A Pipeline rápido e confiável para estudo de Análise de Caso bacteriana transcriptoma: Regulamento Gene Serina-dependente em Streptococcus pneumoniae

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma visão geral das alterações transcriptômicas em bactérias ocorridas sob uma condição específica. Isso é feito primeiro cultivando e colhendo células bacterianas sob uma condição específica. Em seguida, o RNA total é isolado das células colhidas e o CDNA é feito a partir do RNA.

Em seguida, os CDNAs são rotulados e hibridizados em lâminas de microensaio feitas internamente. Finalmente, a lâmina é lavada e, em seguida, as lâminas são digitalizadas e analisadas. Em última análise, o microarray é usado para mostrar as alterações transcriptômicas nas células bacterianas sob a condição específica.

A principal vantagem da tecnologia de microarray de DNA sobre outros métodos existentes para estudar a expressão gênica, como QPCR ou northern blotting, é que ela fornece uma visão global de todas as alterações transcriptômicas incorridas em uma condição específica. É rápido, confiável e relativamente barato. Demonstrando o procedimento estarão Mohammed Sal e Airon Manzu, alunos PSD do meu laboratório em genética molecular Após o descongelamento, s pmo, pellets de células ED 39 e Resus suspensos em 400 microlitros de te de acordo com o protocolo de texto, prepare o seguinte em tubos de tampa de rosca livre de RNA, 0,5 gramas de contas de vidro, 50 microlitros de 10% SDS 500 microlitros de fenol clorofórmio previamente preparado e os pellets de células ressuspensas.

Para quebrar as células, coloque os tubos em um batedor de esferas e homogeneize duas vezes por 60 segundos cada, colocando-os no gelo por um minuto entre os pulsos, depois centrifugue as amostras a 10.000 Gs e quatro graus Celsius por 10 minutos. Transferir a fase superior para um tubo novo e, a 500 microlitros de clorofórmio ia, a, centrifugar durante mais cinco minutos. Pipete 500 microlitros da fase superior para tubos frescos.

Adicione dois volumes de tampão de ligação de lise e misture pipetando para cima e para baixo. Em seguida, usando um kit de isolamento de RNA, isole o RNA total seguindo o protocolo do fabricante para remover o DNA contaminante do RNA. Adicione 100 microlitros de uma mistura de D a e incube a 15 a 25 graus Celsius por 20 a 30 minutos.

Use o kit do RN a para lavar o RNA limpo e eluir em um volume de 50 microlitros para realizar a reação de ajoelhar em tubos de PCR de 300 microlitros. Misture o RNA total com dois microlitros de monômeros aleatórios e use água livre de nuclease, se necessário, para aumentar o volume para 18 microlitros. Incube a mistura ajoelhada a 70 graus Celsius por cinco minutos.

Em seguida, resfrie as reações em temperatura ambiente por 10 minutos e dê uma volta rápida antes de colocar os tubos no gelo por pelo menos um minuto. Para transcrever o CDNA, prepare a mistura de transcrição reversa, combine 18 microlitros da mistura com 12 microlitros de master mix e incube a reação a 42 graus Celsius por duas a 16 horas. Degrade o mRNA da reação adicionando três microlitros de 2,5 molares e um OH e coloque-o a 37 graus Celsius por aproximadamente 15 minutos.

Em seguida, adicione 15 microlitros de ácido livre de dois montes molares para neutralizar o NAOH. Então, depois de usar colunas de limpeza de PCR para purificar o CDNA com um espectrofotômetro, meça a concentração de CDNA para rotular o CDNA. Adicione cinco microlitros de um corante reativo médio a 20 a 60 nanogramas por microlitro de CDNA.

Coloque a mistura no escuro e incubado em temperatura ambiente por 60 a 90 minutos antes de usar colunas de limpeza PR para purificar o corante rotulado com CDNA escapando em 50 microlitros de tampão de evolução com um espectrofotômetro, certifique-se de que a concentração de CDNA marcada seja de pelo menos 0.5 pico moles por microlitro em um volume total de 50 microlitros. Depois de preparar o buffer tímido, de acordo com o protocolo de texto, pré-aqueça o buffer a 68 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Para preparar a amostra, combine quantidades iguais de CDNAs marcados e, em seguida, use concentradores a vácuo em alta temperatura para reduzir o volume para sete microlitros ou menos.

Enquanto isso, para limpar as tiras do elevador para reduzir o sinal de fundo, use sabão e bastante água da torneira, seguido de 100% de etanol após a secagem das tiras do levantador, coloque uma em uma corrediça com o forro de Teflon branco voltado para baixo. Em seguida, dissolva as amostras de corante seco em sete microlitros de H2O e incube a 94 graus Celsius por dois minutos. Adicione imediatamente 35 microlitros de tampão tímido pré-aquecido, misture delicadamente e gire e gire na velocidade máxima por um minuto.

Para precipitar pellets, pré-aqueça a sonda a 68 graus Celsius por aproximadamente cinco minutos antes de carregá-la. Para montar a corrediça e o deslizamento do levantador, coloque o suporte da corrediça de hibridização em um bloco de calor a 50 graus Celsius. Coloque as lâminas de microarray de DNA com o deslizamento do elevador no suporte da lâmina de hibridização aquecida e pré-aqueça o slide com o deslizamento do levantador por um minuto.

Em seguida, o mais rápido possível, adicione 40 microlitros do alvo da amostra ao final da lâmina. Permita que o fluido flua entre as superfícies do vidro por força capilar. Agora remova o de hibridização pré-aquecido do forno de hibridização e feche a máquina.

Em seguida, coloque o papel de filtro embebido em três mililitros de dois XSSC no de hibridização. Coloque cuidadosamente o suporte da corrediça de hibridização com corrediças no de hibridização. Feche o de hibridização e coloque-o de volta no forno de hibridização e incube por 16 a 18 horas.

Para lavar as lâminas, prepare os amortecedores de lavagem um, dois e três e coloque-os a 30 graus Celsius. Para garantir que o SDS se dissolva quando a incubação estiver completa, submerja suavemente as lâminas o mais rápido possível em um tubo Falcon cheio de 50 mililitros de tampão de lavagem, um até que o vidro fique no fundo do tubo. Depois que o elevador escorregar, afundar no fundo do tubo sem arranhar a matriz, use uma pinça para remover a corrediça e coloque-a no rack da estação de lavagem.

Use imediatamente 500 mililitros de tampão de lavagem um para lavar as lâminas por cinco minutos. Em seguida, transfira as lâminas para o tampão de lavagem dois por 20 a 30 minutos antes de transferi-las para 500 mililitros de tampão de lavagem três por cinco minutos. Finalmente, seque as lâminas a 2000 RPM por dois minutos antes de realizar a análise de microarray.

De acordo com o protocolo de texto para estudar o impacto da L serina em todo o transcriptoma da pneumonia por S, foi realizada uma análise de microarranjo de cepas D 39 Wildtype da cepa D 39 cultivada em CDM com 150 micromolares de L Sena, em comparação com aquela cultivada em 10 milimolares de L Sena no mesmo meio. Esta tabela lista as concentrações de RNA total isolado de cada cultura, conforme mostrado nesta figura. Após a remoção do DNA, a qualidade do RNA foi examinada.

Essas duas pistas representam RNA de 150 sena micromolar, e essas duas pistas são de culturas cultivadas com 10 milimolares de sena. A presença de duas bandas claras indica RNA de boa qualidade. As concentrações de CDNA sintetizadas a partir do RNA total são registradas nesta coluna e as amostras marcadas com corante reativo médio AM estão listadas aqui.

Uma análise de gráfico de dispersão da razão média de matrizes reativas AM é vista nesta figura, e os dados foram analisados posteriormente para reduzir o ruído. Esta tabela resume os resultados dos estudos de microarray após a aplicação dos critérios de maior ou igual a uma diferença dupla e um valor de P inferior a 0,001. Como visto aqui, vários genes foram diferencialmente expressos na presença de L serina mínima em comparação com o máximo Após este procedimento.

Outros métodos como beag, ensaios de eletrócitos QPCR, nocaute e / ou força de expressão podem ser usados para responder às próximas perguntas após seu desenvolvimento. Essa técnica deu aos pesquisadores do VFR no campo da biologia molecular e celular a oportunidade de explorar as redes e mecanismos regulatórios no RAM positivo.