Name: Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprenda a técnica de patch-clamp perfurado para analisar neurônios sensoriais olfativos em camundongos intactos. Este método permite caracterizar propriedades de membrana e respostas a odorantes específicos em receptores olfativos definidos.

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Os autores gostariam de agradecer a Peter Mombaerts pelo generoso presente de camundongos OR-GFP; Anne Lefranc e a instalação de animais CSGA para excelentes cuidados com os animais. O financiamento foi fornecido pelo CNRS por meio de bolsas ATIP e ATIP Plus, pelo Conseil Régional de Bourgogne (bolsas FABER e PARI), pela Université de Bourgogne (programa BQR).

Este protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais da Université de Bourgogne e foi aprovado pelo comitê de ética Université de Bourgogne. 1. Os animais <ol><li> Use geneticamente camundongos OR-IRES-tauGFP disponíveis no Laboratório Jackson. Estes murganhos foram desenvolvidos no laboratório Dr. Peter Mombaerts &#39;, a fim de analisar a segmentação do axónio e desenvolvimento do sistema olfactivo 19. Por exemplo, a linha MOR23-IRES-tauGFP, o número de ações 006.643, leva o nome oficial estirpe B6; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; Da mesma forma, a linha SR1-IRES-tauGFP, número de estoque 6717 leva o nome oficial B6; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ. </li><li> Em relação à idade dos animais: para um melhor resultado do protocolo, utilizar animais entre 2 e 4 semanas de idade. Nesta faixa etária, a dissecção é mais fácil (ossos mais macios, mais firme do epitélio olfatório) e os botões dendríticas são bigger comparar com animais mais velhos. </li></ol> 2. Preparação de eletrodos e Soluções <ol><li> Para as pipetas estimulantes: compra prepulled estimulando pipetas. Caso contrário, prepará-los manualmente. <ol><li> Usando uma chama, dobrar um milímetro seis pipetas de vidro em cerca de 1 cm da ponta. Insira estes seis pipetas além de uma linha reta 7 th em 1,5 centímetros de calor encolher tubulação fortalecer por um orifício. </li><li> Calor encolher o tubo para manter os barris ligados juntos. Anexar um tubo de calor psiquiatra adicional para a outra extremidade dos barris. Puxe este pipeta estimulante, com um puxador de multi-barril. </li><li> Adicione um pouco de cola líquida branca à volta do orifício para fortalecer as pontas dobradas. Deixe secar O / N. </li></ol></li><li> Prepare 1 ou 2 L de solução de Ringer extracelular normal (em mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1,3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH 2 PO 4 1,25, glicose 15; pH 7,6 e 305 mOsm). Mantenha a 4 ° Caté à sua utilização. </li><li> Preparar a solução estoque intracelular (em mM): KCl 70, KOH 53, ácido metanossulfónico 30, EGTA 5, HEPES 10, 70 sacarose; pH 7,2 (KOH) e 310 mOsm. Manter a 4 ° C até à sua utilização. Bom para várias semanas. </li><li> Preparar a solução intracelular de gravação com nistatina extemporaneamente (no último minuto) antes de experimento. <ol><li> Pesar 3 mg de nistatina, adicionar 50 ul de DMSO; vortex 20 seg depois sonicar 2-3 minutos até completamente diluída. </li><li> Adicionar 20 ul de solução de DMSO-de nistatina em 5 ml de solução de reserva intracelular. Vortex 20 seg, depois sonicar 3 min. Conservar esta solução a 4 ° C e proteger da luz direta, nistatina é sensível à luz. Esta solução pode ser utilizada por algumas horas. Substituir todos os dias. </li><li> Uma vez que a preparação epitélio olfativo é sob o microscópio, tirar um pouco dessa solução em uma seringa de 1 ml com uma ponta amarela alongado-chama para preencher os eletrodos; proteger da luz direta. Uma vez que, à TA, a solução nistatinanão é estável; substituir a solução na seringa de 1 mL a cada hora ou mantê-lo em gelo. </li></ol></li><li> Puxe eléctrodos de registo com um puxador de obter longo pescoço e uma pequena ponta (~ 2 mm) com uma resistência de 15-20 mohms com a solução de nistatina interno. </li><li> Preparar a solução odorante em 0,5 M em DMSO sob exaustor; aliquota e manter a -20 ° C até à sua utilização. Diluir odorante em solução de Ringer, até à concentração desejada. Encha a pipeta estimulante. </li></ol> 3. Preparação de epitélio olfatório Nota: os ratos OR-IRES-tauGFP expressar o tauGFP sob o controlo do promotor OU. Nesses camundongos, todos os neurônios que expressam o OR de interesse são marcadas com GFP. Este protocolo é adaptado para as RUP expressos em todas as zonas. No entanto, dissecções e gravações são mais fáceis para as RUP expressas na zona dorsal. <ol><li> Anestesiar os animais por injecção de uma mistura de cetamina e xilazina (150 mg / kg e 10 mg / kg BODy de peso, respectivamente). Decapitação pode ser realizada com uma tesoura afiada para ratos jovens ou com uma guilhotina roedor mantido adequadamente para ratos mais velhos. <ol><li> Usando anel tesouras de dissecção fazer uma incisão medial longitudinal através da pele dorsal. Retire a pele, puxando-o para além. Usando a tesoura, corte as mandíbulas inferiores na articulação da mandíbula. Remover os dentes frontais superiores por um corte coronal paralelo aos dentes. </li><li> Faça um corte coronal da cabeça atrás dos olhos e manter apenas a parte anterior da cabeça. Mergulhá-lo em solução de Ringer gelada para a dissecação sob o âmbito de aplicação. </li></ol></li><li> Dissecar no âmbito: no lado ventral, faça um corte longitudinal ao longo do maxilar superior / os dentes. Cortar os ossos dorsais longitudinalmente, seguindo o lado dorso-lateral da cavidade nasal. Remover a maioria dos ossos e paladar; transferir o septo e o epitélio ligado a ele em oxigenado Ringer a RT. </li><li> Para a dissecção final: Logo antes de iniciar a gravaçãosessão, descascar o epitélio do septo subjacente com uma pinça. Retire o epitélio com uma pinça e com dois cortes 4-5 mm de tesoura (uso microvannas tesoura) na parte anterior do septo onde a adesão é mais forte. <ol><li> Retire cuidadosamente o órgão vomeronasal, cortando-a ao longo da sua ligação ao epitélio dorsal do septo. Transferir o epitélio para uma câmara de registo com a camada da mucosa voltada para cima; mantê-lo liso na câmara com uma harpa. </li></ol></li><li> Câmara de instalar sob um microscópio vertical equipado com óptica de fluorescência e uma câmera sensível. Visualize a preparação na tela do computador com alta ampliação de 40X através de um objetivo de imersão em água (abertura numérica 0,8) e uma ampliação de 2X ou 4X adicional conseguido por uma lente de aumento. Perfundir continuamente oxigenado com Ringer a RT (1-2 mL / min). </li></ol> 4. A gravação da sessão <ol><li> Procurar célula fluorescente: excitar a preparação em 480nm para EGFP, que emite luz no intervalo de 530-550 nm; alvo um botão dendrítica que é fiável visível na fluorescência e sob campo claro. </li><li> Preencha eléctrodo com solução intracelular com nistatina; remover as bolhas batendo suavemente sobre o eletrodo. </li><li> Insira eletrodo no suporte do eléctrodo, aplique pressão positiva na pipeta; A resistência deve ser de 15-20 mohms. </li><li> Traga eletrodo perto do celular; uma vez que a resistência atinge ~ 40 mohms, libere pressão positiva e aplicar uma ligeira pressão negativa para chegar a um gigaseal. </li><li> Uma vez que o selo é atingido, definir o potencial de membrana a cerca de -75 mV; </li><li> Uma vez que a célula se abre, prosseguir com protocolos de estimulação, tratamentos farmacológicos. Para medir a resposta a uma única estimulação odorante, 200-500 ms ficha de actividade espontânea, para estimular a 500 ms e medir a resposta da célula para até 10 seg 13. Para tratamentos farmacológicos, perfundir os agentes farmacológicos naa concentração desejada de 20. </li></ol> Análise 5. Dados <ol><li> Analisar as correntes induzidas por estimulação odorante como se segue: a amplitude máxima, o tempo de subida (tempo necessário para atingir 90% da amplitude máxima, em mseg), a corrente total (área sob a curva em Pas), a hora a 50% (tempo entre o início e o deslocamento da resposta a 50% da amplitude máxima, em mseg). <ol><li> Usando as correntes de pico de transdução (amplitude máxima atingida), em diferentes concentrações, desenhar e ajustar uma curva de resposta à dose utilizando a equação de Hill: Imax = I / (1 ​​+ (K 1/2 / C) n), em que I representa a corrente de pico , Imax a resposta máxima nas concentrações saturantes, K1 / 2 a concentração para a qual metade da resposta máxima foi alcançada, C a concentração do odorante e n o coeficiente de Hill. </li></ol></li><li> Analisar gravações de potencial de membrana em pinça de corrente para a despolarização máxima, o total potencial provocada (área sob a curva em mVsec); registro de atividade spiking espontânea longo de 30 s para um mínimo de gravações; excitabilidade registro através picos gerado pela injeção de correntes (10/05 PA). </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesse financeiro conflitante.

A capacidade deste protocolo para monitorar corretamente as propriedades de ORS saudáveis ​​depende muito da qualidade da preparação. Por conseguinte, os passos de dissecação são críticos. Em primeiro lugar, é fundamental prestar atenção à qualidade (pH, osmolaridade), oxigenação e temperatura (gelo-frio, mas não congelado) do meio de dissecção. Em segundo lugar, a manipulação do epitélio com ferramentas de dissecação deve ser tão limitada quanto possível, para evitar danos. Finalmente, é essencial para se obter uma pre...

Neurônios olfatórios (OSN) representam o primeiro passo de percepção olfativa. Localizado no epitélio olfativo que reveste a cavidade nasal nos roedores, eles transformam a informação química dos odores em potenciais de ação enviadas através do seu axônio para o cérebro. Para compreender melhor os mecanismos de codificação olfativas, é necessário caracterizar as propriedades de transdução de membrana e de ORS. Até recentemente, a maioria das técnicas usadas para caracterizar as propriedades de ORS de mamífero foram realizadas em dissociado ORS 1-4. O processo de dissociação usa vários (ou seja, enzimas) processos mecânicos e químicos para libertar os ORS de seu ambiente. Estes processos induzem um baixo número de células disponíveis para as gravações. Este número baixo pode ser ainda mais crítica no caso de células GFP rotulados. Dissociação também remove as interações locais célula-a-célula entre ORS e outras células do epitélio olfactivo, que pode melhorar survival e modulação das propriedades &quot;ORS. A fim de evitar o procedimento de dissociação, uma preparação intacta foi desenvolvido 5. Cada OSN expressa um receptor olfativo (OR) seleccionados a partir de uma grande família multigene 6. Há ~ 1000 RUP expressos no epitélio olfatório principal no mouse. Devido ao grande número de, ou em animais de tipo selvagem, as possibilidades para gravar ORS que expressam o mesmo ou são muito baixos. Para superar estas limitações, os ratinhos alvo do gene estão disponíveis em todas as ORS que expressam um identificado ou estão marcados com uma proteína fluorescente 7-9. Estes ORS marcadas foram usadas para fazer análise funcional em preparações dissociadas 7,10,11 com os inconvenientes mencionados anteriormente. Uma preparação epitélio intacto 5 de camundongos geneticamente marcadas, portanto, contorna essas questões. Ele permite o monitoramento da atividade de ORS expressam RUP definidos com precisão em um ambiente tão perto no vivo possível. Além disso, gravações de patch-clamp de ORS também permitir uma análise precisa das propriedades da membrana, via de transdução de farmacologia, ligando / ou interações. Todos estes tópicos dificilmente podem ser analisadas usando gravações extracelular. Nós usamos essa técnica para monitorar as respostas dos ORS que expressam os receptores olfativos SR1 e MOR23 12,13. A viabilidade da técnica foi confirmada por outros grupos em MOR23 expressam ORS 14, bem como em outras RUP neurónios que expressam 15,16. O controlo de uma população definida de ORS pode levar à análise das suas propriedades em muitos contextos diferentes, tais como o desenvolvimento 14, 17 envelhecimento, odorante induzida plasticidade 18, e o papel de variações na sequência do receptor olfactivo, em odor de codificação 15. Este protocolo proporciona assim uma ferramenta poderosa para monitorizar as propriedades funcionais de ORS definidas ao nível da membrana.

<table><tbody><tr><td>mesa vibratória com gaiola de Faraday</td><td>TMC</td><td>63-500 SERIES</td><td>necessária: isola o sistema de gravação das vibrações induzidas pelo ambiente (movimentos do experimentador, vibrações de equipamentos como ventiladores para resfriamento de computadores, etc); também pode ser adquirido com uma gaiola de Faraday, ou equipado com uma gaiola de Faraday feita sob medida; esta gaiola é recomendada para evitar ruídos elétricos da</td></tr><tr><td>ótica</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>do ambientemicroscópio</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>microcope vertical equipado com epifluorescência; platina fixa ou móvel, dependendo da preferência do usuário</td></tr><tr><td>objetivos</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFL40XW</td><td>pelo menos 2 objetivos necessários: um 4X ou 10X para abordagem grosseira da célula; e um exemplo de imersão de 40X a longa distância Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3,3 MM</td></tr><tr><td>lupa</td><td>Olympus</td><td>U-TVCAC</td><td>ABSOLUTAMENTE NECESSÁRIO: colocado no caminho da luz entre a objetiva e a câmera; permite ampliar a imagem na tela, a fim de alcançar precisamente o botão com a câmera de eletrodo de gravação</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td>uma boa câmera é necessária para ver os neurônios em fluorescência, bem como em campo claro; o software de controle é simples e permite tirar fotos e fazer imagens da câmera ao vivo para monitorar a aproximação do eletrodo à célula. Uma câmera ultrassensível não é necessária</td></tr><tr><td>para filtrar</td><td>Olympus/Chroma</td><td></td><td>dependendo da proteína fluorescente usada nos camundongos; exemplo para GFP: excitação: BP460-490: emissão: amplificador HQ530/50m</td></tr><tr><td></td><td>HEKA</td><td>EPC10 USB</td><td>monitora as correntes que fluem através do eletrodo de gravação e também controla o sopro enviando um sinal TTL para o spritzer; a configuração do EPC10 é controlada por</td></tr><tr><td>software</td> <td>de computadorHEKA</td><td>Patchmaster</td><td>controla o amplificador durante o experimento</td></tr><tr><td>micromanipulador</td><td>Sutter</td><td>MP225</td><td>micromanipulador de precisão, permite movimentos precisos até 1/10 de um micrômetro; este modelo é muito estável; evite manipuladores hidráulicos que podem derivar</td></tr><tr><td>extrator de eletrodo</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>com um filamento de calha largo FT345-B; &nbsp; preparar pipetas de gravação de cerca de 2 e micro; m de diâmetro com ponta longa para alcançar as células; a resistência deve ser de 15 a 20Mohm com vidro de solução de braçadeira de remendo perfurado</td></tr><tr><td></td><td>Sutter</td><td>BF120-69-10</td><td>em nossas condições de gravação, este vidro é ideal para gravar pipetas</td></tr><tr><td>câmara de gravação</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td>uma câmara é necessária para definir a preparação sob o microscópio. Para manter a preparação no centro da câmara, deve-se usar uma rede/âncora</td></tr>.<tr><td></td><td></td><td></td>vidro <td>de estimulação</td></tr><tr><td></td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>anexado em grupos de 7, estas pipetas são usadas para preparar pipetas estimulantes pré-puxadas</td></tr><tr><td>extrator multibarril</td><td>MDI</td><td>PMP-107-Z</td><td>por associação de puxar e torcer, este extrator nos permite preparar eletrodos de sopro com</td></tr><tr><td>injetor de pressão de precisão de 7 barris&nbsp;</td><td>Toohey Company</td><td>P/N T25-1-900 Canal Único&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>este injetor de pressão de precisão controla a pressão ejetada no extrator multibarril; é controlado manualmente ou pelo amplificador por um 5V&nbsp; O</td></tr><tr><td>micromanipulador</td> TTLs <td>Narishige</td><td>YOU-1</td><td>um manipulador grosseiro é suficiente para aproximar o eletrodo de sopro das tubulações do local de gravação</td></tr><tr><td></td><td>Tubulação tygon N/A</td><td></td><td>para trazer a pressão do soprador para a pipeta de sopro</td></tr><tr><td>soluções/perfusão/produtos químicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bomba de vácuo</td><td>gardner denver</td><td>série</td> <td>300uma bomba de membrana vibratória é mais silenciosa e eficiente do que outros tipos de bombas</td></tr><tr><td>sistema de perfusão</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>sistema de perfusão por gravidade com tubulação de polietileno para trazer para dentro e para fora a solução externa da câmara de registro</td></tr><tr><td>nistatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3503</td><td>obrigatória para perpare solução interna para patch clamp perfurado</td></tr><tr><td>DIMETIL SULFÓXIDO Sigma-Aldrich</td><td></td><td>D5879</td><td>usado para dissolver a nistatina para solução interna para adesivo perfurado;</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>solução extracelular</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td>solução intracelular/extracelular</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>solução extracelular</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico mono-hidratado (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>solução extracelular</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td>solução extracelular</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>solução extracelular</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>solução</td></tr> <tr><td>extracelularEGTA (Etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N&prime;,N&prime;-ácido tetracético)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>solução interna</td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>solução interna</td></tr><tr><td>Metilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387509</td><td>solução intracelular</td></tr><tr><td>Hepes-Na</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td>solução intracelular</td></tr><tr>Solução <td>intracelular</td> de <td>sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td></tr></tbody></table>

perfurado gravação patch-clamp de rato olfactory neurônios sensoriais na intact neuroepitélio: análise funcional do neurônios expressando uma odorant receptor identificados

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analisando as respostas fisiológicas de neurônios olfatórios (OSN) quando estimulados com ligantes específicos é fundamental para compreender a base dos comportamentos olfativos-driven e sua modulação. Estas propriedades de codificação dependem muito da interação inicial entre as moléculas de odor e do receptor olfativo (OR) expressa nas ORS. A identidade, especificidade e ligando espectro da expressa ou são críticos. A probabilidade de encontrar o ligando do ou expresso em um OSN escolhido aleatoriamente dentro do epitélio é muito baixo. Para responder a este desafio, este protocolo utiliza ratinhos geneticamente marcadas que expressam a proteína fluorescente GFP sob o controlo do promotor de RUP definidos. ORS estão localizadas no epitélio apertado e organizada que reveste a cavidade nasal, com as células vizinhas influenciar a sua maturação e função. Aqui nós descrevemos um método para isolar um epitélio olfativo intacta e gravar através de gravações de patch-clamp as propriedades de ORS expressing receptores olfativos definidos. O protocolo permite que um para caracterizar as propriedades de membrana OSN, mantendo a influência do tecido vizinho. A análise dos resultados de patch-clamp produz uma quantificação precisa de ligando / ou interações, vias de transdução e farmacologia, propriedades de codificação &#39;ORS e sua modulação em nível da membrana.

O resultado deste protocolo depende da qualidade da dissecção. A dissecção passos deve ser curto (menos do que 10 a 15 min) e preciso (isto é, para evitar danos do epitélio). A figura 1 ilustra como uma preparação ideal parece em diferentes níveis de ampliação. Numa ampliação baixa sob condições de campo brilhante os diferentes tipos de células (tais como botões de células ORS, apoiando) são distinguíveis (Figura 1A). Ao mais alto nível de ampliação, normalmente 80X a 160X, em ...

A análise das propriedades fisiológicas dos neurônios sensoriais olfativos ainda enfrenta limitações técnicas. Aqui, nós os registramos por meio de patch-clamp perfurado em uma preparação intacta do epitélio olfatório em camundongos direcionados ao gene. Esta técnica permite a caracterização das propriedades da membrana e respostas a ligantes específicos de neurônios que expressam receptores olfativos definidos.

Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

O objetivo geral deste procedimento é medir alterações nas propriedades da membrana de neurônios sensoriais olfativos em resposta a estímulos odoríferos. Isso é realizado primeiramente dissecando o epitélio olfativo e transferindo-o para uma câmara perfundida. O segundo passo consiste em localizar e selecionar um OSN de interesse sob o microscópio.O botão dendrítico do OSN escolhido é então submetido à técnica de patch clamp e analisado enquanto é estimulado com odorantes. Em última análise, o patch clamp perfurado dos botões dendríticos de OSNs caracteriza as propriedades funcionais dos OSNs ao nível da membrana. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da olfação, como a gravação de neurônios sensoriais olfativos, expressando receptores definidos para odorantes, e também gravações por patch clamp.Forneça informações sobre as propriedades da membrana desses neurônios. Prepare os eletrodos estimuladores a partir de vidro de um milímetro ou adquira-os pré-puxados utilizando uma chama. Dobre seis pipetas a cerca de um centímetro da ponta em um ângulo de 45 graus.Em seguida, organize as seis pipetas com ponta curvada ao redor de uma sétima pipeta reta, usando um olhal como guia, e envolva-as com tubo termorretrátil. Aplique calor ao revestimento termorretrátil na outra extremidade das pipetas. Adicione mais revestimento termorretrátil.Isso produz uma pipeta estimuladora prepolar de sete barris. Agora, utilizando uma puxada multibarril polar, puxe a pipeta estimuladora de sete barros. Após a puxada, reforce a montagem com um pouco de cola branca ao redor do olhal.Em seguida, deixe a cola secar durante a noite com as soluções necessárias. A solução de Nistatina deve ser preparada recentemente logo antes de ser utilizada. Quando necessário, pese três miligramas de Nistatina e adicione a 50 microlitros de DMSO.Em seguida, vórtex a mistura por 20 segundos. Depois, sonique a mistura por dois a três minutos para garantir uma diluição completa. Agora, adicione 20 microlitros da mistura a cinco mililitros da solução estoque intracelular.Vortexe a mistura por 20 segundos, seguido de dois a três minutos de sonicação. Em seguida, resfrie a solução de trabalho em gelo e mantenha-a protegida da luz durante o preparo. Dessa forma, a solução de trabalho é estável por algumas horas.Carregue uma seringa equipada com microfilme com a solução de trabalho. Ela permanecerá adequada para uso por uma hora após o carregamento. No entanto, preserve a seringa carregada mantendo-a em gelo.Agora, prepare alguns eletrodos de gravação com pescoços longos e aberturas de dois mícrons. O objetivo é obter uma resistência de 15 a 20 megaohms após o preenchimento com solução de nistatina. Por fim, carregue a pipeta estimuladora com odorante diluído em solução de Ringer.Para este protocolo, tenha camundongos disponíveis com idade entre duas e quatro semanas. Nesta apresentação, são utilizados camundongos que expressam ou IRES tau GFP, empregando camundongos or IS tau GFP. Todos os neurônios que expressam o or de interesse serão marcados com GFP.Este método pode ser usado para ou expresso em todas as zonas. No entanto, as dissecações e gravações serão mais fáceis para ORs expressos na zona dorsal. Comece anestesiando e, em seguida, decapitando um camundongo.O resultado deste protocolo depende da qualidade da dissecação. Esses passos de dissecação devem ser os mais curtos possíveis e precisos. Para iniciar a cirurgia, use uma tesoura de dissecação para fazer um corte longitudinal ao longo do dorso.Puxe a pele para separá-la e removê-la. Em seguida, corte ao longo da mandíbula inferior e faça um corte coronal paralelo aos dentes. Dessa forma, remova os dentes incisivos superiores.Agora, faça um corte coronal ao redor da cabeça, atrás dos olhos, descarte a porção posterior da cabeça e transfira a parte anterior para ringer gelado. Em seguida, sob um microscópio de dissecação, isole o septo em cinco a dez minutos. Comece com um corte longitudinal ao longo do lado ventral.Em seguida, corte os ossos dorsais longitudinalmente ao longo do lado dorsal lateral da cavidade nasal. Depois, remova a maior parte dos ossos e o palato. Transfira o septo isolado com o epitélio aderido para um recipiente contendo solução de Ringer oxigenada à temperatura ambiente.Em até cinco minutos, faça os preparativos finais antes da gravação. A solução não deve estar muito quente, ou o preparo parecerá danificado. Para acessar o epitélio neuroepitelial para gravação.Primeiro, remova o epitélio do septo subjacente com pinça. Em seguida, usando tesoura microcirúrgica do tipo Vanna, corte a extremidade anterior do septo para soltar o epitélio. Agora, remova cuidadosamente o órgão nasal do vômer.Corte na região onde está fixado dorsalmente. O epitélio isolado pode agora ser transferido para a câmara de registro com o lado do muco voltado para cima. Uma vez posicionado, use um arpa para aplainar o tecido.Em seguida, transfira a câmara para um microscópio ereto. Visualize o epitélio neural com uma objetiva de imersão em água de 40 x, perfundindo-o continuamente com solução de Ringer fresca à temperatura ambiente. Para iniciar a busca pelas células de interesse, que neste caso expressam EGFP, utilize luz de 480 nanômetros para escanear células que emitem luz na faixa de 530 a 550 nanômetros.Os botões dendríticos e os osn direcionados, quando examinados com aumento de 80 a 160 x em campo claro, devem ser claramente distinguíveis das células de suporte. Agora, carregue o eletrodo com uma solução de S statin. Remova quaisquer bolhas que se formem e fixe o eletrodo ao suporte.Agora aplique alguma pressão positiva. A resistência esperada está entre 15 e 20 mega ohms. Em seguida, aproxime o eletrodo da célula mantendo a pressão positiva.Quando a resistência aumentar para cerca de 40 megaohms, libere a pressão e aplique uma leve pressão negativa. Se um selo giga for formado, o potencial da membrana deve ser fixado em aproximadamente menos 75 milivolts. Agora que a célula está aberta, prossiga com o experimento.Aplicar estímulos, protocolos e perfundir com tratamentos farmacológicos conforme necessário para testar com um único odorizante. Registrar de 200 a 500 milissegundos de atividade espontânea. Aplicar o odorizante por 500 milissegundos e então medir as respostas por até 10 segundos utilizando o protocolo descrito.Neurônios que expressam MOR 23, marcados com EGFP, foram submetidos à técnica de patch e estimulados com diferentes concentrações de al. No modo de fixação de corrente, lyal é um ligante para MOR 23. Alternativamente, as células foram simuladas no modo de fixação de voltagem.Em gravações no modo de fixação de voltagem, diferentes características foram monitoradas. Para quantificar a resposta, conforme realizado classicamente na eletrofisiologia utilizando a amplitude máxima da resposta, a curva dose-resposta foi traçada usando a equação de Hill. Esses resultados fornecem informações sobre as propriedades de codificação de cada OSN, incluindo seu limiar de detecção, características temporais, faixa dinâmica e nível de saturação.Uma vez dominada, a parte da dissecação desta técnica pode ser realizada em 10 a 15 minutos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como explorar as propriedades funcionais de neurônios sensoriais olfativos que expressam receptores de odorantes definidos em camundongos.

perforated-patch-clamp-recording-mouse-olfactory-sensory-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O electroolfactogram gravação (EOG) é uma maneira informativa de fácil condução e confiável de avaliação da função olfativa ao nível do epitélio olfativo. Este protocolo descreve uma configuração de gravação, de preparação dos tecidos mouse, coleta de dados e análise de dados básicos.

Respostas análise de rato Olfactory neurônios sensoriais Usando a gravação Electroolfactogram Air fase

Neurônios receptores olfativos (ORNs) converter sinais de odor primeiro em um receptor de corrente que por sua vez desencadeia potenciais de ação que são transmitidos para os neurônios de segunda ordem no bulbo olfativo. Aqui, descrevemos a técnica da pipeta de sucção para gravar simultaneamente o receptor de odorante induzida atual e os potenciais de ação de ORNs mouse.

Odorante induzidas respostas registradas a partir de neurônios receptores olfativos utilizando a técnica de sucção da pipeta

Este vídeo demonstra o registro eletrofisiológico de neurônios sensoriais olfativos (OSNs) em camundongos usando uma técnica de patch-clamp perfurada. O epitélio olfatório, contendo OSNs com receptores de odor marcados com fluoróforo, é isolado de um camundongo e preso em uma câmara de registro. Uma pipeta de registro é presa ao botão dendrítico de um OSN, e a nistatina dentro da pipeta perfura a membrana para formar conectividade elétrica com a célula. Finalmente, outra pipeta é usada para...

Registro perfurado de neurônios sensoriais olfativos em camundongos

O vídeo do protocolo descreve o estabelecimento de um grampo de adesivo de célula inteira para registro eletrofisiológico dos neurônios sensoriais do órgão vomeronasal (VNO) em camundongos. Uma fatia coronal de VNO com neurônios sensoriais marcados com fluorescência é colocada em uma configuração de gravação. Um neurônio marcado é temendado com uma pipeta de registro em uma configuração de célula inteira para registro eletrofisiológico em resposta a estímulos químicos.

Estabelecendo um grampo de remendo de célula inteira para registro eletrofisiológico de neurônios sensoriais vomeronasalis

Nós demonstramos as variações da técnica de gravação extracelular de multi-unidade para caracterizar odor evocadas respostas nas três primeiras etapas da via olfactiva invertebrado. Estas técnicas podem ser facilmente adaptados para examinar a actividade conjunto de outros sistemas neurais também.

Multi-unidade Métodos de gravação para caracterizar a atividade neural no Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuitos olfatórias

Um método eficaz para Desossa manual Prepare Intacto Rato tecido nasal com organização anatômica preservada

Os cílios dos neurônios sensoriais olfatórios contêm proteínas da cascata de transdução de sinal, mas uma análise espacial detalhada de sua distribuição é difícil em criossecções. Descrevemos aqui uma abordagem otimizada para marcação de montagem inteira e visualização em face de proteínas ciliares.

Monte todo Rotulagem de Cilia na Olfativo Sistema de Ratos Principal

Aqui, descrevemos uma abordagem fisiológica que permite a identificação e análise aprofundada de uma população definida de neurônios sensoriais em fatias agudas de tecido coronal do órgão vomeronasal de camundongo usando gravações de patch-clamp de células inteiras.

Análise em profundidade Physiological de populações de células definido no aguda Tissue Fatias do mouse Vomeronasal Organ

Caracterizando a função dos receptores de odorante serve uma parte indispensável do processo de deorphanization. Nós descrevemos um método para medir a ativação dos receptores odorant em tempo real, usando um ensaio de campo.

Viver-pilha medição de odorante Receptor de ativação usando um ensaio de campo em tempo real

Os neurônios sensoriais olfatórios expressam uma grande variedade de moléculas de classificação axônica para estabelecer circuitos neurais adequados. Este protocolo descreve um método de coloração imuno-histoquímica para visualizar expressões combinatórias de moléculas de ordenação axônica no terminal axônico de neurônios sensoriais olfativos.

Imunossinção Quadruple da Lâmpada Olfativa para Visualização de Códigos de Identidade Molecular de Axon Sensorial Olfativo

Aprenda a técnica de patch-clamp perfurado para analisar neurônios sensoriais olfativos em camundongos intactos. Este método permite caracterizar propriedades de membrana e respostas a odorantes específicos em receptores olfativos definidos.

Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados (Vídeo) | JoVE Journal

Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados

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