Name: Geração de Lymphocytic micropartículas e Detecção de seu efeito pró-apoptóticos em células epiteliais das vias aéreas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Aprenda a produzir micropartículas linfocitárias in vitro a partir de linhas celulares de linfócitos T e detectar seus efeitos pró-apoptóticos em células epiteliais das vias aéreas usando análise de fluxo e cultura de explantes.

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Este trabalho é apoiado por subsídios da Canadian Institutes of Health Research (178.918), Fonds de recherche en santé du Québec - Visão Rede de Investigação em Saúde.

NOTA: Masculino camundongos C57BL / 6 (5-7 semanas de idade) são de Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Canadá.) E manipulados de acordo com protocolos aprovados pela Comissão de CHU Sainte-Justine Animal Care. Rato explantes de tecido dos brônquios fornecer uma boa fonte de células epiteliais brônquicas primárias para investigar os efeitos pró-apoptóticos de LMPS em células epiteliais. Este protocolo descreve a geração in vitro de LMPS, bem como um método para detectar células apoptóticas epiteliais brônquicas em explantes de tecido tratados com LMPS. Este protocolo é composta de 3 seções. 1. LMPS produção e caracterização NOTA: Para evitar a contaminação, garantir que todos os materiais utilizados no experimento são estéreis ou autoclavado. Execute todas as etapas na RT em uma cabine de segurança biológica em condições estéreis, salvo indicação em contrário. 1.1) Estímulo e Recolha de MPs9 <ol><li> Descongelar uma aliquota de 10 milhões de células T CEM em um banho de água a 37 ° C. Dilui-se em 10 ml de meio pré-aquecido hematopoiéticas, tais como X-Vivo, em um tubo de 15 ml estéril e centrifugar a 200 gx 5 min isento de soro. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de meio de pré-aquecido. </li><li> Transferência de células para um balão de cultura de tecidos T75 (para as células em suspensão) com 15 ml de meio pré-aquecido hematopoiéticas, tais como X-Vivo e incubar durante 4 dias numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Após 4 dias, transferir todo o meio de cultura e as células para um balão de cultura de tecidos T175 contendo 100 ml de meio fresco. Continuar a incubação das células durante cerca de 72 horas sob as mesmas condições até terem crescido até uma densidade de 2 milhões de células / ml. </li><li> Células uniformemente dividida entre quatro frascos T175 contendo cada um 150 ml de meio fresco e continuam até que as células de cultura de células foram cultivadas (aproximadamente 48 horas de incubação) a uma densidade de 2 milhões / ml. </li><li&gt; Recolher as células de cada balão por centrifugação a 200 xg durante 5 min e ressuspender 300 x 10 6 células para um novo frasco T175 contendo 150 ml de meio fresco, para manter a 2 milhões / ml de densidade celular. </li><li> Adicionar actinomicina D (dissolvido em DMSO a 2 mg / ml) ao meio, numa concentração final de 0,5 ug / ml e incubar durante 24 horas. </li><li> Transferir todo o meio de cultura para tubos cónicos de 50 ml e girar para baixo as células a 750 xg durante 5 min. Transferir o sobrenadante para 50 ml tubos cónicos e centrifugar a 1500 xg por 15 min para remover fragmentos de células grandes. </li><li> Transferir o sobrenadante para um frasco de 250 ml e ultracentrífuga a 12.000 xg durante 50 min. Desprezar o sobrenadante e recolher pellets. </li><li> Lavar peletes LMPS enriquecido com 40 ml de PBS estéril num tubo de 50 ml por centrifugação a 12.000 xg durante 50 min. Repita esta etapa duas vezes. </li><li> Recolher o último sobrenadante da lavagem; ele será usado como controlo do veículo. Suspender as pastilhas em 1 LMPSml de PBS e transferir para um microtubo de 1.5 ml estéril. Alíquotas e armazenar LMPS isoladas a -80 ° C (para evitar múltiplos ciclos de livre-descongelamento). </li></ol> 1.2) Caracterização de MPs via Análise FACS 4 <ol><li> Preparar 2 amostras de tampão de anexina, com uma e outra sem CaCl2: Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, mais ou menos 5 mM de CaCl2. </li><li> Filtro de tampão de FACS e anexina fluxo do fluido do invólucro através de um filtro de 0,22 um para remover as partículas. </li><li> Dilui-se 1 ul de LMPS em 44 ul de tampão de anexina com CaCl2 a 5 mM para um tubo de FACS. Preparar outro tubo com 1 ml de LMPS em 44 ul de tampão de anexina sem CaCl2 (controle negativo). </li><li> Adiciona-se 5 ul de annexinV-Cy5 em cada tubo e misturar bem. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Parar a reacção por diluição da mistura com 400 ul de fluido de revestimento de fluxo FACS em cada tubo. </li><li> Adicionam-se 10 ul (200000 pérolas), de 7 mm de contagem beasuspensão ds como padrão interno em cada tubo para se obter uma contagem absoluta. </li><li> Estabelecer portas do tamanho relativo (FSC-H, PMT E00, escala logarítmica) e granularidade relativa (SSC-H, PMT 325, escala logarítmica) gráfico de pontos no citômetro de fluxo utilizando partículas fluorescentes calibrado de tamanho de 1 mm (portão 1) e contando grânulos portão 7 mm (portão 2). </li><li> Analisar a amostra LMPS em FSC-H enredo / SSC-H usando os portões estabelecidos e FL-4 canais para anexina (PMT 765, escala logarítmica) gráfico de pontos, através da aquisição de um sinal de até 20 mil contas de contagem são alcançado em portão 2. </li><li> Determinar os eventos positivos de annexinV LMPS em tampão de anexina contendo CaCl 2 e em seguida subtrair os eventos de LMPS em tampão de anexina sem CaCl2 (controle negativo). </li><li> Calcula-se o número absoluto de MPs com base na seguinte equação: <img alt="Equação 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52651/52651eq1.jpg" /></li></ol> 1.3) Determinação do MP Protein Concentração (Ensaio de Bradford) <ol><li> Prepare a 5 diluições em série de um padrão de proteína 1,25-20 ug / ml. Pipetar 800 ul de cada solução padrão e amostra para um tubo de ensaio limpo em duplicado. Adicionar 200 ul de reagente corante de Bradford a cada tubo. Misture bem, em seguida incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Medir a absorvância a 595 nm. Determinar a concentração de proteína de LMPS utilizando a regressão linear da curva padrão. </li></ol> 2. explantes tecido brônquico e Tratamento LMPS NOTA: Preste atenção especial para o ambiente de trabalho estéril, e assepticamente preparar as soluções e médio utilizadas nos seguintes experimentos. Para preparar o meio de cura completa, adicionar 1 ml de tecido em cicatrização Médias Suplementos com Serum (descongeladas em gelo) a 100 ml Tissue Cura Médio e misture bem. 2.1) Preparação de explantes de tecidos bronquiais <ol><li> Antes de cultura, arranhar 6 áreas de 1 cm 2cada um na extremidade da superfície de cada 100 milímetros prato de cultura de tecidos com uma lâmina de bisturi. Casaco cada riscado 100 mm de prato de cultura de tecido com 2 ml da solução de revestimento de prato de cultura, e incuba-se a placa em uma incubadora de CO 2 humidificado O / N a 37 ° C. Vacuum aspirar a solução excedente e encher o prato com 15 ml de lavar roupa Tissue Medium. </li><li> Eutanásia camundongos C57BL / 6 (5-7 semanas de idade) por inalação de CO2 de acordo com protocolos aprovados pelo comitê de ética do cuidado animal. </li><li> Assepticamente dissecar tecido pulmonar com bisturi, Dumont super fino pinça e tesouras cirúrgicas. Remova cuidadosamente vasos do parênquima e do sangue. Coloque o tecido pulmonar em gelada Tissue lavar Médio para o transporte para o laboratório, se for o caso. </li><li> Além disso dissecar brônquio submerso no meio de lavagem de tecidos e separar o brônquio com um diâmetro de 1 a 2,5 mm a partir de tecidos periféricos de pulmão. Fatia tecidos bronquiais em ~ 5 milímetros anéis brônquica grossas com um bisturi. </li&gt; <li> Use um movimento de escavar com as estéreis forceps microdissecting curvas para pegar os fragmentos dos brônquios e colocá-los para as áreas riscadas dos pratos. </li><li> Remover o meio de lavagem de tecidos, e os fragmentos incubar à temperatura ambiente durante ~ 5 min para permitir que adiram aos pratos. </li><li> Adicionar 10 ml de meio de cura completa para cada prato e coloque-os em uma atmosfera controlada câmara incubadora modular. Lave com a câmara de mistura de gás de alta O 2 (70% de O2, 25% de N2 e 5% de CO 2,). Coloque a câmara numa incubadora orbital de bancada e agite-o a 37 ° C. Agitar a câmara durante 24 horas a 10 ciclos por minuto para permitir que a forma de fluir de forma intermitente ao longo dos fragmentos. </li><li> Após 24 horas de incubação, observar os explantes de tecido sob um microscópio de luz de contraste de fase invertida. Selecione explantes brônquica, com completa, movimento cabelos finos e animada epitélio brônquico para tratamento LMPS subseqüente. </li></ol>2.2) Tratamento LMPS <ol><li> Prepare meio de crescimento completo como se segue: Crescimento de degelo suplementos médias com soro e de fibroblastos inibidor sobre gelo. Adicionar 1 ml de meio de crescimento os suplementos com soro e 200 ul de inibidor de fibroblastos a 100 ml de meio de crescimento; homogeneizar. Aquecer o meio de crescimento completo a 37 ° C durante 10 min antes da utilização. </li><li> Diluir LMPS isolados em um novo tubo eppendorf estéril com PBS para preparar um estoque LMPS a uma concentração de 800 ug / ml. </li><li> Adicionar 0,5 ml de Meio Completo Crescimento para cada poço de uma placa de 12 poços de cultura de tecidos. </li><li> Transferir os explantes brônquicas seleccionados com os fórceps microdissecting curvas do protocolo anterior (secção 2.1) a cada poço da placa de cultura de tecido. </li><li> Rotular a placa de cultura de forma adequada para identificar LMPS poços de tratamento e poços de controlo. Adicionar 25 ul LMPS estoque em cada tratamento bem LMPS (para uma concentração final de 40 ug / ml) e 25 ul de veículo de controlo (ver LMP<html> s produção) aos poços de controlo. </li><li> Continuar a incubação num incubador modular câmara de atmosfera controlada a 37 ° C com agitação suave. </li><li> Após 24 horas, lavar explantes 3 vezes com PBS e avançar para a (fixação paraformaldeído a 4% [PFA]) próximo passo. </li></ol> 3. exame histopatológico 3.1) Prepare as seguintes soluções antes de prosseguir para as próximas etapas <ol><li> Preparar tampão PBS 1x por mistura de NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,76 mM, KH 2 PO 4, pH 7,4. </li><li> Para preparar PFA a 4%, dissolver 20 g de PFA em 400 ml de água, aquecida a 60 ° C com agitação; adicionar algumas gotas de NaOH 10 M para limpar a solução. Em seguida adicionar tampão de PBS 1x e ajustar o volume para 500 ml e o pH a 7,4. Filtrar e alíquota; armazenar a -20 ° C. </li><li> Prepare os seguintes reagentes de desidratação ou de reidratação; 100%, 90%, 70%, etanol a 50% e xileno. </li></ol>e_step &quot;&gt; 3.2) Explant Fixation e Tissue Seção desparafinização <ol><li> Colocar cada explante num tubo de microcentrífuga marcado com 1,5 ml de 4% de PFA e incubar O / N a 4 ° C. Lavar os explantes duas vezes com PBS 1x. </li><li> Desidratar explantes através de uma série de álcoois (etanol a 70%: 3 vezes 30 minutos cada; etanol a 90%: 2 vezes 30 minutos cada; etanol a 100%: 3 vezes cada 30 min, em seguida, o xileno: 3 vezes 20 min cada). Execute todas as etapas na RT em um exaustor. </li><li> Imbed explantes de tecido em parafina a 58 ° C num forno. Prepare 5 mm de espessura de tecido usando um micrótomo rotativo. </li><li> Float as seções em um banho de água a 56 ° C, e em seguida, montar as secções em lâminas histológicas marcados. Colocar as lâminas em cavaletes de coloração manuais e seco a 65 ° C durante 1 h. Permitir que os slides para esfriar em temperatura ambiente. </li><li> Mergulhe as prateleiras em 4 pratos mancha consecutivos contendo xileno por 10 min cada, para remover a parafina. Mergulhar as prateleiras em uma série de etanol para remover o xileno: 100%, depois 95%, thpt 80%, em seguida, 70%, em seguida etanol a 50% (5 minutos para cada etapa). Lavar as cremalheiras com água da torneira durante 5 minutos para remover o etanol. </li></ol> 3.3) Hematoxilina e Eosina (H &amp; E) Coloração <ol><li> Continue trabalhando com os cortes de tecidos fixos; colocar o suporte para um prato de coloração com hematoxilina de Mayer durante 15 min. Lavar o rack com água da torneira para remover Hematoxilina para 20 min. </li><li> Colocar em água destilada durante 30 sec.Place em etanol a 95% durante 30 seg. Coloque em Eosina Y coloração solução prato para 1 min. Desidratar através de duas mudanças de etanol a 95%, etanol a 100%, e de xileno durante 2 min cada. </li><li> Realize uma verificação rápida sob um microscópio para garantir que o excesso de eosina é removido. Coloque 2 a 3 gotas de Meio de Suporte (Fisher SP15-100) em cada slide, em seguida, cubra com uma tampa de vidro. </li></ol> 3.4) In Situ celular Detecção de morte: TUNEL Assay <ol><li> Antes de começar, preparar a solução de trabalho de proteinase K: 20 ug / ml emTris 10 mM / HCl, pH 7,4. </li><li> Repita os passos 1 a 5 da secção 3.2 (fixação Explant e tecido seção desparafinização). Lavar as lâminas com deionizada H 2 O. </li><li> Mergulhar as lâminas com 1x PBS durante 10 min. Escorra o excesso de PBS. Incubar as secções de tecido, durante 30 min à temperatura ambiente com uma solução de proteinase K a trabalhar. Lavar as lâminas duas vezes com PBS 1x. </li><li> Realize o ensaio TUNEL conforme descrito no manual de instruções do kit de detecção de morte celular. Montar usando meio de montagem, e lamela manualmente com lamelas de vidro. </li><li> Analisar amostras sob um microscópio de luz. Use Imagem Pro 4.5 para analisar as células em apoptose na cor marrom. </li></ol>

<ol><li>Tushuizen, M. E., Diamant, M., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+microparticles+in+the+pathogenesis+of+cardiovascular+disease%3A+friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-derived microparticles in the pathogenesis of cardiovascular disease: friend or foe.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 4-9 (2011).</li>
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<li>Maeno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+Cells+are+required+for+inflammation+and+destruction+in+cigarette+smoke-induced+emphysema+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice.</a> J Immunol. 178 (12), 8090-8096 (2007).</li>
<li>Qiu, Q., Xiong, W., Yang, C., Gagnon, C., Hardy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte-derived+microparticles+induce+bronchial+epithelial+cells%27+pro-inflammatory+cytokine+production+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte-derived microparticles induce bronchial epithelial cells' pro-inflammatory cytokine production and apoptosis.</a> Mol Immunol. 55 (3-4), 220-230 (2013).</li>
<li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shed+membrane+particles+from+T+lymphocytes+impair+endothelial+function+and+regulate+endothelial+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Shed membrane particles from T lymphocytes impair endothelial function and regulate endothelial protein expression.</a> Circulation. 109 (13), 1653-1659 (2004).</li>
<li>Shet, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li>
<li>Mause, S. F., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles%3A+protagonists+of+a+novel+communication+network+for+intercellular+information+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange.</a> Circ Res. 107 (9), 1047-1057 (2010).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-proliferative+and+anti-tumour+effects+of+lymphocyte-derived+microparticles+are+neither+species-+nor+tumour-type+specific%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Anti-proliferative and anti-tumour effects of lymphocyte-derived microparticles are neither species- nor tumour-type specific.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Soleti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles+harboring+Sonic+Hedgehog+promote+angiogenesis+through+the+upregulation+of+adhesion+proteins+and+proangiogenic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Microparticles harboring Sonic Hedgehog promote angiogenesis through the upregulation of adhesion proteins and proangiogenic factors.</a> Carcinogenesis. 30 (4), 580-588 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

MPs são mediadores ativos de conversas cruzadas intercelular e seu estudo é promissor em muitas áreas da ciência. 11 Este estudo apresentou um protocolo detalhado para in vitro geração em larga escala de LMPS derivado de uma linha de células T por apoptose. Estas MPs expressar um grande repertório de moléculas de linfócitos e são biologicamente implicado na regulação da homeostase celular e tecidual. No entanto, LMPS derivadas de diferentes fontes podem ser biologicamente diferente. 4,9,12,13</s...

Micropartículas (MPs) são vesículas de membrana submicrônica biologicamente ativas liberadas após ativação celular ou apoptose. Os MPs são derivados de células saudáveis e danificadas e estão implicados em muitos processos fisiológicos e patológicos. 1 MPs foram detectados não apenas no plasma humano, mas também no tecido inflamatório e apoptótico. A utilidade biológica dos MPs derivados da membrana celular foi demonstrada em vários ambientes, incluindo modelos de sinalização celular e como ferramentas farmacológicas. 2,3 Demonstramos anteriormente que as LMPs derivadas de linfócitos T após estimulação com actinomicina D (para induzir apoptose) suprimem a angiogênese e inibem a sobrevivência e proliferação de células endoteliais. 4,5 Os efeitos antiangiogênicos das DUM podem variar significativamente dependendo dos estímulos utilizados para ativar os linfócitos T in vitro. 6
O epitélio das vias aéreas funciona como uma barreira física e funcional protetora. O aumento do número de linfócitos T nas vias aéreas pode contribuir para danos celulares e inflamação das vias aéreas. 7 Mostramos que as LMPs induzem apoptose de células epiteliais brônquicas humanas,8 o que indicou que as LMPs podem alterar a função de barreira do epitélio brônquico in vivo. As células apoptóticas podem ser identificadas usando o método TUNEL, que detecta a fragmentação do DNA in situ. 
O objetivo geral deste protocolo é ilustrar a produção in vitro de LMPs a partir de uma linhagem celular de linfócitos T e demonstrar seu efeito pró-apoptótico nas células epiteliais das vias aéreas. A detecção de morte celular in situ demonstrou que as LMPs induzem fortemente a morte celular do epitélio brônquico das vias aéreas, sugerindo que a lesão mediada por LMPs no epitélio das vias aéreas pode afetar a função de barreira do epitélio danificado.

<table><tbody><tr><td>Produção e caracterização</td><td></td><td></td><td></td>de LMPs</tr><tr><td>de células T CEM&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CCL-119</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 médio&nbsp;</td><td>Cambrex, Walkersville</td><td>04-744Q</td><td></td></tr><tr><td>Frasco T75</td><td>Sarstedt</td><td>83.1813.502</td><td></td></tr><tr><td>Frasco T175</td><td>Sarstedt</td><td>83.1812.502</td><td></td></tr><tr><td>Actinomicina&nbsp; D&nbsp;</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>A9415-2mg</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lifetechnologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &micro; m filtro</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Annexin-VCy5</td><td>BD Pharmagen&nbsp;</td><td></td><td></td>559933</tr><tr><td>solução de fluxo FACS</td><td>BD Bio-sciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas fluorescentes (1 &micro; m)</td> <td>Sondas Moleculares</td><td>T8880</td><td></td></tr><tr><td>Contas de contagem de poliéster (7 &micro; m)</td> <td>Bangs laboratories</td><td>PS06N / 6994</td><td></td></tr><tr><td>Tubos FACS de polipropileno</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de 1 ml</td><td>Fisher</td><td>13-678-11B</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de 5 ml</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de 25 ml</td><td>Ultident</td><td>DL-357551</td><td></td></tr><tr><td>Microtubo cônico de polipropileno de 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.690</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de polipropileno de 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de polipropileno de 50 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de copolímero de polipropileno de alta velocidade de 50 ml Nalgene</td><td></td><td>3119-0050</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de polipropileno de alta velocidade de 250 ml</td><td>Beckman</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de proteína (ensaio de Bradford)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Padrão de ensaio de proteína II</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>500-0007</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ensaio 16 x 100</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ensaio 12 x 75</td><td>Ultident</td><td>170-14100005B</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de células&nbsp;</td><td>Centrífuga de baixa velocidade Mandel</td><td>Heracell 150</td><td></td></tr><tr><td></td><td>IEC</td><td>Centra8R</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de alta velocidade</td><td>Beckman</td><td>Avanti J8</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de alta velocidade para garrafa de 250ml</td><td>Beckman</td><td>JLA16.250</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de alta velocidade para tubo de 50ml</td><td>Beckman</td><td>JA30.50</td><td></td></tr><tr><td>Fow citometria&nbsp;</td><td>BD Bio-sciences</td><td>FACS Calibur</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Beckman</td><td>Series 600</td><td></td></tr><tr><td>Explantes e seções de tecido brônquico&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camundongos C57BL/6 (5-7 semanas de idade)&nbsp; &nbsp;</td><td>Charles River Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Via Aérea do Mouse PrimaCell&trade; Sistema:</td> <td>CHI Scientific, Inc.</td><td>2-82001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Lâminas de Bisturi de Aço Carbono com Costas Costelas</td><td>Becton Dickinson AcuteCare</td><td>371310</td><td>#10</td></tr><tr><td>Cabo de Bisturi</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>10003-12</td><td>#7</td></tr><tr><td>microscópio invertido de contraste de fase</td><td>Olympus Optical CO., LTD.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>mistura de gases com alto teor de O2&nbsp;</td><td>VitalAire Canadá Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>câmara de incubadora modular</td><td>Billups-Rothenberg Inc.</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000 agitador orbital incubado</td><td>Barnstead Lab-Line,&nbsp;</td><td>SHKA4000-7</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 12 poços</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de plástico (100 mm)</td><td>Sarstedt, Inc.</td><td>83.1802</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>14060-09</td><td>Reta, afiada, 9cm de comprimento</td></tr><tr><td>Pinça Graefe Semicurvada</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>incubadora de CO2 umidificado</td><td>Mandel Scientific Company Inc.&nbsp;</td><td>SVH-51023421</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Exame histopatológico&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>formalina formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>parafina</td><td>Fisher scientific&nbsp; Internacional, Inc.</td>Álcool etílico <td>T555</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Merck KGaA, Darmstadt</td><td>EX0278-1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; glutaraldeído&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>G6403</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>31533</td><td></td></tr><tr><td>lâminas de microscópio</td><td>VWR Scientific Inc.&nbsp;</td><td>48300-025</td><td>25x75 mm</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher scientific&nbsp; Internacional, Inc.</td><td>X5-4</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina de Mayer</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>Funil MHS16</td><td>com papel de filtro&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>Fisher científico&nbsp; Internacional, Inc. &nbsp;</td><td>A144s-500</td><td></td></tr><tr><td>eosina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>HT110116</td><td>Funil com papel de filtro&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Permount&trade; Meio de Montagem</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.&nbsp;</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>lamínula de vidro</td><td>surgipath medical industries, Inc.</td><td>84503</td><td>24&vezes; 24&nbsp;#1&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de detecção TUNEL</td><td>Detecção de morte celular in situ, POD</td><td>11 684 817 910</td><td></td></tr><tr><td>forno</td><td>Despatch Industries Inc.</td><td>LEB-1-20</td><td></td></tr><tr><td>micrótomo rotativo</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>RM2145</td><td></td></tr><tr><td>papel de filtro</td><td>Whatman International Ltd.</td><td>1003150</td><td>#3</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Nikon Imaging Japan Inc.</td>Placa de coloração <td>E800</td><td></td></tr><tr><td>completa</td><td>Wheaton Industries, Inc.</td><td>900200</td><td>incluindo prato, rack, tampa</td></tr><tr><td>tubo eppendorf de 1,5 ml</td><td>Sarstedt Inc.&nbsp;</td><td>72.69</td><td>39x10 mm</td></tr><tr><td>Banho de Água Orbital e Alternativo</td><td>ExpotechUSA</td><td>ORS200</td><td></td></tr><tr><td>tampão fosfato salino&nbsp; &nbsp;</td><td>Hotte GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nicram RD Service</td><td>3707E</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de lymphocytic micropartículas e detecção de seu efeito pró-apoptóticos em células epiteliais das vias aéreas

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

O interesse nas funções biológicas de células derivadas de vesículas de membrana em comunicação célula-célula tem aumentado nos últimos anos. As micropartículas (MP) são um tal tipo de vesículas, que variam em diâmetro de 0,1 mm a 1 mm, e normalmente eliminados da membrana plasmática de células eucarióticas submetidos a activação ou a apoptose. Aqui descreve-se a geração de linfócitos T derivados de micropartículas (LMPS) a partir de células CEM T apoptóticas estimuladas com actinomicina D. LMPS são isoladas através de um processo de múltiplos passos de centrifugação diferencial e caracterizadas por citometria de fluxo. Este protocolo também apresenta um método de detecção da morte celular in situ para demonstrar o efeito pró-apoptótica de LMPS em células epiteliais brônquicas derivadas de rato primários respiratórias explantes de tecido brônquico. Os métodos aqui descritos proporcionam um procedimento reprodutível para o isolamento de quantidades abundantes de LMPS de linfócitos apoptóticos in vitro. LMPS derivadodeste modo pode ser utilizado para avaliar as características de vários modelos de doenças, e para a farmacologia e toxicologia de teste. Dado que o epitélio das vias aéreas como uma barreira física e funcional protectora entre o ambiente externo e o tecido subjacente, o uso de explantes de tecido brônquico, em vez de linhas de células epiteliais imortalizadas fornece um modelo eficaz para investigações que requerem tecido vias aéreas.

LMPS foram caracterizados com coloração de anexina V por 10 células activadas por fluorescência (FACS) e fechado utilizando uma pm grânulos em que 97% das MPs (≤1 um) foram anexina-V-Cy5 positivo (Figura 1A e 1B). Normalmente, cerca de 2,5 mg de LMPS foram obtidos seguindo este protocolo. Explantes de tecido brônquico de ratos C57BL / 6 foram submetidos a tratamento e LMPS veículo. A análise histopatológica das secções brônquicas revelado o efeito de LMPS sobre a integridade estrutural do epi...

Micropartículas verter à membrana celular (MPs) são vesículas biológicas activas que podem ser isolados e os seus efeitos patofisiológicos investigados em vários modelos. Descrevemos aqui um método para a geração de MPs derivadas de linfócitos T (LMPS) e para demonstrar o seu efeito pró-apoptóticos em células epiteliais das vias respiratórias.

Geração de Lymphocytic micropartículas e Detecção de seu efeito pró-apoptóticos em células epiteliais das vias aéreas

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

O objetivo geral deste procedimento é ilustrar a produção in vitro de micropartículas linfocíticas ou LMPs a partir de uma linhagem celular de linfócitos T e demonstrar seu efeito pró-apoptótico sobre células epiteliais das vias aéreas. Isso é realizado primeiramente produzindo as LMPs. Em seguida, as LMPs isoladas são caracterizadas por análise de fax.Em seguida, os explantes de tecido brônquico são cultivados. Por fim, o tratamento com LMP em explantes brônquicos é realizado. Em última análise, exames histopatológicos, como hematoxilina, eosina e detecção de morte celular NC dois, são utilizados para demonstrar o dano induzido por LMP na camada epitelial brônquica e a apoptose das células epiteliais.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o isolamento de micropartículas do sangue periférico humano, é que somos capazes de realizar a geração em larga escala de micropartículas derivadas de uma linhagem celular por ação in vitro. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque as etapas críticas do cultivo de explante brônquico não são fáceis de preparar. Para iniciar o cultivo.Cultive células CEMT em quatro frascos T 175,

generation-lymphocytic-microparticles-detection-their-proapoptotic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Descrevemos os protocolos para a colheita murinos macrófagos alveolares, que são residentes as células imunes inatas no pulmão, e examinando a sua ativação em resposta a co-cultura com nanopartículas polianidrido.

Colheita Murino macrófagos alveolares e Avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido

Este vídeo demonstra a geração e o isolamento de micropartículas derivadas de linfócitos T, LMPs, a partir de linfócitos T após o tratamento com actinomicina-D.

Isolamento de Micropartículas Derivadas de Linfócitos T Apoptóticos In Vitro

Este vídeo demonstra um método para induzir a apoptose nas células Jurkat - uma linha celular de leucemia de linfócitos T humanos. As células são expostas à radiação ultravioleta C (UVC), que causa extensos danos ao DNA e leva à morte celular apoptótica.

Uma técnica in vitro para geração mediada por irradiação UV de células T apoptóticas

Descreve-se um método para a geração de corte de precisão pulmonar fatias (PCLS) e imunocoloração-los para visualizar a localização de vários tipos de células imunitárias no pulmão. Nosso protocolo pode ser estendido para visualizar a localização e função de muitos tipos diferentes de células sob uma variedade de condições.

Rato pulmão Slices para Visualize células vivas pulmonar dendríticas precisão de corte

Novos protocolos são descritos aqui para isolar e caracterizar micropartículas derivadas de humanos e neutrófilos de rato. Estes protocolos utilizam ultracentrifugação, citometria de fluxo e immunoblotting técnicas para analisar o conteúdo de micropartículas, e eles podem ser usados para estudar o papel das micropartículas derivados de vários tipos de células na função celular.

Isolamento e caracterização de micropartículas de neutrófilos-derivado para estudos funcionais

O protocolo introduzido aqui permite a caracterização da capacidade pulmonar localizador de linfócitos humanos primários sob condições inflamatórias em vivo. Infiltração pulmonar de enviaram transferidas células imunes humanas em um modelo do rato da inflamação alérgica pode ser fotografada e quantificada por microscopia de fluorescência de luz-folha de tecido pulmonar quimicamente limpo.

Avançado de imagem do pulmão Homing linfócitos humanos em um Experimental em modelo Vivo de inflamação alérgica baseada em microscopia de luz-folha

Este manuscrito descreve um protocolo para determinar se a exposição ao ozônio, um critério poluente aéreo, prejudica a efferocitose alveolar do macrófago in vivo. Este protocolo utiliza reagentes e técnicas comumente usados e pode ser adaptado a vários modelos de lesão pulmonar para determinar os efeitos sobre a efferocitose do macrófago alveolar.

In vivo avaliação da Efferocitose de macrófago alveolar após exposição ao ozônio

Ozônio combinado e endotoxina bacteriana exposição de camundongos mostram morte celular generalizada, incluindo a de neutrófilos. Observamos adaptações celulares como interrupção da lamellipodia citoesquelética, aumento da expressão celular da complexa subunidade de synthase V ATP β e angiostatina na lavagem bronco-alveolar, supressão da resposta imune pulmonar e recrutamento retardado de neutrófilos.

Visualizando adaptações celulares pulmonares durante a lesão pulmonar aguda de ozônio e LPS induzidas por LPS

Apresentamos aqui um método reprodutível, acessível e robusto para o isolamento e expansão de células epiteliais brônquicas primárias para biobanco de longo prazo e geração de células epiteliais diferenciadas por cultura na interface ar-líquido.

Isolando Células Epiteliais Brônquicas de Tecido Pulmonar Ressecado para Biobanco e Estabelecendo Culturas de Interface Ar-Líquido Bem Diferenciadas

Aqui, descrevemos um modelo in vitro para isolar e diferenciar células epiteliais das vias aéreas murinas, com foco em sua aclimatação ao extrato de fumaça de cigarro crônico (CSE). O modelo pode ser utilizado para caracterizar de forma abrangente o impacto multi-ômico do CSE, o que possivelmente fornece informações sobre as respostas celulares sob exposição crônica à fumaça.

Modelo in vitro para estudo da diferenciação e alterações de multiômicas em células epiteliais das vias aéreas murinas estimuladas com extrato de fumaça de cigarro

Aprenda a produzir micropartículas linfocitárias in vitro a partir de linhas celulares de linfócitos T e detectar seus efeitos pró-apoptóticos em células epiteliais das vias aéreas usando análise de fluxo e cultura de explantes.

Geração de Lymphocytic micropartículas e Detecção de seu efeito pró-apoptóticos em células epiteliais das vias aéreas

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