Utilizando a estratégia Capsid-Incorporação Antigen para o desenvolvimento de abordagens adenovírus subtipo 5-Vectored de vacinas

O objetivo geral deste procedimento é utilizar a estratégia de incorporação de tampas de antígeno para o desenvolvimento de abordagens de vacina vetorizada de adenovírus sorotipo cinco usando um vetor adenoviral divalente recombinante como prova de princípio usando a estratégia de incorporação do capsídeo do antígeno, várias etapas de clonagem são usadas para construir o plasmídeo modificado, AD cinco R um K-W-S-H-V-R cinco chiados. Em seguida, o vetor viral adenil divalente. R um K era HVR cinco.

Hiss é resgatado, propagado e purificado. Em seguida, os títulos virais e a exibição antigênica de antígenos incorporados no capsídeo viral são caracterizados. Finalmente, o potencial do vetor viral Divalent Aden para contornar a neutralização por um soro D cinco positivo é avaliado usando a estratégia de incorporação do capsídeo do antígeno.

Várias etapas de clonagem são usadas para construir o plasmídeo modificado, AD cinco R um K-W-A-S-H-V-R cinco chiados. Hoje estaremos demonstrando a estratégia de incorporação do capsídeo do antígeno. Essa estratégia é benéfica em comparação com outras estratégias, como o método de expressão transgênica, porque não apenas exibe o antígeno de interesse no adenovírus cativo como uma proteína, mas permite uma resposta humoral robusta contra esse antígeno.

A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas relativas à geração do adenovírus modificador da tampa são difíceis de aprender, pois muitas variáveis contribuem para o desenvolvimento dos vetores virais recomendados, como a seleção das enzimas de restrição, a lente da energia de interesse em outros Demonstrando os procedimentos. Hoje serão meus dois pós-doutorados, Dr. Lin Lin Gu e Dra. Nitra Farrow. Também Alexandre Kren, o pesquisador associado do laboratório Para construir o plasmídeo do ônibus espacial, adicione seis unidades de um GE e um CCC de um a seis microgramas do fragmento HVR um KWA.

Incube a reação de digestão a 37 graus Celsius por três horas. Resolva o fragmento digestivo em um gel 2%agros por eletroforese e use um kit de extração de gel de DNA de acordo com o protocolo do fabricante para purificar o fragmento. Em seguida, lige 12 nanogramas do fragmento purificado nos locais a G one e ACC one dos 100 nanogramas do plasmídeo de transporte previamente construído.

HVR cinco chiados seis pH cinco s e um volume de reação de 10 microlitros à temperatura ambiente por duas horas. Em seguida, adicione um microlitro da reação de ligação a 50 microlitros de células alfa eletrocompetentes DH cinco, um eletro oito antes de adicionar 950 microlitros de meio SOC. Incube as células transformadas a 37 graus Celsius e 200 RPM por uma hora antes de espalhar 100 a 200 microlitros da cultura em uma placa LB CANY.

Incube durante a noite a 37 graus Celsius. Use seis unidades de Echo R um e PME um para digerir seis microgramas do plasmídeo purificado a 37 graus Celsius por três horas. Depois de purificar o fragmento contendo braços de recombinação homóloga e o gene do éxon cinco modificado duplo, use SUA um para linearizar o plasmídeo de espinha dorsal, PAD cinco, delta H cinco para realizar a recombinação homóloga.

Use eletroporação para cotransformar 100 nanogramas de cada fragmento purificado do ônibus espacial e do plasmídeo de backbone em 50 microlitros de células BJ 5 180 3 eletrocompetentes. Conforme demonstrado anteriormente neste vídeo no dia seguinte, escolha aproximadamente 10 colônias em três mililitros de LB líquido contendo lata de micina e cresça durante a noite antes da triagem de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, transforme 100 nanogramas de plasmídeo purificado em células DH cinco alfa, conforme demonstrado anteriormente para resgatar o vetor viral adicionado.

Comece usando o PAC um para linearizar 15 microlitros do vetor em um volume de 100 microlitros. Incubar a 37 graus Celsius por três horas após a digestão. Extrair o plasmídeo linearizado sob uma hotte.

Adicionar um volume igual de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico à centrifugadora de reacção a 10 000 g durante um minuto e recolher o sobrenadante antes de repetir a extracção e centrifugar até ao volume extraído. Adicione 300 microlitros de etanol 100% e 10 microlitros de acetato centrifugação a 10.000 G por 10 minutos. Em seguida, depois de descartar o sobrenadante, adicione 700 microlitros de etanol a 70% antes de girar novamente.

Uma vez que o pellet tenha sido ressuspenso e o DNA tenha sido quantificado, transfecte três microgramas do plasmídeo linearizado junto com o reagente de transfecção lipossomal comercial em um frasco T 25 previamente preparado de 80% de células HEK 2 93 confluentes de acordo com as instruções do fabricante. Após seis horas de incubação, substituir o meio de transfecção por meio completo antes de devolver o frasco à incubadora. Quando as placas desenvolverem um efeito citopático completo ou CPE sob uma capa estéril, raspar as células restantes do frasco e centrifugar a cultura a 300 G e quatro graus Celsius por 10 minutos.

Em seguida, use um mililitro de meio contendo 2% de FBS para ressuspender o pellet celular. Em seguida, quebre as células realizando quatro rodadas de descongelamento por congelamento e, em seguida, centrifugue o lisado a quatro graus Celsius por 10 minutos. Colete o sobrenadante S contendo o vírus resgatado para propagar o vetor viral em uma cultura em larga escala.

Um terço de todo o lisado viral do frasco T 25 para um frasco T 75 contendo células HEK 2 93. Depois de permitir que o CPE completo se desenvolva e colher o supinato como demonstrado anteriormente, propague metade de todo o vírus em um ou mais. Os frascos T 1 75 de células HK 2 93 propagam então o vírus isolado dos frascos T 1 75 em uma dúzia ou mais.

T 1 75 frascos de células após a preparação de um vírgula 33 gramas por mililitro e 1,45 gramas por mililitro. As soluções de cloreto de césio adicionam quatro mililitros, 1,33 gramas por mililitro, cloreto de césio a um tubo de ultracentrífuga e adicionam quatro mililitros, 1,45 gramas por mililitro, cloreto de césio contra o fundo do mesmo tubo. Adicione quatro mililitros de lisado viral supinato no topo do mesmo tubo e, em seguida, centrifugue o tubo a 110.000 G e quatro graus Celsius por três horas.

Isso separará a banda de vírus inferior madura da banda de vírus superior defeituosa sob o capô. Use uma agulha de calibre 33 presa a uma seringa de três mililitros para coletar a faixa inferior. Em seguida, use cinco hippies para levar a solução até quatro mililitros.

Em seguida, depois de preparar mais dois gradientes de cloreto de césio, carregue o vírus diluído por cima e centrifugue os gradientes a 110.000 G e quatro graus Celsius durante a noite. Sob o capô. Colete a banda viral como acabamos de demonstrar.

Em seguida, use uma agulha de calibre 33 e uma seringa de três mililitros para injetar a solução do vírus em um de diálise. Colocou um em 700 mililitros de um x tampão de diálise preparado de acordo com o protocolo de texto, substituindo o tampão quatro vezes a cada três horas. Em seguida, usando uma agulha e seringa.

Colete a solução viral do para determinar o título físico viral. Use o tampão de lise do vírus para diluir o vírus e o tampão de diálise usado como controle de fundo de um a 10 e de um a 20 e incube todos os tubos a 56 graus Celsius por 10 minutos. Ligue um biofotômetro e defina o modo de absorbância para uma densidade óptica de 260 nanômetros.

Use o tampão de diálise diluído de um a 10 para equilibrar o sinal de fundo clicando no botão em branco. Digite 10 mais 90 na tela do biofotômetro. Substitua o tubo por um tubo de vírus diluído para um a 10 e leia o sinal do vírus diluído para um para 10.

Para medir a diluição de um a 20, use o tampão de diálise diluído de um a 20 para equilibrar o fundo digitando cinco mais 95 na tela antes de substituir o tubo tampão por um tubo de vírus diluído de um a 20 e ler o sinal. Multiplique os dois números de leitura de vírus por 1,1 vezes 10 elevado a 12 e calcule o título médio com unidades de VP por mililitro com base nos dois títulos individuais dos dois diluidores. Avalie o vírus em camundongos de acordo com o protocolo de texto para demonstrar se o vírus resgatado exibe o antígeno antigênico do HIV e a marca hist na superfície do capsídeo viral.

Proteína principal Heon cinco. Eliza foi realizado com o anticorpo monoclonal humano dois F cinco e o anticorpo monoclonal anti-chiado de camundongo, respectivamente, como mostrado aqui, tanto o anticorpo humano dois F cinco quanto o anticorpo anti-chiado de camundongo ligados à partícula viral divalente adicionam cinco, enquanto não houve ligação ao controle negativo. Uma análise de sangue ocidental de cinco vetores foi usada para confirmar os dados de Eiza, pois o anticorpo humano dois F cinco e o anticorpo anti-chiado de camundongo detectaram bandas específicas em torno de apenas 117 quilodaltons.

No DIVALENTE adicione cinco vírus, que corresponde ao tamanho da proteína Heon cinco. Para avaliar o potencial do vírus construído para contornar a neutralização adicionando cinco positivos, foi realizado um ensaio de neutralização. Os resultados mostram que as unidades luminescentes relativas ou rlu foram 12 vezes maiores quando o controle adicionou cinco vetores foi tratado sem adicionar cinco soro positivo do que quando foi tratado com soro, sugerindo que o vírus foi neutralizado.

Em contraste, houve pouca diferença no uso de R para o vírus AD cinco divalente construído entre as amostras tratadas e não tratadas, sugerindo que o vírus construído escapou da neutralização. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma maior compreensão da abordagem de incorporação do capsídeo do antígeno para adicionar cinco Atualmente, estamos usando essa estratégia em combinação com vetores de sorotipos raros.

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