contendo cerca de 50 ul. Armazenar a -20° C. </li><li> Adicionar 28 ul de ARN transportador descongelado por ml de tampão de extracção para obter uma concentração de ARN transportador de 0,027 ug / uL. Utilizar o tampão de extracção de ARN alterado-transportador no lugar do que fornecido com o kit de extracção. </li></ol></li><li> Prepara-se uma solução de mestre de tampão de eluição por adição de ribonuclease (RNase) inibidor para uma concentração final de 400 unidades / ml para o tampão de eluição fornecido com o kit de extracção. <ol><li> Eluir o RNA a partir do ácido nucleico de ligação coluna de centrifugação, colocando 50 ul de tampão de eluição com inibidor de RNase para a coluna. Espera durante 1 min, e depois centrifugar a 6.000 xg durante 1 min à temperatura ambiente. </li><li> Repita o passo 3.4.1 e, em seguida, remover e descartar a coluna. </li></ol></li><li> Preparar alíquotas dos extractos de ARN a partir do passo 3.4.2. Prepare 6 alíquotas do estoque trabalhando curva padrão e cada diluição curva padrão contendo pelo menos 15 ul cada. Prepare a 4 alíquotas de todas as outras amostras de ARN que contenham pelo menos22 ul cada. Armazenar uma alíquota de cada amostra e controles curva padrão a 4 ° C, se eles podem ser processados ​​por transcrição reversa dentro de 4 horas; de outra forma, todas as alíquotas de armazenar a ou abaixo de -70 ° C. </li></ol> 4. Transcrição Reversa (RT) <ol><li> Preparar 100 uM soluções de estoque de cada oligonucleótido iniciador e sonda listados na Tabela 1, por adição de um volume de água de PCR-grade para cada frasco utilizando uma quantidade (em microlitros) igual a dez vezes o número de nanomoles (nmol) de oligonucleótido presentes na frasco (como mostrado no rótulo do frasco ou em folha de especificações do fabricante (por exemplo, ressuspender uma cartilha contendo 36,3 nmol em 363 ul). Misture a se dissolver. <ol><li> Dilui-se a 100 uM soluções 1:10 com água de grau de PCR para preparar soluções de trabalho de 10 uM. </li></ol></li><li> Prepare RT Master Mix 1 e 2 em uma sala limpa, utilizando a guia na Tabela 2. Pipetar 16,5 ul de RT MasteR Mistura 1 para cada placa de PCR poço utilizando uma pipeta multicanal. </li><li> Thaw, se forem congelados, os extractos ácidos nucleicos a partir de cada amostra de campo e laboratório Fortificado matriz da amostra (LFSM, ou seja, sem sementes amostra matriz de água). <ol><li> Diluir cada amostra de campo e LFSM 1: 5 e 1:25 em tampão de eluição contendo 400 unidades / ml de inibidor de RNase. </li><li> Thaw, se forem congelados, mas não diluir Lab Fortificado em branco (LFB, ou seja, um controlo positivo qualidade usando reagente de qualidade de água sem sementes), Reagente Lab em branco (LRB, ou seja, um controle de qualidade negativa usando reagente de qualidade da água), Avaliação de Desempenho (PE ; isto é, o reagente semeadas amostras de água grau utilizado para avaliar o desempenho do laboratório antes do início do estudo), Teste de Desempenho (PT; ou seja, as amostras de água de grau reagente semeadas com títulos desconhecidos para um analista que são usados ​​para avaliar o desempenho do laboratório durante um estudo ), NA Batch controle de extração negativo, ou RNA extraído do conjunto curva padrão. </li></ol&gt; </li><li> Colocar 6.7 ul do ARN a partir de cada amostra de teste, controlo e curva padrão em poços de placas separadas de PCR, utilizando-se cavidades em triplicado para as amostras de teste e controlos e poços em duplicado para curvas padrão (ver Figura S1 durante um exemplo da placa de RT). <ol><li> Colocar 6.7 ul de tampão de eluição em poços separados de placas de PCR para os controlos não há molde (NTC). Incluir 2-8 NTC por placa RT, usando dois para a primeira amostra e, em seguida, mais dois para cada quarta amostra adicional. </li><li> Distribuir a extracção controlos negativo e NTC em toda a placa. </li></ol></li><li> Selar a placa de PCR com um vedante de placa resistente ao calor. Misture as amostras para 5-10 segundos e, em seguida, centrifugar a ≥ 500 xg brevemente. </li><li> Incubar a placa durante 4 min a 99 ° C e, em seguida, arrefecer rapidamente até 4 ° C num termociclador. Centrifugar novamente a ≥ 500 xg brevemente. </li><li> Remover cuidadosamente a placa do selo e, em seguida, adicionar 16,8 mL de RT Master Mix 2 a cada poço. Seai novamente a placa com uma placa vedante resistente ao calor, seguida por mistura e uma breve centrifugação a 500 x g ≥. </li><li> Colocar a placa num termociclador e correr durante 15 min a 25 ° C, seguido de 60 min a 42 ° C, 5 min a 99 ° C, e em seguida por um ciclo de 4 ° C preensão. </li><li> Processo imediatamente ou dentro de 8 horas por qPCR (Etapa 5), ​​ou armazenar amostras a ou abaixo de -70 ° C até que possam ser processados. Armazenar as amostras que podem ser processados ​​dentro de 8 horas a 4 ° C. </li></ol> 5. Real-time PCR quantitativa (qPCR) <ol><li> Determinar a média da hepatite G Cq valor para cada lote de reagente G hepatite antes de executar quaisquer amostras de teste. <ol><li> Executar um ensaio de RT utilizando 10 repetições preparados como descrito para os controlos NTC (Passo 4.1.1). Executar o ensaio da hepatite G qPCR como descrito abaixo (Passos 5.2 a 5.5.3). Calcular o valor médio das Cq 10 repetições. </li><li> Ajuste a quantidade de reagente G hepatite em RT Master Mix 1 (Tabela 2), Se necessário, para se obter um valor médio Cq entre 25 e 32 unidades. Compensar a quantidade levantada ou baixada, alterando o volume de água adicionado para manter o volume final de RT Master Mix 1 em 16,5 uL por ensaio. </li><li> Confirme os ajustes, repetindo as etapas 5.1.1 a 5.1.2 e mudança Tabela 2 para refletir as quantidades ajustadas. </li></ol></li><li> Prepare qPCR misturas principais em uma sala limpa usando as guias na Tabela 3 para enterovírus, Tabela 4 e Tabela 5 para norovirus genogrupo I, Tabela 6 para norovirus genogrupo II, a Tabela 7 para norovirus murino (norovirus genogrupo V), e Tabela 8 para a hepatite G. Mix cada master mix e, em seguida, centrifugar a ≥ 500 xg brevemente. </li><li> Adicionar as misturas principais de PCR para os poços apropriados de uma placa de reacção óptica marcado, utilizando 14 ul por cavidade e as placas separadas para cada ensaio de qPCR (ver Figura S2 </strong&gt; para um possível layout para um ensaio de qPCR com base no layout de RT na figura S1). </li><li> Descongelar a placa de RT do Passo 4.8, à TA, se congelado. Misture usando um misturador de placa e, em seguida, centrifugar a ≥ 500 xg brevemente. </li><li> Dispensar 6 ul de ADNc apropriada para os poços apropriados da placa de reacção óptica. Misturar as amostras na placa de reacção óptica e centrifugar a 500 ≥ brevemente xg. <ol><li> Execute o teste da hepatite G qPCR no campo não diluída e diluída e amostras LFSM antes de executar todos os outros ensaios qPCR. Use o menor diluição de campo ou amostra LFSM que é &lt;1 Cq valor maior do que a média da hepatite G valor Cq para os enterovírus e norovírus ensaios qPCR. </li><li> Defina-se a PCR quantitativa termociclador de software de acordo com as instruções do fabricante. Identificar as amostras da curva padrão como padrões e para cada diluição curva padrão, digite os valores de cópias genômicas apresentados na Tabela 9. </li><li&gt; Executar a placa no termociclador de PCR quantitativo durante 10 min a 95 ° C, seguido de 45 ciclos de 15 seg a 95 ° C e 1 min a 60 ° C. </li></ol></li><li> Determinar se cada curva padrão atende aos valores aceitáveis ​​dadas na Tabela 10. Consulte a seção materiais suplementares S3 para exemplos. <ol><li> Calcular o desvio padrão global (Desvio Padrão) para a curva padrão utilizando a Equação 2, <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq2.jpg" /> onde Cq é o valor relatado para cada curva padrão de repetição, Cq é o valor médio para cada conjunto de réplicas, #Cq é o número total de valores Cq para todos os replicados de controlo de padrão que possuem valores positivos (ou seja, não indeterminada), e # Dst é o número de controlos normais que possuem valores positivos. </li><li> Se a PCR quantitativa software termociclador não calcular o declive de cada curva padrão, calcular a inclinação usando a Equação 3,60; <img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq3.jpg" /> onde Cq é o valor médio das diluições maiores e menores usados ​​e log GC é o log do valor cópia genômica para as diluições maiores e menores utilizados a partir da Tabela 9. </li><li> Calcule o valor R2 usando a Equação 4. <img alt="Equação 4" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq4.jpg" /> onde Cq representa a média de todos os valores de log Cq e GC é o valor médio Log GC para cada replicado. </li><li> Calcule a Eficiência% usando a Equação 5: <img alt="Equação 5" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq5.jpg" /></li></ol></li><li> Registre os valores GC calculados pelo software termociclador para todas as amostras de teste com base em curvas padrão que atendem aos critérios especificados na Tabela 10 e os valores médios GC para cada amostra. Execute novamente todas as amostras com curvas padrão que não cumprem os critérios estabelecidos no <strong&gt; Tabela 10 ou onde os controles negativos (LRB, NA Batch controle de extração negativo, ou NTC) são positivos. Reprocessar quaisquer amostras que não cumpram os critérios ou têm controles positivos falsos durante a reprise. </li><li> Determine o GC por litro (GC L) para cada amostra de teste usando a Equação 6: <img alt="Equação 6" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq6.jpg" /> onde GC é o número de cópia genómica significativo do passo 5.7, o factor &#39;199&#39; é o factor de diluição total para as reduções de volume que ocorrem durante a concentração terciária, a extracção de ARN e as etapas de RT-qPCR, DF é o factor de diluição, que compensa para a inibição e D é o volume da amostra original de água ensaiadas em litros. Ver materiais suplementares seção S4 para um exemplo do cálculo do GC L. </li><li> Calcule o GC total de LFB e LRB amostras multiplicando o valor GC média do Passo 5,5 por 199 e dividindo por 0,3. </li></ol>

<ol><li>Borchardt, M. A., Spencer, S. K., Kieke, B. A., Lambertini, E., Loge, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruses+in+nondisinfected+drinking+water+from+municipal+wells+and+community+incidence+of+acute+gastrointestinal+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Viruses in nondisinfected drinking water from municipal wells and community incidence of acute gastrointestinal illness.</a> Environ. Health Perspect. 120 (9), 1272-1279 (2012).</li>
<li>Ye, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+detection+of+enteric+viruses+in+source+water+and+treated+drinking+water+in+Wuhan%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR detection of enteric viruses in source water and treated drinking water in Wuhan, China.</a> Curr. Microbiol. 65 (3), 244-253 (2012).</li>
<li>Williamson, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+viruses+in+New+Zealand+drinking-water+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Enteric viruses in New Zealand drinking-water sources.</a> Water Sci. Technol. 63 (8), 1744-1751 (2011).</li>
<li>Lambertini, E., Borchardt, M. A., Kieke, B. A., Spencer, S. K., Loge, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+of+viral+acute+gastrointestinal+illness+from+nondisinfected+drinking+water+distribution+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Risk of viral acute gastrointestinal illness from nondisinfected drinking water distribution systems.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (17), 9299-9307 (2012).</li>
<li>Chigor, V. N., Okoh, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+RT-PCR+detection+of+hepatitis+A+virus%2C+rotaviruses+and+enteroviruses+in+the+Buffalo+River+and+source+water+dams+in+the+Eastern+Cape+Province+of+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Environ.+Res.+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Quantitative RT-PCR detection of hepatitis A virus, rotaviruses and enteroviruses in the Buffalo River and source water dams in the Eastern Cape Province of South Africa.</a> Int. J. Environ. Res. Public Health. 9 (11), 4017-4032 (2012).</li>
<li>Fout, G. S., Martinson, B. C., Moyer, M. W., Dahling, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+reverse+transcription-PCR+method+for+detection+of+human+enteric+viruses+in+groundwater%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A multiplex reverse transcription-PCR method for detection of human enteric viruses in groundwater.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (6), 3158-3164 (2003).</li>
<li>Hewitt, J., Bell, D., Simmons, G. C., Rivera-Aban, M., Wolf, S., Greening, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastroenteritis+outbreak+caused+by+waterborne+norovirus+at+a+New+Zealand+ski+resort%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Gastroenteritis outbreak caused by waterborne norovirus at a New Zealand ski resort.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7853-7857 (2007).</li>
<li>Jack, S., Bell, D., Hewitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+contamination+of+a+drinking+water+supply+at+a+hotel+resort%5BTitle%5D)+AND+%22New+Zealand+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Norovirus contamination of a drinking water supply at a hotel resort.</a> New Zealand Med. J. 126 (1387), 98-107 (2013).</li>
<li>Anderson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+waterborne+outbreak+of+Norwalk-like+virus+among+snowmobilers-Wyoming%2C+2001%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001.</a> J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).</li>
<li>Parshionikar, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+outbreak+of+gastroenteritis+associated+with+a+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Waterborne outbreak of gastroenteritis associated with a norovirus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (9), 5263-5268 (2003).</li>
<li>U.S. Environmental Protection Agency Office of Water. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22820-F-12-058%3A+Recreational+Water+Quality+Criteria%22">820-F-12-058: Recreational Water Quality Criteria</a>. , 1-63 (2012).</li>
<li>Wade, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapidly+measured+indicators+of+recreational+water+quality+and+swimming-associated+illness+at+marine+beaches%3A+a+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health%22%5BJournal%5D)">Rapidly measured indicators of recreational water quality and swimming-associated illness at marine beaches: a prospective cohort study.</a> Environ. Health. 9, 66(2010).</li>
<li>Fout, G. S., et al. Method 1615: Measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and RT-qPCR (EPA/600/R-10/181). , U. S. Environmental Protection Agency. 1-91 (2012).</li>
<li>Cashdollar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Evaluation+of+EPA+Method+1615+for+Detection+of+Enterovirus+and+Norovirus+in+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).</li>
<li>Gibson, K. E., Schwab, K. J., Spencer, S. K., Borchardt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+mitigating+inhibition+during+quantitative+real+time+PCR+analysis+of+viral+nucleic+acid+extracts+from+large-volume+environmental+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Measuring and mitigating inhibition during quantitative real time PCR analysis of viral nucleic acid extracts from large-volume environmental water samples.</a> Water Res. 46 (13), 4281-4291 (2012).</li>
<li>Fuentes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+multiplex+one-step+qRT-PCR+for+hepatitis+A+virus%2C+norovirus+GI+and+GII+quantification+in+bivalve+mollusks+and+water%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Standardized multiplex one-step qRT-PCR for hepatitis A virus, norovirus GI and GII quantification in bivalve mollusks and water.</a> Food Microbiol. 40, 55-63 (2014).</li>
<li>Coudray, C., Merle, G., Martin-Latil, S., Guillier, L., Perelle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+extraction+methods+for+the+detection+of+hepatitis+A+virus+in+lettuces+using+the+murine+norovirus+as+a+process+control%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of two extraction methods for the detection of hepatitis A virus in lettuces using the murine norovirus as a process control.</a> J. Virol. Methods. 193 (1), 96-102 (2013).</li>
<li>Sen, K., et al. EPA 815-B-04-001: Quality assurance/quality control guidance for laboratories performing PCR analyses on environmental samples. , U.S. Environmental Protection Agency. 1-56 (2004).</li>
<li>Schlueter, V., Schmolke, S., Stark, K., Hess, G., Ofenloch-Haehnle, B., Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcription-PCR+detection+of+hepatitis+G+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reverse transcription-PCR detection of hepatitis G virus.</a> J. Clin. Microbiol. 34 (11), 2660-2664 (1996).</li>
<li>De Leon, R., Shieh, C., Baric, R. S., Sobsey, M. D. Detection of enteroviruses and hepatitis A virus in environmental samples by gene probes and polymerase chain reaction. Proc. Water Qual. Technol. Conf. 1990 Nov 11-15, , 833-853 (1990).</li>
<li>Monpoeho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+enterovirus+RNA+in+sludge+samples+using+single+tube+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Quantification of enterovirus RNA in sludge samples using single tube real-time RT-PCR.</a> BioTechniques. 29 (1), 88-93 (2000).</li>
<li>Jothikumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+noroviruses+by+using+TaqMan-based+one-step+reverse+transcription-PCR+assays+and+application+to+naturally+contaminated+shellfish+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of noroviruses by using TaqMan-based one-step reverse transcription-PCR assays and application to naturally contaminated shellfish samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (4), 1870-1875 (2005).</li>
<li>da Silva, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+removal+of+noroviruses+during+wastewater+treatment%2C+using+real-time+reverse+transcription-PCR%3A+different+behaviors+of+genogroups+I+and+II%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of removal of noroviruses during wastewater treatment, using real-time reverse transcription-PCR: different behaviors of genogroups I and II.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7891-7897 (2007).</li>
<li>Butot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+various+real-time+RT-PCR+assays+for+the+detection+and+quantitation+of+human+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of various real-time RT-PCR assays for the detection and quantitation of human norovirus.</a> J. Virol. Methods. 167 (1), 90-94 (2010).</li>
<li>Loisy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+RT-PCR+for+norovirus+screening+in+shellfish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time RT-PCR for norovirus screening in shellfish.</a> J. Virol. Methods. 123 (1), 1-7 (2005).</li>
<li>Reynolds, K. A., Gerba, C. P., Pepper, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+infectious+enteroviruses+by+an+integrated+cell+culture-PCR+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of infectious enteroviruses by an integrated cell culture-PCR procedure.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1424-1427 (1996).</li>
<li>Ming, H. X., Zhu, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+infectious+enterovirus+from+surface+water+in+Bohai+Bay%2C+China+using+an+integrated+cell+culture-qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Pollut.+Bull%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of infectious enterovirus from surface water in Bohai Bay, China using an integrated cell culture-qPCR.</a> Mar. Pollut. Bull. 62 (10), 2047-2054 (2011).</li>
<li>Parshionikar, S., Laseke, I., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+propidium+monoazide+in+reverse+transcriptase+PCR+to+distinguish+between+infectious+and+noninfectious+enteric+viruses+in+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of propidium monoazide in reverse transcriptase PCR to distinguish between infectious and noninfectious enteric viruses in water samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (13), 4318-4326 (2010).</li>
<li>Sanchez, G., Elizaquivel, P., Aznar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+of+infectious+hepatitis+A+viruses+by+propidium+monoazide+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Environ.+Virol%22%5BJournal%5D)">Discrimination of infectious hepatitis A viruses by propidium monoazide real-time RT-PCR.</a> Food Environ. Virol. 4 (1), 21-25 (2012).</li>
<li>Kim, S. Y., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+propidium+monoazide+to+distinguish+between+viable+and+nonviable+bacteria%2C+MS2+and+murine+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Lett.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Using propidium monoazide to distinguish between viable and nonviable bacteria, MS2 and murine norovirus.</a> Lett. Appl. Microbiol. 55 (3), 182-188 (2012).</li>
<li>Fout, G. S., Schaefer, F. W. 3rd, Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. EPA/600/R-95/178: ICR Microbial Laboratory Manual, I.1-ApD-23. , U.S. Environmental Protection Agency. (1996).</li>
<li>Abbaszadegan, M., Stewart, P., LeChevallier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+detection+of+viruses+in+groundwater+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A strategy for detection of viruses in groundwater by PCR.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 444-449 (1999).</li>
<li>Lambertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+of+enteroviruses%2C+adenoviruses%2C+and+noroviruses+from+drinking+water+by+use+of+glass+wool+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (10), 2990-2996 (2008).</li>
<li>Rodriguez, R. A., Thie, L., Gibbons, C. D., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+effects+of+environmental+inhibition+in+quantitative+real-time+PCR+detection+of+adenovirus+and+norovirus+in+recreational+seawaters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Reducing the effects of environmental inhibition in quantitative real-time PCR detection of adenovirus and norovirus in recreational seawaters.</a> J. Virol. Methods. 181 (1), 43-50 (2012).</li>
<li>Iker, B. C., Bright, K. R., Pepper, I. L., Gerba, C. P., Kitajima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+commercial+kits+for+the+extraction+and+purification+of+viral+nucleic+acids+from+environmental+and+fecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of commercial kits for the extraction and purification of viral nucleic acids from environmental and fecal samples.</a> J. Virol. Methods. 191 (1), 24-30 (2013).</li>
<li>Fey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+real-time+PCR-based+approach+for+accurate+quantification+of+bacterial+RNA+targets+in+water%2C+using+Salmonella+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Establishment of a real-time PCR-based approach for accurate quantification of bacterial RNA targets in water, using Salmonella as a model organism.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3618-3623 (2004).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+electropositive+filtration+for+recovering+norovirus+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water.</a> J. Water Health. 9 (1), 27-36 (2011).</li>
<li>Kim, M., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+the+inhibitory+effects+of+salt%2C+humic+acid%2C+and+heavy+metals+on+the+recovery+of+waterborne+norovirus+by+electropositive+filters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of the inhibitory effects of salt, humic acid, and heavy metals on the recovery of waterborne norovirus by electropositive filters.</a> J. Water Health. 11 (4), 613-622 (2013).</li>
<li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li>
<li>Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+positively+charged+alumina+nanofibre+cartridge+filters+for+the+primary+concentration+of+noroviruses%2C+adenoviruses+and+male-specific+coliphages+from+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater.</a> J. Appl. Microbiol. 109 (2), 635-641 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Estudos de grande escala nacional de contaminação virai de origem e de águas de beber exigem o uso de vários laboratórios de análise. Sob estas condições, é necessário um método padrão para assegurar que os dados gerados pelos vários laboratórios é comparável. Existem muitos métodos moleculares publicados para detecção de vírus, mas muito poucos métodos moleculares padronizados. Método EPA 1615 é um método padronizado projetado especificamente para a detecção de enterovírus e norovírus em matrizes de água RT-qPCR por. Métodos moleculares padronizados estão disponíveis para a detecção de vírus em alimentos (CEN / ISO TS 15216-1 e CEN / ISO TS 15216-2; 07 abril de 2013) 16,17 e têm sido aplicados à detecção de vírus da hepatite A e norovírus na primavera água 16. Todos os métodos padrão deve incluir controles de qualidade de desempenho e critérios para minimizar variação inter e intra-laboratorial e dados falsos positivos devido à contaminação de laboratório. Para reduzir ainda mais dados falsos, EPA Método 1615 segue a orientação de EPA em métodos moleculares, 18, ​​que estipula a separação do trabalho durante o processamento e uma maneira de fluxo de trabalho. Ele inclui uma hepatite G 1,19 controle e procedimentos para minimizar resultados falso-negativos devido aos inibidores de RT-qPCR 15 interna. Ele usa ensaios quantitativos, juntamente com volumes padronizados de ambos água amostrada e água analisados ​​para que todos os dados de campo é expressa em cópias genômicas por litro de campo ou beber água amostrada. Embora eficiente tubo único (um passo) ensaios de RT-PCR estão disponíveis comercialmente, o método utiliza intencionalmente ensaios separados. Isto tem a desvantagem de reduzir ao mínimo a quantidade de amostra que pode ser ensaiada em cada reacção, mas dá uma maior flexibilidade na utilização de múltiplos conjuntos de iniciadores. RT-qPCR ensaios são limitados por e apenas tão bom quanto os primers e sondas utilizadas e, provavelmente, nenhum conjunto de primers irá detectar todas as variantes do vírus dentro de um grupo. O conjunto de enterovírus cartilha foi escolhido porqueque tem como alvo a região de codificação 5 &#39;não conservado, 20,21 detecta uma ampla variedade de serótipos de enterovirus, e vírus detectados por ela estão associados com efeitos sobre a saúde decorrentes do consumo de águas subterrâneas não tratadas 1. Dois conjuntos de iniciadores são usados ​​para a detecção de genogrupo I norovírus 22,23. O primeiro foi escolhido devido à forte correlação entre os efeitos na saúde em crianças pequenas e detectados vírus 1. A segunda genogrupo I primer eo conjunto de iniciador utilizado para norovírus genogrupo II foram escolhidos porque eles detectam a mais ampla variedade de cepas 24,25. Apesar das grandes vantagens de qPCR e RT-qPCR procedimentos para a detecção de RNA viral em água, há várias limitações. Primeiro, ambas as partículas virais infecciosas e não infecciosas, incluindo aqueles inactivado por desinfectantes, podem ser amplificados por estes procedimentos. Os resultados da Borchardt sugerem que isso é menos de um problema para as águas subterrâneas não tratadas faquíferos rom semelhantes àquelas nas comunidades estudadas do que para as águas superficiais desinfetados 1. Para vírus cultiváveis ​​este problema pode ser superado através de PCR, em combinação com a cultura 26,27. O problema foi também tratada por alguns vírus através do uso de agentes de ligação cruzada de ácido nucleico 28-30. Esta última abordagem é mais eficaz para os vírus inativados por hipoclorito e não eficazes para aqueles inactivado por UV. Uma segunda limitação destes processos moleculares que é o volume da amostra concentrada que pode ser ensaiada é tipicamente muito menor do que o utilizado para procedimentos de cultura 6,31. Este problema é muitas vezes tratada por qualquer substituição de um procedimento à base de polietilenoglicol para a concentração secundário padrão pela floculação orgânica, que permite que a amostra a ser ressuspensas num volume mais pequeno, ou pela adição de um passo de concentração da amostra terciário 6,32,33 . Método 1615 usa CentrifUGAL ultrafiltração para proporcionar uma concentração superior. Ultrafiltração centrífuga remove a água e os componentes menos do que 30.000 Daltons, resultando em ambos concentração de vírus nas amostras de teste e uma redução em inibidores de baixo peso molecular de ensaios moleculares. Este passo de concentração terciárias resulta num factor de concentração global de&gt; 10 5 para qualquer vírus que estava presente na água a ser testada. Uma terceira limitação é a presença de inibidores de processos moleculares em amostras ambientais. Apesar de várias abordagens para remover inibidores têm sido desenvolvidos, nenhuma abordagem é eficaz para todas as matrizes de água e tipos de vírus 6,34,35, tornando o uso de controles internos destinados a estimar o nível de inibição essencial. O reagente da hepatite G utilizado neste método satisfaz este requisito ao proporcionar um nível constante de ARN virai em todas as reacções e um ensaio de RT-qPCR para a estimativa de inibição. Quando o melhor de tele inibidor de remoção abordagens não conseguem remover inibição, os concentrados de amostra pode ser diluída, enquanto as concentrações de vírus são maiores do que as concentrações de inibidor 14,15. O procedimento curva padrão aqui descrito tem vantagens e uma maior limitação. Uma vantagem é que o reagente utilizado material de todos os componentes necessários num único reagente, permitindo que um único controlo a serem utilizados para todos os ensaios. Este reagente é especialmente uma vantagem para ensaios de norovírus. Partículas Norovirus só pode ser obtido a partir de indivíduos infectados, tornando muito difícil a obtenção de partículas virais para uso como padrões. Uma vantagem mais importante é que fornece um padrão de RNA para todos os vírus de RNA específicas a um reagente, como tendo um padrão de RNA é essencial para a quantificação exacta de ARN 36. No entanto, a sua capacidade de quantificar com precisão vírus é limitada pelo facto de que os efeitos da matriz não são tidos em conta. Isto significa que a cópia genômicaOs valores de número não pode ser considerado absoluto e só deve ser considerada em termos relativos. Recomenda-se que um número suficiente de curva padrão alíquotas de ações de trabalho (passo 1.2) estar preparado para cobrir estudos completos. Por exemplo, cada alíquota de 250 ul de reagente fornece suficiente para 6 placas RT. Se é sabido que um estudo irá requerer a análise de amostras 500, um mínimo de 12 alíquotas seria necessário (500 amostras / 7 amostras por placa RT / RT 6 placas) por alíquota. Método EPA 1615 é um método baseado desempenho. Muitos fabricantes fazem reagentes equivalentes aos aqui especificados e destes reagentes pode ser substituído, desde que sejam cumpridos os critérios de desempenho. A curva padrão, que também serve como um controlo positivo no teste RT-qPCR, é de valor em solucionar problemas de desempenho. O desempenho pode diminuir devido à degradação do RNA, a vida de prateleira de reagentes, a falha de freezers, calibração de instrumentos, e erro técnico. Problemas de desempenho deve ser suspeitoed se curvas padrão diferentes dos mostrados na Figura 4 ou se não cumprir a especificação de desempenho para curvas padrão. O ensaio de RT-qPCR é bastante robusta; fracasso completo é provavelmente devido ao manuseio inadequado de RNA ou erro técnico (por exemplo, um reagente em falta). Grande cuidado deve ser tomado na manipulação de amostras de RNA entre a extração ea etapa de RT para reduzir a degradação do RNA ribonucleases. Recuperações de poliovírus a partir de águas subterrâneas e de grau reagente e recuperações norovirus murino de águas subterrâneas conheceu o Método EPA 1615 critérios de aceitação de desempenho (Tabela 11) e são semelhantes aos relatados por outros 33,37,38. Recuperações de norovírus murino a partir de amostras LFB foram muito menores do que os de poliovírus e não teria conhecido os critérios de aceitação específicos do poliovírus. As razões para a menor recuperação norovirus murino de água grau reagente são desconhecidos. Semelhante aos resultados aqui descritos, Karim e Colleagues relatou uma recuperação para norovirus GI.1 de 4% da água da torneira 39. Lee et ai. Relataram 37 recuperações médias para norovirus murino e humano GII.4 norovírus de 18% e 26% de água destilada usando filtros de disco, respectivamente. Usando condições semelhantes às Lee e seus colegas, Kim e Ko observadas recuperações de 46% e 43% para estes vírus, respectivamente 38. Gibbons et al. 40 obtida em torno de recuperação de 100% de GII.4 norovirus humano a partir de água do mar, mas Kim e Ko 38 verificaram que a adição de sal à água destilada em concentrações semelhantes ou mais elevados do que a água do mar recuperações significativamente reduzida do vírus de murino e resultou em cerca de uma redução de duas vezes na recuperação GII.4.

PCR quantitativo (qPCR, ver materiais suplementares para definições dos termos utilizados neste manuscrito) e transcrição reversa-qPCR (RT-qPCR) são ferramentas valiosas para detectar e quantificar vírus entéricos humanos no meio ambiente e beber águas e, especialmente, para muitos vírus que fazer não replicar ou mal replicar em sistemas de cultura de células. Ambas as ferramentas têm demonstrado que muitos tipos de vírus estão presentes em águas ambientais e de consumo em todo o mundo 1-6. A sua utilização juntamente com sequenciamento de fragmentos genómicos amplificados durante investigações de surtos de doença apresentou elementos de prova para a transmissão do vírus por via aquática, como eles têm mostrado que o vírus encontrados na água potável é idêntico ao galpão por pacientes surto 7-10. Ambos qPCR e RT-qPCR são ferramentas úteis de saúde pública. Por exemplo, os dados dos estudos realizados pela Agência de Proteção Ambiental (EPA) mostraram uma relação forte seras medições dos indicadores tween por qPCR e efeitos na saúde em águas de recreio. Como resultado, finais de 2012 Critérios de Qualidade da Água Recreativa da EPA inclui um método para o monitoramento qPCR praias recreativas 11,12. Borchardt e seus colegas também descobriram uma forte relação entre gastroenterite aguda em comunidades que utilizam águas subterrâneas não tratadas e vírus nas águas subterrâneas como medido por RT-qPCR 1. O objetivo deste artigo é descrever a componente do ensaio molecular do Método EPA 1615 13,14. Este ensaio utiliza RT-qPCR para fornecer uma estimativa quantitativa de enterovírus e norovírus cópias genómicas (GC) por litro com base no volume original de água potável ou ambiental passada através de um filtro de electropositivo. Uma visão geral do processo molecular é mostrada na Figura 1 seção. Protocol 1 detalha os procedimentos para preparar a curva padrão. Estes padrões são preparados a partir de um reagente que contém um RNUma cópia da sequência alvo para todos os conjuntos iniciador / sonda. A Seção 2 descreve o procedimento concentração terciária. Seção 3 apresenta o método de extracção de ARN a partir de amostras de água e concentrados de controlo. O ARN de cada amostra de teste é transcrito de forma inversa utilizando ensaios em triplicado e iniciadores aleatórios para iniciar a transcrição (Secção 4). O cDNA a partir de cada reacção de transcrição reversa é dividido em cinco ensaios específicos do vírus separadas, que são analisadas em triplicado por qPCR (Secção 5; Figura 2). O ensaio utiliza primers e sondas a partir da literatura científica (Tabela 1) que são concebidos para detectar muitas enterovírus e noroviruses e um reagente contendo hepatite G ARN para identificar amostras de teste que são inibidores de RT-qPCR 15.

<table><tbody><tr><td>Câmara de tubo de 1,5 ml</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-3000</td><td></td></tr><tr><td>1 &deg; C tijolo frio</td><td>Diversified Biotech</td><td>BRIK-2501</td><td></td></tr><tr><td>10x PCR Buffer II e 25-mM MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>N8080130-20</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C freezer</td><td>VWR</td><td>97043-346</td><td>Deve ser um freezer de degelo</td></tr> <tr><td>manual-70 &deg; C ou freezer mais frio</td><td>Thermo Scientific</td><td>MBF700LSAO-E</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de 96 poços</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-1000</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>RNA blindado EPA-1615</td><td>Asuragen</td><td>Pedido personalizado</td><td>Usado para quantificar o ensaio RT-qPCR</td></tr><tr><td>Vírus blindado da hepatite G do RNA</td><td>Asuragen</td><td>42024</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Steris</td><td>Amsco Lab Series</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de biossegurança</td><td>NuAir Laboratory Equipment Supply</td><td>Labgard 437 ES</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Affymetrix</td><td>10856</td><td>Grau cristalino ou melhor</td></tr><tr><td>Tampão AVE</td><td>Qiagen</td><td>1026956</td><td>Carrier RNA tampão de diluição</td></tr><tr><td>Tampão AVL</td><td>Qiagen</td><td>19073</td><td>Extração tampão</td></tr><tr><td>RNA transportador</td><td>Qiagen</td><td>Não aplicável</td><td>Use RNA transportador fornecido com Buffer AVL</td></tr><tr><td>Frascos de centrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-562-23 ou 05-562-26</td><td></td></tr><tr><td>Rotores de centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>339080, 336380</td><td></td></tr><tr><td>Cofre fresco</td><td>Diversified Biotech</td><td>CSF-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Promega</td><td>P1171</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler&reg; 480 Probes Kit mestre</td><td>Roche Diagnostics</td><td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td>Use tubos livres de ribonuclease e desoxirribonuclease com tampas de pressão</td></tr><tr><td>Microcide III</td><td>Fitzgerald</td><td>99R-103</td><td></td></tr><tr><td>Filme Microseal 'A'</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSA5001</td><td>Heat resistente</td></tr><tr><td>Microseal 'F' filme</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSA1001</td><td>Resistente ao congelador</td></tr><tr><td>Girador de mini-placas</td><td>Labnet International</td><td>MPS1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>Rainin</td><td>L8-20</td><td></td></tr><tr><td>Câmara multitubo</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-5000</td><td></td></tr><tr><td>Placa de reação óptica</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>4314320</tr><tr><td>Mistura de nucleotídeos PCR</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td></td></tr><tr><td>Placa PCR</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSS9601</td><td></td></tr><tr><td>Água de grau PCR</td><td>Roche</td><td>3315932001</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>U.S. Biological</td><td>D9820</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de placas</td><td>Scientific Industries</td><td>MicroPlate Genie</td><td></td></tr><tr><td>Prionex gelatina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0411</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Inclui Buffers AW1 (primeiro tampão de lavagem), AW2 (segundo tampão de lavagem), AE (tampão de eluição); o etanol deve ser adicionado aos Buffers AW1 e AW2 antes do uso; Não use o tampão AL fornecido com o kit</td></tr><tr><td>Termociclador PCR quantitativo</td><td>Life Technologies</td><td>4351405</td><td></td></tr><tr><td>Primer aleatório</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td></td></tr><tr><td>Reservatório de reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-381-27E</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Beckman Coulter</td><td>367501</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de RNase</td><td>Promega</td><td>N2515 ou N2615</td><td></td></tr><tr><td>Corante de referência ROX</td><td>Life Technologies</td><td>12223</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II ou III Transcriptase reversa</td><td>Life Technologies</td><td>18064-022 ou 18080044</td><td></td></tr><tr><td>Luvas cirúrgicas</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-058-800</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Life Technologies</td><td>4314879</td><td></td></tr><tr><td>base Trisma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Unidades concentradoras centrífugas Vivaspin 20</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>VS2022</td><td></td></tr></tbody></table>

epa método 1615. medição de enterovirus e norovirus ocorrência na água por cultura e rt-qpcr. parte iii. detecção de vírus por rt-qpcr

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

O Método EPA 1615 mede enterovírus e norovírus presentes em águas ambientais e potáveis. Este método foi desenvolvido com o objetivo de ter um método padronizado para uso em vários laboratórios analíticos durante o período de monitoramento 3 da Regra de Monitoramento de Contaminantes Não Regulamentados. Neste documento, apresentamos o protocolo para extração de ácido ribonucleico (RNA) viral de concentrados de amostras de água e para medição quantitativa das concentrações de enterovírus e norovírus usando PCR quantitativo de transcrição reversa (RT-qPCR). As concentrações de vírus para o ensaio molecular são calculadas em termos de cópias genômicas do RNA viral por litro com base em uma curva padrão. O método usa uma série de controles de qualidade para aumentar a qualidade dos dados e reduzir a variação interlaboratorial e intralaboratorial. O método foi avaliado examinando a recuperação de vírus de águas subterrâneas e reagentes semeadas com poliovírus tipo 3 e norovírus murino como substituto de norovírus humanos. A média de recuperações de poliovírus foi de 20% nas águas subterrâneas e 44% na água reagente. As recuperações médias de norovírus murino com o ensaio RT-qPCR foram de 30% em águas subterrâneas e 4% em água de grau reagente.

Aqui apresentamos um procedimento para quantificar enterovírus e norovírus em águas ambientais e potáveis usando PCR quantitativo de transcrição reversa. A recuperação média do vírus das águas subterrâneas com este procedimento padronizado do Método EPA 1615 foi de 20% para o poliovírus e 30% para o norovírus murino.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. Parte III. Detecção de vírus por RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

O objetivo geral deste procedimento é medir a concentração de enterovírus e norovírus na água, utilizando a reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa. Isso é realizado por meio da concentração terciária de partículas virais a partir de amostras de água concentradas, utilizando ultrafiltração centrífuga. Em seguida, os reagentes da curva padrão são preparados conforme descrito no protocolo. Após isso, realiza-se a extração de ácidos nucleicos dos concentrados virais e da curva padrão. Então, o RNA viral em diluições de um para cinco e um para vinte e cinco do RNA é transcrito reversamente usando primers aleatórios e transcriptase reversa. Por fim, a amplificação do cDNA viral é realizada usando primers e sondas específicas para o vírus em um termociclador em tempo real, seguida pelo cálculo do número genômico das amostras com base na curva padrão.A principal vantagem do método EPA 1615 em comparação com outros métodos padronizados, como o ISO 15216, é que ele foi desenvolvido especificamente para amostras de água e inclui um ensaio para enterovírus. Este método pode fornecer aos avaliadores de risco na área de microbiologia ambiental o estado atual da determinação do risco proveniente de vírus em águas potáveis e recreativas. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades com a padronização incorporada no procedimento. O método é muito detalhado e deve ser seguido explicitamente. A demonstração visual do método é essencial, pois mesmo pequenas variações no procedimento podem causar consequências negativas. Demonstrando o procedimento hoje estão Nichole Brinkman, Jennifer Cashdollar, Shannon Griffin e eu mesma, Shay Fout. Somos todos membros da equipe profissional do laboratório nacional de pesquisa sobre exposição da EPA em Cincinnati, Ohio. Após preparar uma curva padrão conforme o protocolo descrito no texto, prepare um concentrador centrífugo para cada amostra coletada, adicionando pelo menos 10 mililitros de PBS 1X e 2% de BSA à câmara superior de amostra. Após incubação durante a noite, lavagem e adição das amostras conforme descrito no protocolo do texto, centrifugue cada amostra de teste em um rotor de balde oscilante a 3000 a 6000 vezes g e quatro graus Celsius por vinte a trinta minutos.Uma vez que a amostra tenha sido adequadamente concentrada e transferida para um tubo fresco de microcentrífuga, adicione tampão de fosfato de sódio 0,15 molar para ajustar o volume final a 400 microlitros mais ou menos dois microlitros. Para extrair os ácidos nucleicos, adicione 200 microlitros de tampão de extração para um controle negativo de extração e 200 microlitros do concentrado terciário para cada amostra de teste ou diluição da curva padrão, em tubos separados de microcentrífuga, e extraia o RNA de acordo com as modificações no protocolo textual das instruções do fabricante do kit de extração. Após o preparo dos iniciadores e sondas conforme descrito no protocolo, prepare as misturas mestras de transcrição reversa um e dois em um ambiente limpo, conforme mostrado aqui.Usando uma pipeta multicanal, transfira 16,5 microlitros da mistura mestra de RT um para os poços de cada placa de PCR. Em seguida, com o tampão de eluição do kit de extração de ácidos nucleicos contendo 400 unidades por mililitro de inibidor de RNase, dilua a matriz de amostra fortificada de campo e laboratorial ou as amostras de LSFM de um para cinco e de um para vinte e cinco. Transfira 6,7 microlitros dos ácidos nucleicos de cada amostra-teste, controle e curva padrão para poços separados da placa de PCR, utilizando poços triplicados para amostras-teste e controles e poços duplicados para as curvas padrão.Adicione 6,7 microlitros de tampão de eluição nos poços do controle sem molde ou controles negativos (NTC). Inclua dois a oito NTCs por placa de RT, utilizando dois para a primeira amostra e, em seguida, dois ou mais a cada quatro amostras adicionais, distribuindo os controles negativos por toda a placa. Use o selador de placa resistente ao calor para vedar a placa de PCR, certificando-se de que cada poço esteja bem vedado. Em seguida, misture as amostras por cinco a dez segundos antes de centrifugar brevemente a maior ou igual a 500 ×g.Em um termociclador, incubar a placa a 99 graus Celsius por quatro minutos. Levar a placa a quatro graus Celsius e, em seguida, centrifugar brevemente uma segunda vez. Então, remover cuidadosamente o selo da placa e adicionar 16,8 microlitros da mistura mestra de RT dois a cada poço. Após selar a placa e misturar e centrifugar brevemente, colocar a placa no termociclador e executar a 25 graus Celsius por 15 minutos, seguido de 42 graus Celsius por 60 minutos, 99 graus Celsius por cinco minutos e, finalmente, manter a 4 graus Celsius por até oito horas ou armazenar as amostras a 70 graus Celsius negativos por um período mais longo.Em um ambiente limpo, prepare misturas-mestras de PCR quantitativa utilizando os protocolos para enterovírus, norovírus do genogrupo um, norovírus do genogrupo dois e hepatite G. Misture cada mistura-mestra e centrifugue brevemente. Em seguida, conforme mostrado neste exemplo, adicione 14 microlitros das misturas-mestras de PCR aos poços apropriados de uma placa de reação óptica identificada, utilizando placas separadas para cada ensaio de qPCR. Dispense seis microlitros do cDNA apropriado nos poços correspondentes. Em seguida, misture as amostras e centrifugue brevemente.Configure o software do termociclador conforme descrito no protocolo e realize o ensaio de qPCR do vírus da hepatite G nas amostras de matriz de campo fortificadas em laboratório ou nas amostras LFSM não diluídas e diluídas antes de executar todos os demais ensaios de qPCR. Compare o valor médio de Cq de cada amostra com o valor médio de Cq da hepatite G previamente determinado para cada novo lote de reagentes da hepatite G. Utilize a menor diluição da amostra de campo ou LDF que apresente valor de Cq inferior em até uma unidade ao valor médio de Cq da hepatite G para os ensaios de qPCR de enterovírus e norovírus.Configure o software do termociclador de PCR quantitativa de acordo com as instruções do fabricante. Identifique as amostras da curva padrão como padrões e, para cada diluição da curva padrão, insira os valores de cópias genômicas mostrados aqui. Execute a placa a 95 graus Celsius por dez minutos, seguido por 45 ciclos de 90 graus Celsius por 15 segundos e 60 graus Celsius por um minuto.Determine se cada curva padrão atende aos valores aceitáveis indicados nesta tabela. Após calcular o desvio padrão, a inclinação, o R quadrado e a eficiência percentual conforme as equações descritas no protocolo do texto, registre os valores de cópia genômica ou GC calculados pelo software do termociclador para todas as amostras-teste com base nas curvas padrão que atendem aos critérios especificados nesta tabela e os valores médios de GC para cada amostra. Determine o GC por litro para cada amostra-teste utilizando a seguinte equação, em que GC é o número médio de cópias genômicas recém-calculado.O fator 199 é o fator total de diluição para as reações de volume que ocorreram durante as concentrações terciárias. Etapas de extração de RNA e RT-qPCR. DF é o fator de diluição que compensa a inibição e D é o volume da amostra original de água ensaiada em litros.Por fim, calcule o GC total das amostras de branco fortificado de campo ou LFB e branco de reagente de laboratório ou LRB multiplicando o valor médio de GC previamente determinado por 199 e dividindo por 0,3. No geral, a recuperação do vírus foi determinada usando amostras pareadas de água subterrânea LFSM de campo provenientes de um total de sete conjuntos de amostras recuperadas de três estações públicas de tratamento e um poço privado. Os níveis de inóculo para as amostras LFSM foram de três milhões de MPN do poliovírus tipo três e cinco milhões de PFU do norovírus murino.O norovírus murino foi utilizado para a avaliação inicial em laboratório único do método EPA 1615 porque o reagente da curva padrão não estava disponível na época. Para amostras de água subterrânea, a recuperação média de poliovírus foi de 20% com um erro padrão de 2%, enquanto a recuperação média de norovírus murino foi de 30% com um erro padrão de 3%. A amostra regular de campo de água subterrânea para cada LFSM não apresentou enterovírus ou norovírus detectáveis. Amostras de branco fortificado em laboratório (LFB) ou branco de reagente em laboratório (LRB) foram analisadas utilizando água grau reagente com e sem inóculo.A recuperação do poliovírus apresentou uma média de 44% com um erro padrão de 1%, enquanto a recuperação do norovírus murino apresentou uma média de 4% com um erro padrão de 0,5%. Esta figura mostra curvas-padrão típicas para enterovírus e genogrupo dois do norovírus. A curva do genogrupo dois do norovírus atende aos critérios da curva-padrão, com um valor de R quadrado de 0,9987, desvio padrão geral de 0,14 e eficiência de 101%. A curva do enterovírus atende aos critérios de desempenho da curva-padrão, com um valor de R quadrado de 0,9874, desvio padrão geral de 0,58 e eficiência de 103%, mas possui cerca de 100 vezes menos sensibilidade e, portanto, um limite de detecção mais alto do que as curvas do norovírus.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como concentrar e detectar enterovírus e norovírus veiculados pela água utilizando RT-qPCR. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em cerca de oito horas para amostras com baixa turbidez. Para amostras com turbidez mais alta, pode ser necessário tempo adicional, especialmente na etapa de concentração terciária.Ao realizar este procedimento, é importante proteger as amostras da contaminação por RNase antes da transcrição reversa. Não se esqueça de que a PCR é uma técnica muito poderosa e útil. Precauções, como a separação de estações de trabalho e o uso de controles adequados, são necessárias para minimizar resultados falsos positivos e falsos negativos.

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Ambiente

Um Um passo-ensaio de RT-PCR para a detecção e identificação genogrupo de isolados Norovirus a partir de fezes de crianças, que utiliza iniciadores e sondas de TaqMan específicos para o quadro de leitura aberta 1 (ORF1)-ORF2 região de junção, a região mais conservada do genoma norovírus é descrito. A não-comercial, custo-efetivo método de extração de RNA é detalhado.

Detecção e Genogrouping de norovírus a partir de fezes das crianças, Taqman Um passo-RT-PCR

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

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EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. Parte III. Detecção de vírus por RT-qPCR (Vídeo) | JoVE Journal

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. Parte III. Detecção de vírus por RT-qPCR

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