Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados

O objetivo geral deste procedimento é medir as mudanças nas propriedades da membrana dos neurônios sensoriais olfativos em resposta a estimulantes de odor. Isso é feito dissecando primeiro o epitélio olfatório e transferindo-o para uma câmara perfundida. O segundo passo é localizar e escolher um OSN de interesse ao microscópio.

O botão dendrítico do OSN escolhido é então fixado e analisado enquanto é estimulado com odores. Em última análise, o clampeamento perfurado de botões dendríticos OSN caracteriza as propriedades funcionais do OSN no nível da membrana. Este método pode ajudar a abordar questões-chave nos campos olfativos, como o registro de neurônios olfativos, sensoriais, expressando receptores de arte de odor definidos, e também gravações de patch clamp.

Forneça informações sobre as propriedades da membrana desses neurônios. Prepare as pipetas estimulantes com um milímetro de vidro ou compre-as pré-puxadas com uma chama. Dobre seis pipetas cerca de um centímetro da ponta em um ângulo de 45 graus.

Em seguida, organize as seis pipetas de ponta dobrada em torno de uma sétima pipeta reta, usando um ilhó como guia e envolva-as em um tubo termorretrátil. Aqueça o filme retrátil na outra extremidade das pipetas. Aplique mais filme retrátil.

Isso faz uma pipeta estimulante de sete barris de preparação. Agora, usando um multi barril polar puxar a pipeta estimulante de sete barris. Uma vez puxado, fortaleça o conjunto com um pouco de cola branca ao redor do ilhó.

Em seguida, deixe a cola secar durante a noite com as soluções necessárias. A solução de nistatina deve ser fresca imediatamente antes de ser usada. Quando necessário, pese três miligramas de nistatina e adicione a 50 microlitros de DMSO.

Em seguida, mistura de vórtice por 20 segundos. Em seguida, sonicar a mistura durante dois a três minutos para garantir uma diluição completa. Agora adicione 20 microlitros da mistura a cinco mililitros de solução estoque intracelular.

A mixagem do Vortex por 20 segundos, seguida por dois a três minutos de sonicação. Em seguida, resfrie a solução de trabalho no gelo e mantenha-a protegida da luz preparada. Desta forma, a solução de trabalho é boa por algumas horas.

Carregue uma seringa equipada com microfilme com solução de trabalho. Será bom por uma hora de uso até que seja usado. No entanto, preserve a seringa carregada mantendo-a no gelo.

Agora puxe alguns eletrodos de gravação com pescoços longos e aberturas de dois mícrons. O objetivo é obter uma resistência de 15 a 20 mega ohms uma vez carregado com solução de nistatina. Por fim, carregue a pipeta estimulante com odor diluído em campainha. Solução.

Para este protocolo, tenha camundongos disponíveis entre duas e quatro semanas de idade. Nesta apresentação, camundongos que expressam ou IRES tau GFP são usados usando ou camundongos IS tau GFP. Todos os neurônios que expressam o ou de interesse serão marcados com GFP.

Este método pode ser utilizado ou expresso em todas as zonas. No entanto, dissecções e registros serão mais fáceis para ORs expressos na zona dorsal. Comece anestesiando e decapitando um rato.

O resultado deste protocolo depende da qualidade da dissecção. Essas etapas de dissecção devem ser as mais curtas possíveis e precisas. Para iniciar a cirurgia, use uma tesoura de dissecação para fazer um corte longitudinal ao longo do dorso.

Separe a pele para removê-la. Em seguida, corte ao longo da mandíbula inferior e faça um corte coronal paralelo aos dentes. Assim, remova os dentes incisivos superiores.

Agora faça um corte coronal ao redor da cabeça, atrás dos olhos, descarte a cabeça posterior e transfira a porção anterior para toques gelados. Agora, sob um microscópio de dissecação, isole o septo dentro de cinco a 10 minutos. Comece com um corte longitudinal ao longo do lado ventral.

Em seguida, corte os ossos dorsais longitudinalmente ao longo do lado lateral dorsal da cavidade nasal. Em seguida, remova a maioria dos ossos e do palato. Transfira o septo isolado e conecte o epitélio a um recipiente de anéis oxigenados à temperatura ambiente.

Dentro de cinco minutos, faça os preparativos finais antes de gravar. A solução não deve estar muito quente, ou a preparação parecerá danificada. Para acessar o neuro epitélio para gravação.

Primeiro, retire o epitélio do septo subjacente com uma pinça. Em seguida, usando uma tesoura micro Vanna, corte a extremidade anterior do septo para liberar o epitélio. Agora remova cuidadosamente o órgão nasal do vômer.

Corte-o onde está preso dorsalmente. O epitélio isolado agora pode ser movido para a câmara de registro com o muco voltado para cima. Uma vez no lugar, use uma harpa para achatar o tecido.

Em seguida, transfira a câmara para um microscópio vertical. Visualize o neuro epitélio sob uma objetiva de imersão em água de 40 x enquanto o perfunde continuamente com toques novos à temperatura ambiente. Para começar, procure as células de interesse, que neste caso expressam EGFP, então a luz de 480 nanômetros é usada para procurar células que emitem luz na faixa de 530 a 550 nanômetros.

Os botões dendríticos direcionados e osn, quando revisados em 80 a 160 x sob campo claro, devem ser claramente distinguíveis das células de suporte. Agora carregue o eletrodo com uma solução de estatina S. Retire as bolhas que se formarem e prenda o eletrodo ao suporte.

Agora aplique um pouco de pressão positiva. A resistência esperada está entre 15 e 20 mega ohms. Em seguida, traga o eletrodo para a célula, mantendo a pressão positiva.

Quando a resistência aumentar para cerca de 40 mega ohms, libere a pressão e aplique uma leve pressão negativa. Se uma vedação giga for feita, o potencial da membrana deve ser fixado em cerca de 75 milivolts negativos. Agora que a célula está aberta, prossiga com o experimento.

Aplique estimulação, protocolos e perfunda com tratamentos farmacológicos conforme necessário para testar com um único odorante. Registre de 200 a 500 milissegundos de atividade espontânea. Aplique o odorante por 500 milissegundos e depois meça as respostas por até 10 segundos Usando o protocolo descrito.

MOR 23, expressando neurônios marcados com EGFP, foram corrigidos e estimulados com diferentes concentrações de al. No modo de pinça de corrente, o lyal é um ligante para MOR 23. Alternativamente, as células foram simuladas sob o modo de grampo de tensão.

Nos registros do modo de pinça de tensão, diferentes características foram monitoradas. Para quantificar a resposta realizada classicamente em eletrofisiologia usando resposta de amplitude máxima, a resposta à dose foi plotada usando a equação de hill. Esses resultados fornecem informações sobre as propriedades de codificação de cada OSN, que incluem seu limite de detecção, temporal, dinâmico, faixa dinâmica e nível de saturação.

Uma vez dominada, a parte de dissecção desta técnica pode ser feita dentro de 10 a 15 minutos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como explorar as propriedades funcionais dos neurônios sensoriais olfativos que expressam receptores de odor definidos em camundongos.