Aplicando a técnica de injecção estereotáxica para estudar os efeitos genéticos sobre os comportamentos animais

O objetivo geral deste procedimento é avaliar como a modulação da expressão de um gene em uma área-alvo afeta o comportamento animal. Isso é feito criando primeiro um lentivírus para modular a expressão do gene alvo. O segundo passo é usar injeção estereotáxica para injetar o lentivírus em uma área específica do cérebro do roedor ER.

Em seguida, comportamentos como ansiedade e depressão podem ser medidos quantitativamente usando paradigmas comportamentais estabelecidos. A etapa final é realizar histologia para confirmar o local correto da injeção. Em última análise, a injeção estereotáxica combinada com a avaliação comportamental pode mostrar como um gene específico em uma área-alvo pode afetar o comportamento do camundongo.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que os cientistas podem alterar a expressão de um único gene em uma pequena área-alvo e, em seguida, avaliar as mudanças comportamentais em camundongos. Para iniciar este procedimento, coloque um camundongo anestesiado no aparelho estereotáxico, prenda os dentes da frente na pinça anterior e prenda a mandíbula. Em seguida, insira as barras auriculares nos canais auditivos para estabilizar totalmente a cabeça.

Em seguida, coloque uma almofada de aquecimento sob o mouse para regular a temperatura do corpo. Durante todo o procedimento, coloque lágrimas artificiais nos olhos do roedor para evitar o ressecamento. Depois disso, limpe bem a área cirúrgica esfregando primeiro o iodo de povidona a 10% com um cotonete em movimentos circulares.

Em seguida, esfregue álcool etílico a 70% no local da cirurgia da mesma maneira. Repita este procedimento de limpeza mais duas vezes. Depois que o mouse estiver preparado, abra a bolsa de equipamento estéril.

Troque as luvas antes de tocar nos instrumentos. Em seguida, retire o pano estéril e coloque os instrumentos sobre o pano. Agora segure suavemente a pele do camundongo com a pinça de extremidade do sangue e faça a incisão usando um bisturi.

Comece a incisão cerca de 1,5 centímetros acima das orelhas e estenda até cerca de 0,5 centímetros abaixo das orelhas para expor o bgma. Assim que o bgma for visualizado, use uma ponta de algodão estéril para remover suavemente qualquer sangue que cubra a superfície do crânio. Em seguida, use duas pontas de algodão para empurrar a pele em direção aos lados da cabeça.

Em seguida, na hotte, encha uma seringa com o vírus a ser injetado. Certifique-se de que não há bolhas presas no interior. Em seguida, coloque uma seringa no aparelho estereotáxico, certificando-se de que esteja totalmente presa.

Depois disso, abaixe lentamente a seringa até que esteja logo acima da superfície do crânio. Em seguida, mova a ponta da agulha da seringa estéril para a interseção de B bgma e a linha interrural. Defina este ponto como zero.

Em seguida, defina as coordenadas da área de interesse. Mova a agulha da seringa para o local alvo a ser perfurado. Em seguida, coloque a broca logo acima do local alvo em um ângulo de 45 graus em relação ao crânio e comece a perfurar.

Tenha cuidado para não perfurar o cérebro para evitar danos corticais. Depois disso, limpe o sangue do orifício com uma ponta de algodão estéril. Abaixe a seringa para que a ponta fique bem na superfície do cérebro.

Defina a coordenada DV para zero e, em seguida, baixe a seringa até à profundidade desejada. Agora inicie a injeção a uma taxa de 0,2 microlitros por minuto. Após a injecção terminar, aguarde cerca de dois minutos para garantir que qualquer vírus residual foi absorvido.

Em seguida, levante lentamente uma seringa. Use uma ponta de algodão para limpar qualquer fluido do local da injeção. Em seguida, suture a pele e retire o animal do sistema estereotáxico.

Mantenha o mouse na almofada de aquecimento até que ele acorde e administre analgésico adicional quando necessário. Neste procedimento, obtenha uma arena quadrada de plástico. Limpe a arena com álcool etílico 70% antes do experimento.

Em seguida, coloque a arena no chão e certifique-se de que a iluminação esteja ajustada para minimizar sombras e brilho. Em seguida, ajuste as configurações de detecção para que o mouse fique visível na tela. Depois disso, ligue a câmera para gravar a tarefa comportamental e coloque o mouse em direção ao meio da frente da arena para que o mouse fique voltado para a parede.

Defina o cronômetro para cinco minutos e afaste-se da arena ou saia da sala. Após cinco minutos, transfira o mouse de volta para a gaiola. Use álcool etílico 70% para limpar completamente o campo antes de prosseguir para o próximo animal.

Agora encha um balde transparente de dois litros com água a 22 graus. Coloque o balde no chão e certifique-se de que a iluminação esteja ajustada para minimizar as sombras e o brilho. Se estiver usando um software de rastreamento, posicione a câmera diretamente acima do balde.

Ajuste as configurações do software para que o mouse fique facilmente visível na tela. Em seguida, ligue a câmera para gravar a tarefa comportamental. Coloque suavemente o mouse no meio do balde de água para que seus pés dianteiros.

Toque na água primeiro e evite que sua cabeça submerja. Depois, ajuste o cronômetro para seis minutos antes de se afastar da área comportamental. Após seis minutos, retire o mouse do balde, limpe o excesso de água antes de colocá-lo de volta na gaiola.

Aqui está uma fatia de cérebro representativa, que ilustra a injeção bem-sucedida de vírus no giro denteado. Esta figura mostra a quantidade de tempo que os camundongos de controle e experimentais passaram no centro de um novo campo aberto. Os camundongos experimentais passaram significativamente menos tempo no centro da arena, indicando um fenótipo de ansiedade, e esse número mostra a quantidade de tempo que os camundongos controle e experimental ficam imóveis no teste de nado forçado.

Os camundongos experimentais não foram significativamente diferentes dos controles na quantidade de tempo gasto imóvel. Depois de assistir a este vídeo, os espectadores devem ter uma boa ideia de como usar injeções estereotáxicas para avaliar o comportamento dos roedores.