Geração de Lymphocytic micropartículas e Detecção de seu efeito pró-apoptóticos em células epiteliais das vias aéreas

O objetivo geral deste procedimento é ilustrar a produção in vitro de micropartículas linfocíticas ou LMPs a partir de uma linhagem celular de linfócitos T e demonstrar seu efeito pró-apoptótico nas células epiteliais das vias aéreas. Isso é feito produzindo primeiro os LMPs. Em seguida, os LMPs isolados são caracterizados pela análise de fax.

Em seguida, os explantes de tecido brônquico são cultivados. Por fim, é realizado o tratamento da DUM em explantes brônquicos. Em última análise, exames histopatológicos como hemat, toína e eosina e detecção de morte celular NC dois são usados para mostrar danos à camada epitelial brônquica induzidos por LMP e apoptose de células epiteliais.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o isolamento de micropartículas do sangue periférico humano, é que somos capazes de realizar a geração em larga escala de micropartículas derivadas de uma linha celular em ação in vitro. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque as etapas críticas da cultura de explicação dos brônquios não são fáceis de preparar. Para começar a cultura.

Células CEMT em quatro frascos T 1 75, cada um contendo 150 mililitros de fresco, meio e incubar a 37 graus Celsius a uma densidade de 2 milhões de células por mililitro. Recolher as células de cada balão por centrifugação a 200 vezes G durante cinco minutos e dobrar 300 vezes 10 para as seis células num novo balão T 1 75 contendo 150 mililitros de meio fresco. Para manter a densidade de 2 milhões de células por mililitro, adicione 37,5 microlitros de actina micina D ao meio a uma concentração final de 0,5 microgramas por mililitro e incube a 37 graus Celsius por 24 horas.

Transfira todo o meio de cultura para tubos cônicos de 50 mililitros e gire as células a 750 vezes G por cinco minutos. Em seguida, transferir o sobrenadante para tubos cónicos de 50 mililitros e centrifugar a 1500 vezes G durante 15 minutos para remover os fragmentos de células grandes. Em seguida, transferir o sobrenadante para um frasco de 250 mililitros e centrifugar a 12.000 vezes G durante 50 minutos.

Em seguida, descarte o sobrenadante e colete os pellets. Use 40 mililitros de PBS estéril para lavar os pellets enriquecidos com LMP em um tubo de 50 mililitros e centrifugue a 12.000 vezes G por 50 minutos. Repita esta etapa duas vezes.

Colete o sobrenadante da última lavagem para ser usado como controle do veículo com um mililitro de PBS. Suspenda os pellets e transfira para uma alíquota de microtubo estéril de 1,5 mililitro e armazene LMPs isolados a 80 graus Celsius negativos. Para caracterizar micropartículas por análise de fax, comece preparando duas amostras de um tampão de nexina, uma com cloreto de cálcio e outra sem cálcio.

Em um tubo de fax, dilua um microlitro de LMPs em 44 microlitros de um tampão de nexina com cloreto de cálcio. Prepare outro tubo usando um tampão de nexina sem cloreto de cálcio. Em seguida, adicione cinco microlitros de um X e V sci cinco a cada tubo e misture bem, incube no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos.

Após a incubação, use 400 microlitros de fluido da bainha da gripe fax. Para interromper as reações, adicione 10 microlitros de suspensão de contas de contagem de sete mícrons como padrão interno em cada tubo. Para obter uma contagem absoluta, estabeleceram portas de tamanho relativo, FSCH e granularidade relativa SSCH e gráfico de pontos no citômetro de fluxo.

Usando grânulos fluorescentes calibrados de tamanho de um micrômetro para a porta um e contando grânulos a sete micrômetros. Para a porta dois, analise a amostra de DUM em um gráfico F-S-C-H-S-S-C-H usando as portas estabelecidas e o canal FL quatro para o gráfico de pontos de anexina adquirindo um sinal até que 10.000 contas de contagem sejam alcançadas na marcha dois, determine o positivo em eventos ex NV de LMPs em tampão de nexina contendo cloreto de cálcio e subtraia os eventos de LMPs em tampão de nexina sem cloreto de cálcio. Calcule o número absoluto de LMPs com base na seguinte equação.

Utiliza pinças super finas dumont bisturi e tesouras cirúrgicas para dissecar assepticamente o tecido pulmonar. Remova cuidadosamente o parênquima e os vasos sanguíneos. Disseque ainda o brônquio submerso no meio de lavagem do tecido e separe o brônquio com um diâmetro de um a 2,5 milímetros dos tecidos pulmonares periféricos.

Use um bisturi para cortar os tecidos brônquicos em fileiras brônquicas com cerca de cinco milímetros de espessura usando um movimento de escavação com a pinça de microdissecação curva estéril. Pegue os fragmentos brônquicos e coloque-os nas áreas arranhadas dos pratos previamente preparados. De acordo com o protocolo de texto, remova o meio de lavagem do tecido e incube os fragmentos em temperatura ambiente por cerca de cinco minutos para permitir que eles adiram aos pratos.

Adicione 10 mililitros de meio curativo completo a cada prato e coloque-os em uma câmara de incubadora modular de atmosfera controlada com uma mistura de gás com alto teor de oxigênio, lave a câmara, coloque-a em uma incubadora orbital de bancada e agite-a a 37 graus Celsius por 24 horas a 10 ciclos por minuto para permitir que o meio flua intermitentemente sobre os fragmentos. Após a incubação, observe o explanação do tecido sob um microscópio de contraste de fase e luz invertida. Selecione o explanamento brônquico com movimento completo do cabelo fino e epitélio brônquico vivo para o tratamento subsequente da DUM.

Para tratar LMPs, conte o explane brônquico recém-selecionado e marque cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 12 poços. Para cada explan, transfira 0,5 mililitros de meio de crescimento completo para um tubo einor estéril. Em seguida, adicione 25 microlitros de estoque l e p por explan de tratamento ou adicione 25 microlitros de veículo de controle.

Para os explantes de controle, misture bem batendo suavemente no tubo. Transfira o meio misturado para cada poço de uma placa de cultura de tecidos marcada de 12 poços com pinça de microdissecação curva. Transfira cada explanação brônquica x selecionada para cada poço da placa de cultura de tecidos.

Continuar a incubação em uma câmara de incubadora modular de atmosfera controlada a 37 graus Celsius com agitação suave após 24 horas. Use PBS para lavar o EXPLAN três vezes e prossiga para a fixação da coloração h e e do ensaio em túnel. De acordo com o protocolo de texto mostrado aqui, as LMPs foram caracterizadas com uma coloração de nexina V por análise de fax e fechadas usando esferas de um micrômetro, onde 97% das mps estavam em nexina V sci-fi positiva.

Normalmente, cerca de 2,5 miligramas de LMPs foram obtidos seguindo este protocolo. Explicação do tecido brônquico de C 57 camundongos pretos seis foram submetidos ao tratamento com veículo e DUM. Nesta figura, a análise histopatológica dos cortes brônquicos revela o efeito das DUM na integridade estrutural do epitélio brônquico.

No controle. Explan, o epitélio brônquico estava praticamente intacto. No entanto, em explantes tratados com LMP, a camada de células epiteliais superficiais foi danificada ou perdida, e houve diminuições significativas na altura e densidade das células epiteliais, como visto aqui.

A coloração positiva do túnel, um marcador de apoptose, foi mais pronunciada no epitélio brônquico tratado com DUM em comparação com o tecido controle. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar em condições estéreis ao produzir micropartículas e realizar a cultura de explicação de tecidos.